ech1基因表达下调抑制小鼠肝癌细胞增殖、迁移和粘附能力等的的研究

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1、力和细胞周期等方面的变化，探讨Echl基因的表达对小鼠肝癌细胞生物学行为的影响。3．研究Echl基因表达水平下调后小鼠肝癌细胞株Hca-F细胞中，AnnexiIlA7基因，Cliel基因，Gelsolin基因的表达变化。方法：1：针对Eehl基因设计4个不同靶点的shRNA，分别命名为pGPU6／GFP／Neo·shRNA-Echl·91、pGPU6／GFP／Neo-shRNA-Echl·348、pGPU6／GFP／Neo．shRNA．Echl．430、pGPU6／GFP／Neo．shRNA-Eehl-460，同时设计无关序列阴性对照

2、。构建好的质粒用BamHI酶，PstI酶分别酶切鉴定。并且每组选择两个克隆进行测序鉴定。确定所构建质粒正确无误后，将4个不同靶点的pGPU6／GFP／Neo．shRNA-Eehl表达载体和无关序列阴性对照组分别用阳离子聚合物Sofast转染试剂稳定转染至Hea-F细胞，24小时后荧光显微镜下观察转染效率，用含400I-teCmlG418的完全培养基筛选2l天，获得pGPU6／GFP／Neo．shRNA．Echl表达载体和无关序列阴性对照稳定转染的Hca-F细胞。提取未处理的Hca-F细胞株、稳定转染无关序列的Hca-F细胞株、稳定转染

3、pGPU6／GFP／Neo．shRNA-Echl四个不同靶点表达载体的Hca-F细胞株的RNA和蛋白质，应用qRT-PCR和Westernblot分别在mRNA和蛋白质水平检测干扰Echl基因的表达效应。筛选抑制效果最明显的序列用于后续实验。2：抑制效果最明显的转染pGPU6／GFP／Neo．shRNA．Eehl．91的Hca-F细胞，转染无关序列的阴性对照组Hca-F细胞，正常Hca=F细胞三组细胞，应用CCK8试剂盒检测各组细胞增殖能力的变化；应用体外细胞粘附试剂盒检测各组细胞对细胞外基质的五种组分的粘附能力的变化，并检测各组细胞

4、对体内淋巴结粘附能力的变化；应用Transwell小室检测各组细胞迁移能力和侵袭能力的变化；应用流式细胞仪检测各组细胞细胞周期的变化。3：收集稳定转染pGPU6／GFP／Neo．shRNA．Echl．91的Hca-F细胞，正常Hca-F细胞，冷PBS洗3次后，加入细胞裂解液，提取蛋白并检测蛋白浓度，取各组蛋白50ug上样，Westernblot检测细胞中AnnexinA7基因，Cliel基因及Gelsolin基因表达变化。结果：l：重组质粒经酶切和自动基因测序仪测序，结果均与设计序列完全相符，所含目的基因序列准确无误，表明重组质粒构建

5、成功。qRT．PCR检测结果显示，与正常Hea-F细胞相比，pGPU6／GFP／Neo．shRNA-Echl．91组干扰效率最高为78％，pGPU6／GFP／Neo-shRNA．Echl-430组干扰效率次之为35％。Westernblot检测结果显示，pGPU6／GFP／Neo．shRNA-Echl．91组在蛋白水平干扰效率最高为43％，pGPU6／GFP／Neo-shRNA．Eehl．348组干扰效率为45％。综合qRT-PCR和Westernblot的检测结果，pGPU6／GFP／Necr-shRNA．Eehl．91组抑制效果最

6、明显，为后续实验干扰组细胞。2：CCK8检测细胞增殖能力实验结果显示pGPU61GFP／Neo-shRNA-Echl组细胞增殖OD值明显下降，提示Echl基因表达下调后Hca-F细胞的增殖能力明显下降。对细胞外基质各组分粘附能力的实验结果显示pGPU6／GFP／Neo-shRNA．Eehl组对FN和CollagenI成分的OD值下降，对FN成分的OD值pGPU6／GFP／Neo．shRNA．Eehl组1．01士0．27，无关序列组1．47士0．19，Hca-F组1．42--1：0．26：对CollagenI成分的OD值pGPU6／GF

7、P／Neo．shRNA．Eehl组0．90-a：0．09，无关序列组1．26-2：0．19，Hea-F组1．14士0．07，对其他成分OD值差异无统计学意义(，l>0．05)，提示下调Echl基因后Hea．F细胞对FN和CollagenI成分的粘附能力下降；对体内淋巴结粘附能力实验显示pGPU6／GFP／Neo．shRNA．Eehl组的粘附细胞数细胞明显减少，pGPU6／GFP／Neo-shRNA-Eehl组粘附细胞数为58．3士18．6，无关序列组123．仳15．5，Hea-F组101．7=t=22．8，提示下调Eehl基因后Hca

8、-F细胞的粘附能力下降。对迁移能力实验结果显示pGPU6／GFP／Neo-shRNA-Echl组细胞迁移数明显下降，pGPU6／GFP／Neo．shRNA．Eehl组细胞迁移数为27．1士17．5；无关序列组细胞迁移数为