红曲霉生淀粉酶发酵优化、分离纯化及其酶学性质研究

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityDissertationforMasterDegreeStudiesonfermentationoptimization，purificationandenzymecharacteristicsofraw--starch-·digestingamylasefromMonascusDirectorDisciplinesandSpecialtiesLiuBoFoodScienceResearchFieldFunctionalFoodJune，2014万方数

2、据论文独创性声明～I辽IlUl鲫lIIIIIJl2lWll211711119111本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：融；良加圩年∥月7R关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：

3、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。f剧本论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“4”)研究生签名：浏钆导师签名：匆互必多p互必2口J午年‘月c『El加忤年6月c}El万方数据四川农业大学2011级硕士学位论文摘要生淀粉酶是指能对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。由于生淀粉酶能将未经蒸煮糊化的生

4、淀粉直接转化成葡萄糖等可发酵性糖供微生物生长与代谢，其比传统的高温蒸煮糖化节约25％--30％的能耗。正是由于生淀粉酶具有的潜在的工业应用价值和某些特殊用途，因此一直受到国内外许多研究人员的关注。本课题从生淀粉酶产生菌MonascusM2为出发菌株，通过发酵条件和培养基优化，使菌株的产酶能力进一步提高，对所产的粗酶液进行了分离纯化，并对纯化后酶液的部分酶学性质进行了研究。其主要研究结果如下：(1)对红曲霉M2产生淀粉酶的固态发酵进行了优化。对固态发酵条件优化结果表明：温度为32。C，pH值5．0，无机盐水量为14mL

5、，培养时间8d时，在该条件下可得到红曲霉M2产生淀粉酶的最大酶活：445．37U／g。培养基优化单因素结果表明：最适碳源为乳糖，氮源为州H4)2S04，最适无机盐为K2HP04，进一步通过Box．Bohnken中心组成实验设计和响应面分析，最终确定适宜的培养基条件为：乳糖添加量为1．809、(NH4)2S04添加量为1．409、K2HP04添加量为0．29。预测值为680．29U／g，在以上优化的培养条件下，对实验结果进行验证，得到生淀粉酶酶活为662．21U／g。(2)红曲霉M2固态发酵成熟曲经水浸提、硫酸铵盐析、

6、DEAE．Sepharosefastflow阴离子交换层析、SephacrylS-200凝胶过滤层析等提纯步骤，获得了比酶活396．61U／mg蛋白的生淀粉酶、纯化倍数为6．86、回收率为12．70％。其Tricine—SDS—PAGE呈单一条带。用Tricine—SDS-PAGE测得生淀粉酶的相对分子质量约为67．81kD。(3)对纯化后的红曲霉生淀粉酶进行了酶学性质研究，试验结果表明：最适作用温度为50。C，60℃保温2h仍可以保持近70％的酶活力，最适作用pH为5．0，在pH3．0—7．0的环境条件下保温30m

7、in仍可以保持60％以上的酶活力。以生玉米淀粉为底物的酶动力学常数Km和Vma)【值分别为14．96mg．mlJ和10．79mg·mL～·min～；Mn2+、Ca2+、Ba2+对酶有激活作用，而Na+、K+、M92+、Zn2+对酶基本无影响，Fe3+对酶有强烈的抑制作用。L．半胱氨酸对该酶有促进作用，SDS、DMSO、DTT和B一巯基乙醇对酶活基本无影响，EDTA和EGTA能较弱抑制该酶的酶活力，而PMSF、KMn04、氯胺T和TritonX．100则能强烈抑制生淀粉酶的酶活。万方数据四川农业大学201l级硕士学位论

8、文综上所述，本研究通过固态发酵提高了MonascusM2产生淀粉酶的能力，其所产生的生淀粉酶在实验条件下不仅具有极强的pH稳定性，而且还能适应较宽的pH范围。与此同时大多数金属离子和化学物质对该酶的影响不大，因此具有较高的理论和实用价值。关键词：红曲霉；生淀粉酶；发酵优化；分离纯化；酶学性质Il万方数据四川农业大学2011级硕士学位论文Abst