曲霉菌发酵淀粉酶的分离纯化和生化性质的研究

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1、中国医科大学硕士学位论文曲霉菌发酵淀粉酶的分离纯化和生化性质的研究姓名：梁彬申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张岐山20030401中文摘要前言消化酶制剂是我们日常生活的必备药，主要用于治疗消化不良，慢性胃病，也适合消化功能低下的老年人使用。每年我国对消化酶制剂的需求量很高。消化酶制剂的主要成分为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶。目前，临床上的所有消化酶制剂成分均为从猪、牛、羊等动物胰腺组织的提取物，虽然其来源容易，提取过程简单，但是动物源性的生物材料还要对其进行检疫，防止人畜共患疾病的感染，建立取材动物健康档案执行起来较为困难。使用细菌发酵法生成的酶制备消化酶制剂，国内

2、还没有开展此项技术。本文应用提纯程序从细菌发酵物中纯化其中一种酶～淀粉酶。细菌发酵淀粉酶属于水解酶类，它是由精选的曲霉菌经深层发酵而产生的。淀粉酶是一种常见酶，催化淀粉水解生成糊精和麦芽糖，过度反应可以生成葡萄糖。淀粉酶几乎存在于所有生物体内，对于食物消化具有重要作用。最近Novozymes公司生产的多用于制酒业和制糖业工艺中的微生物发酵淀粉酶制品，纯度低，不能达到医药级水平的纯度。为了将微生物发酵淀粉酶应用到多酶制剂中，需要选择合适的方法对其进行纯化。本文研究从细菌发酵法制成的酶粗品中用简单可行的方法提纯淀粉酶，方法简单，产量及纯度高，适合大规模生产，并且对其生物化学性质进行研究

3、，为后期的生产提供合适的条件。验材料曲霉菌发酵淀粉酶粗品(产地天津)；DEAE—Sephacel，Sepha-dexG75柱，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺(Pharmaciabiotech产品)；NaCl，CaCl2，Na2HPO。，K82P04，啊s—Hcl等为化学纯；淀粉酶试剂盒(上海长征试剂)、牛血清白蛋白(购自北京邦定泰克生物技术公司)实验方法及结果首先用DEAE—Sephacel柱层析对发酵淀粉酶粗品进行分离纯化，盐离子浓度梯度洗脱，获得10个峰，即得到10种组分，通过对10种组分进行淀粉酶活力检测和蛋白质含量分析，选出一种淀粉酶含量高的峰进行进一步纯化。对这一组分进行处理后

4、，继续过SephadexG75层析柱，经盐离子浓度梯度洗脱，并做淀粉酶活力检测和蛋白质含量分析，4个组分中只有一个具有较高的淀粉酶活力。酶活性得率为14．2％。SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其纯度和分子量：电极缓冲液为蹦s—Hcl缓冲液(pH8．3，25mmol／L)，分离胶缓冲液(pH8．8，3mol／L)，浓缩胶缓冲液(pH6．8，0．5mol／L)，考马斯亮蓝R-250染色，结果表明：此高淀粉酶活力组分为单一条带，分子量为57000左右。淀粉酶的Km测定：用pH7．1的PIPES(pH7．1，0．1tool／L)缓冲液配制各种浓度的EPS(0．05、0．1、0．2、0．5、1

5、．0、2．0、2．5mmol／L)，取EPSl60『山与过SephadexG75后的样品4m混合，再加人多功能的0【一葡萄糖苷酶(8KU／L)40l一，混合后用生化自动分析系统于37℃测定其吸光度的变化。延迟时间为120s，读数时间为90s，波长为405nm，常数(F)为5150。用Lineweaver—Burk双倒数作图法计算Km，得到Kin为0．145mmol／L。pH对酶活力的影响：将酶液用不同pH的缓冲液溶解，pH4．9-8．8磷酸氢钾一磷酸二氢钠缓冲液，分别配制酶反应体系，室温下放置30分钟，用常规方法测定酶活力，计算相对酶活性。结果·2·表明酶的最适pH为6．8—7．0

6、。pH稳定性：把酶放在上述不同pH的缓冲液中，4。C过夜，用常规方法测定相对酶活性。结果表明酶在pH5．0—7．O范围内比较稳定，在此范围内活性损失比较小。温度对酶活力的影响：将酶于不同温度(20℃、30℃、40℃、45。C、50℃、60。C、70。E)下测定酶活力。结果表明酶的最适温度为50～60℃。酶的热稳定性：将酶液在30"(2～90。C分别保温lO分钟、30分钟和60分钟，然后按常规方法测定酶活力，以最初的酶活力为100％。结果表明酶在60℃以下非常稳定，保温60分钟酶活力基本不变。温度在70℃以上酶活性丧失较快，80。E保温10分钟酶活性尚有65％左右；而90。C保温10

7、分钟酶活性已经损失了60％；90℃保温30—60分钟酶活性损失90％左右。金属离子和其它化合物对酶活力的影响：将各种化合物配成溶液与酶液混合，在室温放置2小时，然后按常规方法测定酶的活力。实验表明Ca“、Mg“离子有微弱的激活作用，Cu“，co“、Fe2+、Fe3+有轻微的抑制作用，A13+、Pb2+、zn2+有明显的抑制作用。讨论微生物酶的分离纯化历来是酶学研究中最为重要同时也是最棘手的问题，尤其对分子量较大的酶更是如此，现在的微生物酶产品多用于洗涤制品、制酒业和制