玉米zmclca基因克隆及其对氮素吸收的功能验证

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植物遗传资源学报２０１７ꎬ１８(１):１１２￣１１６ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓＤＯＩ:１０.１３４３０/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｇｒ.２０１７.０１.０１４玉米ＺｍＣＬＣａ基因克隆及其对氮素吸收的功能验证１ꎬ２１ꎬ２２１曾廷儒ꎬ张静ꎬ张登峰ꎬ杜金友１２(河北科技师范学院生命科技学院ꎬ昌黎０６６６００ꎻ中国农业科学院作物科学研究所ꎬ北京１０００８１)－摘要:提高玉米的氮素吸收效率具有重要的意义ꎮ鉴于ＣＬＣ蛋白家族具有运输ＮＯ的特性ꎬ本研究通过同源克隆的方３法ꎬ克隆了玉米ＣＬＣ家族基因ＺｍＣＬＣａꎮ该基因所编码的蛋白含有一个电压门控的氯离子通道(ｃｈｌｏｒｉｄｅｃｈａｎｎｅｌ)结构域ꎬ亚－细胞定位结果显示该蛋白位于细胞膜上ꎮ在２００ｍｍｏｌ/Ｌ的ＫＮＯ处理条件下ꎬ拟南芥转基因过表达株系中ＮＯ的含量明显３３高于野生型对照ꎮ因此ꎬＺｍＣＬＣａ基因很可能在玉米的氮素吸收利用过程中具有重要作用ꎮ关键词:玉米ꎻＺｍＣＬＣａꎻ基因克隆ꎻ硝酸盐ꎻ亚细胞定位ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＺｍＣＬＣａＧｅｎｅｉｎＭａｉｚｅａｎｄＩｔｓＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮｉｔｒｏｇｅｎＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎ１ꎬ２１ꎬ２２１ＺＥＮＧＴｉｎｇ￣ｒｕꎬＺＨＡＮＧＪｉｎｇꎬＺＨＡＮＧＤｅｎｇ￣ｆｅｎｇꎬＤＵＪｉｎ￣ｙｏｕ１(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＨｅｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＣｈａｎｇｌｉ０６６６００ꎻ２ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｉｔｈａｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｉｎｍａｉｚｅ.Ｉｎｃｏｎｓｉｄｅｒａ￣－ｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎｏｆＮＯｉｎＣＬＣｐｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌｙꎬｗｅｕｓｅｄｔｈｅｍｅａｎｓｏｆｈｏｍｏｌｏｇｙ￣ｂａｓｅｄ３ｃｌｏｎｉｎｇｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｔｏｃｌｏｎｅｔｈｅＣＬＣｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓＺｍＣＬＣａｏｆｍａｉｚｅ.Ｗｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｈａｄａｖｏｌｔａｇｅ￣ｇａ￣ｔｅｄｃｈｌｏｒｉｎｅｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｏｍａｉｎａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｌｏｃａｔｅｄｏｎ－ｔｈｅｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ.Ｕｎｄｅｒ２００ｍｍｏｌ/ＬＫＮＯｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＮＯｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｏｆ３３ｓｔｒａｉｎｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｗｉｌｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ.ＴｈｅｒｅｆｏｒｅꎬＺｍＣＬＣａｇｅｎｅｌｉｋｅｌｙｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆｍａｉｚｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｍａｉｚｅꎻＺｍＣＬＣａꎻｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇꎻｎｉｔｒａｔｅꎻｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ玉米是我国第一大作物ꎬ也是消耗氮肥最多的１)、ＮＲＴ２(Ｎｉｔｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ２)、ＡＭＴ(Ａｍｍｏｎｉｕｍ作物ꎮ氮素作为植物生长发育所必须的大量元素之ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ)等家族的基因在植物的氮素吸收利用方[１￣３][８￣９]一ꎬ对作物的最终产量贡献在４０％~５０％ꎮ玉面具有重要作用ꎮ近年研究发现ꎬＣＬＣ(Ｃｈｌｏｒｉｄｅ[１０]米在整个生育期中对氮肥的利用率仅为４４％ꎬ大部ｃｈａｎｎｅｌ)家族基因也参与了植物对氮素的吸收ꎮ[４￣６]分氮素均残留在了土壤中ꎮ另外ꎬ过量施用氮世界上第一个ＣＬＣ基因是在电鳐(Ｔｏｒｐｅｄｉｎｉｆｏｒｍｅｓ)肥容易引起土壤板结与酸化、水体的富营养化等环的电器官中克隆获得的ꎬ目前的研究表明ＣＬＣ家族[７][１１]境问题ꎮ因此ꎬ提高氮素的吸收利用效率对于提基因存在于绝大部分动植物中ꎮＣＬＣ家族蛋白高玉米产量、减少环境污染具有重要意义ꎮ通常具有１０~１２个跨膜结构域ꎬ由２个相同的独立[１２￣１３]目前关于植物对氮素吸收利用机制的研究已经亚单位构成ꎮ在植物细胞中ꎬＣＬＣ家族蛋白有取得了一些进展ꎬ研究发现ꎬＮＲＴ１(Ｎｉｔｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ多种生理功能ꎬ比如维持细胞内的离子平衡和质子收稿日期:２０１６￣０３￣０１修回日期:２０１６￣０５￣０９网络出版日期:２０１６￣１２￣１４ＵＲＬ:ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｎｋｉ.ｎｅｔ/ｋｃｍｓ/ｄｅｔａｉｌ/１１.４９９６.Ｓ.２０１６１２１４.１００９.０１４.ｈｔｍｌ基金项目:河北省自然基金(Ｃ２０１２４０７００２)ꎻ转基因重大专项(２０１５ＺＸ０８００３￣００４)第一作者主要从事功能基因挖掘ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｅｎｇｔｉｎｇｒｕ＠１６３.ｃｏｍ通信作者:杜金友ꎬ主要从事作物抗逆育种研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｄｊｉｎｙｏｕ＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ张登峰ꎬ主要从事玉米种质资源研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｄｅｎｇｆｅｎｇ＠ｃａａｓ.ｃｎ １期曾廷儒等:玉米ＺｍＣＬＣａ基因克隆及其对氮素吸收的功能验证１１３梯度、调节气孔的开闭、多种离子在根部的运输等ꎮ接ＺｍＣＬＣａ与ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１双酶切片段并将重组正是具有这些功能ꎬＣＬＣ家族蛋白对于调节植物新连接产物转化大肠杆菌细胞ꎬ提取重组质粒ꎮ将构陈代谢有着不可替代的作用ꎬ而这些生理功能的基建好的ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１载体转化农杆菌ＧＶ３１０１ꎬ利础即为ＣＬＣ家族蛋白能够介导一价阴离子的跨膜用农杆菌蘸花侵染法侵染正常生长至花蕾期的拟南[１０][１９]运输ꎮ最初ꎬ人们认为该家族蛋白作为氯离子通芥ꎮ转基因Ｔ种子经灭菌处理(７５％乙醇１ｍｉｎꎬ０－道只参与Ｃｌ的运输ꎬ之后研究者们通过对拟南芥０􀆰５％次氯酸钠１０ｍｉｎ)并用蒸馏水冲洗３~４遍ꎬ播ＣＬＣａ突变体的研究发现其能够作为一个转运蛋白种于含有草丁膦(ＰＰＴꎬｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ)的ＭＳ培养－＋[１０ꎬ１３￣１４]在液泡膜上介导ＮＯ３和Ｈ的运输ꎮ在该基上ꎬ４℃春化２~３ｄ后转移至光周期１６ｈ光照/实验中ꎬ拟南芥ＣＬＣａ突变体在液泡中积累的硝酸２３℃ꎬ８ｈ黑暗/１８℃ꎬ空气相对湿度５０％~６０％的盐比野生型减少了５０％ꎬ因此该基因在拟南芥吸收培养室中ꎮ１周后将培养基中长出２片绿叶的幼苗[１５￣１６]硝酸盐的过程中起到了主要作用ꎮ另外ꎬＡ.移栽至含有蛭石和营养土１∶１(ｖ/ｖ)的混合基质中ꎮ[１７]Ｎａｋａｍｕｒａ等研究人员通过对水稻ＯｓＣＬＣ￣１和正常条件下培养并收获Ｔ种子ꎮ３ＯｓＣＬＣ￣２的研究ꎬ发现该家族基因在调节植物细胞１􀆰５转ＺｍＣＬＣａ基因拟南芥的功能鉴定渗透压方面能够起到一定作用ꎮ将拟南芥种植在营养土和蛭石(１∶１)混合的红本实验室前期对玉米ＣＬＣ家族基因的研究发色育苗盆里ꎬ置于培养室中培养(２２±２℃)ꎬ每盆４现ꎬＺｍＣＬＣａ能够积极响应硝酸盐浓度的变化ꎮ本株ꎮ正常生长３周的转基因和野生型拟南芥分别进实验通过同源克隆的方法在玉米自交系Ｂ７３中克行ＫＮＯ(２００ｍｍｏｌ/Ｌ)溶液处理和水处理(对照)ꎬ３隆了玉米ＺｍＣＬＣａ基因ꎬ通过亚细胞定位结果显示并分别在处理０ｈ、１ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ、２４ｈ时取样ꎬＺｍＣＬＣａ基因主要在细胞膜上起作用ꎬ通过转基因每个处理取５株ꎬ分为地上和地下两个部分放入液－拟南芥研究结果显示该基因可能在氮素的吸收利用氮中保存ꎬ用于ＲＮＡ提取和ＮＯ含量测定ꎮ３上具有重要作用ꎮ１􀆰６硝酸根含量的测定取适量拟南芥的根或叶片组织ꎬ剪碎加入１０ｍＬ１材料与方法去离子水ꎬ置入沸水中３０ｍｉｎꎬ用滤纸过滤ꎬ反复冲１􀆰１植物材料洗提取液至容量瓶中定容ꎬ重复３次ꎮ取适量样品玉米(ＺｅａｍａｙｓＬ.)自交系Ｂ７３ꎮ拟南芥(Ａｒａｂｉ￣液加入０􀆰４ｍＬ水杨酸－硫酸溶液(５％)ꎬ充分混匀ｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)哥伦比亚生态型(Ｃｏｌ￣０)ꎮ室温放置２０ｍｉｎꎬ再缓慢加入９􀆰５ｍＬ８％的ＮａＯＨ１􀆰２ＺｍＣＬＣａ基因序列分析溶液ꎮ以去离子水为空白对照ꎬ在４１０ｎｍ波长下测利用在线工具ＳＭＡＲＴ进行结构域分析ꎮ通过其ＯＤ值ꎮ每个样品重复３次ꎬ用得到的样品ＯＤ值[２０]Ｃｌｕｓｔａｌｘ和ＭＥＧＡ５􀆰１软件构建ＺｍＣＬＣａ和拟南芥中代入标准曲线得出样品的含氮量ꎮＡｔＣＬＣ家族系统发育树ꎮ１􀆰７转ＺｍＣＬＣａ基因拟南芥在低氮条件下的表型１􀆰３ＺｍＣＬＣａ的亚细胞定位分析根据ＺｍＣＬＣａ序列设计带有ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅤ将转基因和野生型拟南芥种子消毒后分别点在酶切位点的引物(表１)扩增ＺｍＣＬＣａ目的片段ꎬ并含有０􀆰１８ｍｍｏｌ/ＬＫＮＯ的改良霍格兰营养液培养３用ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅤ双酶切目的片段和ｐＧｒｅｅｎ载体ꎬ基中ꎬ置于培养室培养２周后观察表型ꎮ用ＴＤＮＡ连接酶得到ＺｍＣＬＣａ￣ＧＦＰ瞬时表达载体ꎬ４表１实验中所用的引物列表转入ＴＯＰ１０感受态细胞中ꎬＰＣＲ筛选阳性克隆并进Ｔａｂｌｅ１Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ行测序验证ꎮ将验证过的载体用ＰＥＧ渗透法转化引物名称引物序列[１８]玉米原生质体ꎬ在２５℃下培养１６ｈꎮ绿色荧光ＰｒｉｍｅｒｎａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′￣３′)蛋白的信号用激光共聚焦显微镜(ＺｅｉｓｓＬＳＭ７１０)ＧＱ１ＦＣＣＡＴＣＣＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＣＡＧ观察并记录ꎬ激发光设置为４８８ｎｍ和６３３ｎｍꎮＧＱ１ＲＡＡＧＧＡＴＣＧＡＡＧＴＧＣＧＡＧＣＡＧ１􀆰４转ＺｍＣＬＣａ基因拟南芥的获得ＳＬＧＱＦＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧ设计带有ＢｇｌⅡ和ＢｓｔＥⅡ酶切位点的引物(表１)扩ＳＬＧＱＲＴＴＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＴ增ＺｍＣＬＣａ目的片段ꎬ片段连接到克隆载体ｐＺｅｒ￣３３０１￣ＧＱＦＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡｏＢａｃｋ/ＢｌｕｎｔＶｅｃｔｏｒ后进行双酶切ꎮ利用Ｔ４连接酶连３３０１￣ＧＱＲＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＡＧＴＧＴＡＣＴＴＴＣＣ １１４植物遗传资源学报１８卷２结果与分析２􀆰１ＺｍＣＬＣａ基因的克隆前期通过玉米ＣＬＣ基因家族对硝酸盐吸收的研究ꎬ发现ＺｍＣＬＣａ能够积极响应硝酸盐浓度的变化ꎬ在２００ｍｍｏｌ/Ｌ硝酸盐浓度下表达量显著升高ꎬ因此本研究决定进一步克隆该基因ꎮ以玉米自交系Ｂ７３的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增ꎬ得到一条约２４００ｂｐ的片段(图１)ꎮ回收该目的片段并测序ꎬ经过测序验证明确该片段为ＺｍＣＬＣａ基因的编码区全长ꎮ２􀆰２ＺｍＣＬＣａ基因的序列分析用在线工具ＳＭＡＲＴ软件对ＺｍＣＬＣａ进行蛋白图１ＺｍＣＬＣａ基因的克隆Ｆｉｇ.１ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＺｍＣＬＣａｇｅｎｅ结构域的分析发现ꎬＺｍＣＬＣａ基因所编码的蛋白含有１个电压门控氯离子通道(ｖｏｌｔａｇｅ￣ｇａｔｅｄｃｈｌｏｒｉｄｅ相一致的ꎮ用Ｃｌｕｓｔａｌｘ和ＭＥＧＡ５􀆰１软件构建系统ｃｈａｎｎｅｌ)ꎮ其次还有１个ＣＢＳ(ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅｂｅｔａ￣发育树ꎬ将ＺｍＣＬＣａ与拟南芥ＣＬＣ家族基因所编码ｓｙｎｔｈａｓｅ)结构域以及一些其他的结构单元(图２)ꎮ的蛋白序列进行比对ꎬ结果显示该基因与ＡｔＣＬＣａ同－这与其作为运输ＮＯ３的阴离子通道蛋白的功能是源性最高(图３)ꎮ图２ＺｍＣＬＣａ的蛋白结构域分析Ｆｉｇ.２ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｄｏｍａｉｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＺｍＣＬＣａｐｒｏｔｅｉｎ－２􀆰４ＺｍＣＬＣａ基因过量表达对拟南芥中ＮＯ３含量的影响用２００ｍｍｏｌ/Ｌ的ＫＮＯ溶液处理野生型和转基３因拟南芥后ꎬ检测拟南芥叶片和根中硝酸盐的含量(图５ＡꎬＢ)ꎮ从图中可以明显看出ꎬ正常生长３周后不论在转基因拟南芥的叶片还是根中其硝酸盐的含量均高于野生型ꎬ尤其在根中ꎬ转基因拟南芥的硝酸盐含量几乎达到了野生型的３倍ꎮ在２００ｍｍｏｌ/Ｌ的ＫＮＯ３图３ＺｍＣＬＣａ与拟南芥ＣＬＣ家族基因的系统进化树溶液处理２４ｈ后ꎬ虽然野生型和转基因拟南芥根、叶Ｆｉｇ.３ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＺｍＣＬＣａａｎｄＣＬＣｆａｍｉｌｙ中的硝酸盐含量均升高ꎬ但是转基因拟南芥不论叶ｇｅｎｅｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ片还是根中的硝酸盐含量均比野生型的高ꎬ说明－ＺｍＣＬＣａ基因可以促进转基因植株对ＮＯ的吸收ꎮ３２􀆰３ＺｍＣＬＣａ的亚细胞定位２􀆰５低氮条件下转ＺｍＣＬＣａ基因拟南芥的表型鉴定构建一个由３５Ｓ￣Ｏｍｅｇａ作为启动子的Ｚｍ￣将在正常ＭＳ培养基条件下发芽１周的幼苗移ＣＬＣａ￣ＧＦＰ表达载体ꎬ将其转入玉米芽尖原生质体栽至含有０􀆰１８ｍｍｏｌ/Ｌ的ＭＳ培养基上进行培养ꎬ细胞中ꎬ观察其表达部位ꎮ在激光共聚焦显微镜下ꎬ生长２周后ꎬ发现转ＺｍＣＬＣａ基因拟南芥和野生型可以清楚的看到ＺｍＣＬＣａ￣ＧＦＰ融合蛋白在细胞质膜对照叶片逐渐黄化ꎬ但是转基因株系较野生型对照上表达ꎬ而作为对照的ＣＫ(载体中只有ＧＦＰ)ꎬ其发生长迅速ꎬ叶片数目较对照明显增多ꎬ根系也较对照出的绿色荧光充满整个原生质体(图４)ꎮ实验结果发达ꎬ这可能是转基因株系在低氮条件下对氮素的显示ＺｍＣＬＣａ基因所编码的蛋白位于细胞膜上ꎮ吸收和利用效率较高所致(图６)ꎮ １期曾廷儒等:玉米ＺｍＣＬＣａ基因克隆及其对氮素吸收的功能验证１１５图４玉米芽尖原生质体中ＺｍＣＬＣａ的亚细胞定位Ｆｉｇ.４ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＺｍＣＬＣａｉｎｔｈｅｍａｉｚｅｐｌａｓｍａｏｆｓｈｏｏｔＣＷ:正常条件下的野生型拟南芥ꎻＣＴ:正常条件下的转基因拟南芥ꎻＫＷ:ＫＮＯ３处理下的野生型拟南芥ꎻＫＴ:ＫＮＯ３处理下的转基因拟南芥ＣＷ:Ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｕｎｄｅｒｎｏｒｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎꎬＣＴ:ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｕｎｄｅｒｎｏｒｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎꎬＫＷ:Ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｕｎｄｅｒＫＮＯ３ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎬＫＴ:ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｕｎｄｅｒＫＮＯ３ｔｒｅａｔｍｅｎｔ图５ＫＮＯ处理下拟南芥叶片(Ａ)和根(Ｂ)中硝酸盐的含量３Ｆｉｇ􀆰５ＴｈｅｎｉｔｒａｔｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｌｅａｖｅｓ(Ａ)ａｎｄｒｏｏｔｓ(Ｂ)ｕｎｄｅｒＫＮＯｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ３图６ＺｍＣＬＣａ转基因拟南芥(Ａ)和野生型拟南芥(Ｂ)在低氮条件下的表型鉴定Ｆｉｇ􀆰６ＰｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｔｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｏｆＺｍＣＬＣａ(Ａ)ａｎｄｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ(Ｂ)ｉｎｌｏｗｎｉｔｒｏｇｅｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ １１６植物遗传资源学报１８卷[４]王凤格ꎬ田红丽ꎬ赵久然ꎬ等.中国３２８个玉米品种(组合)ＳＳＲ３讨论标记遗传多样性分析[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０１４ꎬ４７(５):８５６￣８６４拟南芥中的７个ＣＬＣ家族基因(ＡｔＣＬＣａ￣ＡｔＣＬＣｇ)[５]李少昆ꎬ王崇桃.我国玉米产量变化及增产因素分析[Ｊ].玉米科学ꎬ２００８ꎬ１６(４):２６￣３０已经被发现并进行了相应的研究ꎬ发现通过过表达[６]巨晓棠ꎬ刘学军ꎬ邹国元ꎬ等.冬小麦/夏玉米轮作体系中氮素ＡｔＣＬＣａ能够使得拟南芥根和芽中的硝酸盐含量增的损失途径分析[Ｊ].中国农业科学ꎬ２００２ꎬ３５(１２):[１０]１４９３￣１４９９加ꎮ通过电生理分析证实:ＡｔＣＬＣａ转运阴离子[７]刘钦普.中国化肥投入区域差异及环境风险分析[Ｊ].中国农－－－－２－业科学ꎬ２０１４ꎬ４７(１８):３５９６￣３６０５的顺序为ＮＯ>Ｉ>Ｂ>Ｃｌ>ＳＯ>ｇｌｕｔａ￣３４[８]ＨｓｕＰＫꎬＴｓａｙＹＦ.ＴｗｏｐｈｌｏｅｍｎｉｔｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓꎬＮＲＴ１.１１－－＋[１０ꎬ１５￣１６]ｍａｔｅꎬ为典型的ＮＯ/Ｈ转运体蛋白ꎮ本３ａｎｄＮＲＴ１.１２ꎬａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｎｇｘｙｌｅｍ￣ｂｏｒｎｅｎｉｔｒａｔｅ研究发现ＺｍＣＬＣａ与ＡｔＣＬＣａ同源性最高ꎬ并且ｔｏｅｎｈａｎｃｅｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌꎬ２０１３ꎬ１６３(２):８４４￣８５６ＺｍＣＬＣａ基因的过量表达可以显著提高转基因拟南[９]ＫａｉｓｅｒＢＮꎬＲａｗａｔＳＲꎬＭＹａｅｅｓｈＳꎬｅｔａｌ.Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆ＋芥对硝酸盐的吸收ꎮａｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＴ￣ＤＮＡ″ｋｎｏｃｋｏｕｔ″ｏｆｔｈｅｈｉｇｈ￣ａｆｆｉｎｉｔｙＮＨ４ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＡｔＡＭＴ１􀆰１[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌꎬ２００２ꎬ１３０(３):氮素对于植物生长发育具有重要作用ꎬ其作为１２６３￣１２７５主要元素参与了蛋白质、核酸等重要物质的合成过[１０]ＤｅＡｎｇｅｌｉＡꎬＭｏｎａｃｈｅｌｌｏＤꎬＥｐｈｒｉｔｉｋｈｉｎｅＧꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｎｉｔｒａｔｅ/ｐｒｏｔｏｎａｎｔｉｐｏｒｔｅｒＡｔＣＬＣａｍｅｄｉａｔｅｓｎｉｔｒａｔｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｐｌａｎｔ程ꎮ土壤中的氮素以硝态氮和铵态氮两种形式存ｖａｃｕｏｌｅｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２００６ꎬ４４２(７１０５):９３９￣９４２在ꎬ在正常通气的土壤中ꎬ硝态氮的浓度大于铵态[１１]ＮｇｕｉｔｒａｇｏｏｌＷꎬＭｉｌｌｅｒＣ􀆰ＵｎｃｏｕｐｌｉｎｇｏｆａＣＬＣＣｌＫ/ＨＣｅｘｃｈａｎｇｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｂｙｐｏｌｙａｔｏｍｉｃａｎｉｏｎｓ[Ｊ].ＪＭｏｌＢｉｏｌꎬ２００６ꎬ３６２(４):氮ꎬ因此提高植物对硝态氮的吸收效率对于植物生６８２￣６９０[２￣３][１２]ＪｅｎｔｓｃｈＴＪꎬＳｔｅｉｎＶꎬＷｅｉｎｒｅｉｃｈＦꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ长具有重要作用ꎮ前人对于拟南芥中ＡｔＣＬＣａ－ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｉｄｅｃｈａｎｎｅｌｓ[Ｊ].ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖꎬ的研究结果表明ꎬ该基因在液泡膜上介导ＮＯ和３２００２ꎬ８２(２):５０３￣５６８Ｈ＋的运输ꎬ能够提高拟南芥对硝酸盐的吸收ꎮ在本[１３]ＪｅｎｔｓｃｈＴＪ􀆰ＣＬＣｃｈｌｏｒｉｄｅｃｈａｎｎｅｌｓａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓꎬｆｒｏｍｇｅｎｅｓｔｏｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ[Ｊ].ＣｒｉｔＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ实验中ꎬ过表达ＺｍＣＬＣａ基因能够提高拟南芥根和ＭｏｌＢｉｏｌꎬ２００８ꎬ４３(１):３￣３６叶中的硝酸盐含量ꎬ这与前人研究结果相一致[１０]ꎮ[１４]ＬｉｓａｌＪꎬＭａｄｕｋｅＭ􀆰Ｐｒｏｔｏｎ￣ｃｏｕｐｌｅｄｇａｔｉｎｇｉｎｃｈｌｏｒｉｄｅｃｈａｎｎｅｌｓ[Ｊ].ＰｈｉｌｏｓＴｒａｎｓＲＳｏｃＬｏｎｄＢＢｉｏｌＳｃｉꎬ２００９ꎬ３６４(１５１４):１８１￣但是ꎬ本研究结果显示ＺｍＣＬＣａ基因所编码的蛋白１８７很可能在细胞膜上起作用ꎬ而拟南芥中ＡｔＣＬＣａ基因[１５]ＧｅｅｌｅｎＤꎬＬｕｒｉｎＣꎬＢｏｕｃｈｅｚＤꎬｅｔａｌ.ＤｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｐｕｔａｔｉｖｅａｎｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｇｅｎｅＡｔＣＬＣ￣ａｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｓｕｇｇｅｓｔｓａｒｏｌｅｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａ￣所编码蛋白在液泡膜上起作用ꎬ这可能与ＡｔＣＬＣ基ｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒａｔｅｃｏｎｔｅｎｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪꎬ２０００ꎬ２１(３):２５９￣２６７因家族在不同物种中进化过程有关[２１￣２２]ꎮ[１６]ＭｏｎａｃｈｅｌｌｏＤꎬＡｌｌｏｔＭꎬＯｌｉｖａＳꎬｅｔａｌ.ＴｗｏａｎｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓＡｔＣｌＣａａｎｄＡｔＣｌＣｅｆｕｌｆｉｌｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇｂｕｔｎｏｔｒｅｄｕｎｄａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｎｉｔｒａｔｅ在低氮的培养基上ꎬ过表达ＺｍＣＬＣａ转基因拟南ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｓ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌꎬ２００９ꎬ１８３(１):８８￣９４芥明显比野生型长势好ꎬ推测可能是由于ＺｍＣＬＣａ基[１７]ＮａｋａｍｕｒａＡꎬＦｕｋｕｄａＡꎬＳａｋａｉＳꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇꎬｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｐｕｔａｔｉｖｅｖａｃｕ￣因可以促进拟南芥对硝酸盐的吸收ꎬ这对于农业生产ｏｌａｒｖｏｌｔａｇｅ￣ｇａｔｅｄｃｈｌｏｒｉｄｅｃｈａｎｎｅｌｓｉｎｒｉｃｅ(ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ.)具有重要的价值ꎮ对于ＺｍＣＬＣａ基因在积累硝酸盐[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌꎬ２００６ꎬ４７(１):３２￣４２[１８]ＬｕＭꎬＹｉｎｇＳꎬＺｈａｎｇＤＦꎬｅｔａｌ.Ａｍａｉｚｅｓｔｒｅｓｓ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅＮＡＣ过程中的机制以及玉米ＣＬＣ家族其他基因在氮素吸ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬＺｍＳＮＡＣ１ꎬｃｏｎｆｅｒｓｅｎｈａｎｃｅｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏ收利用过程中的具体作用还需进一步研究ꎮＣＬＣ家ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐꎬ２０１２ꎬ３１(９):１７０１￣１７１１族成员广泛存在于各种作物中ꎬ除了具有吸收硝酸盐[１９]宋仲戬ꎬ张登峰ꎬ李永祥ꎬ等.玉米分子伴侣基因ＺｍＢｉＰ１的表[１７ꎬ２３]的功能之外ꎬ还能够起到耐盐、抗旱等作用ꎮ达模式和功能研究[Ｊ].植物遗传资源学报ꎬ２０１５ꎬ１６(３):５７６￣５８０综上所述ꎬＣＬＣ家族基因ＺｍＣＬＣａ很可能在玉米[２０]ＣａｔａｌｄｏＤＡꎬＨａｒｏｏｎＭꎬＳｃｈｒａｄｅｒＬＥꎬｅｔａｌ.Ｒａｐｉｄｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ细胞膜上发挥作用ꎬ使植物体内积累较高浓度的硝酸ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒａｔｅｉｎｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓｂｙｎｉｔｒａｔｉｏｎｏｆｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ[Ｊ].ＣｏｍｍｕｎＳｏｉｌＳｃｉＰｌａｎｔＡｎａｌꎬ１９７５ꎬ６(１):７１￣８０盐ꎬ为植物生长发育提供了大量的氮素ꎮ因此ꎬ该基[２１]ＨｅｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒＭꎬＳｃｈｗａｐｐａｃｈＢꎬＦｉｓｃｈｅｒＷＮꎬｅｔａｌ.Ａｆａｍｉｌｙ因可能对于提高玉米氮素利用效率具有重要作用ꎮｏｆｐｕｔａｔｉｖｅｃｈｌｏｒｉｄｅｃｈａｎｎｅｌｓｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆａｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｗｉｔｈａＣＬＣｇｅｎｅｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ[Ｊ].ＪＢｉｏｌＣｈｅｍꎬ１９９６ꎬ２７１(５２):３３６３２￣３３６３８参考文献[２２]ＭａｒｍａｇｎｅＡꎬＶｉｎａｕｇｅｒ￣ＤｏｕａｒｄＭꎬＭｏｎａｃｈｅｌｌｏＤꎬｅｔａｌ.Ｔｗｏｍｅｍｂｅｒｓ[１]ＭｉｌｌｅｒＣꎬＷｈｉｔｅＭＭ.Ｄｉｍｅｒｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｓｉｎｇｌｅｃｈｌｏｒｉｄｅｃｈａｎ￣ｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＣＬＣ(ｃｈｌｏｒｉｄｅｃｈａｎｎｅｌ)ｆａｍｉｌｙꎬＡｔＣＬＣｅａｎｄｎｅｌｓｆｒｏｍＴｏｒｐｅｄｏｅｌｅｃｔｒｏｐｌａｘ[Ｊ].ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡꎬＡｔＣＬＣｆꎬａｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｙｌａｋｏｉｄａｎｄＧｏｌｇｉｍｅｍｂｒａｎｅｓꎬ１９８４ꎬ８１(９):２７７２￣２７７５ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ[Ｊ].ＪＥｘｐＢｏｔꎬ２００７ꎬ５８(１２):３３８５￣３３９３[２]吴巍ꎬ赵军.植物对氮素吸收利用的研究进展[Ｊ].中国农学[２３]ＬｉＷＹＦꎬＷｏｎｇＦＬꎬＴｓａｉＳＮꎬｅｔａｌ.Ｔｏｎｏｐｌａｓｔ￣ｌｏｃａｔｅｄＧｍＣＬＣ１通报ꎬ２０１０ꎬ２６(１３):７５￣７８ａｎｄＧｍＮＨＸ１ｆｒｏｍｓｏｙｂｅａｎｅｎｈａｎｃｅＮａＣｌｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ[３]王宇通ꎬ邵新庆ꎬ黄欣颖ꎬ等.植物根系氮吸收过程的研究进ｂｒｉｇｈｔｙｅｌｌｏｗ(ｂｙ)￣２ｃｅｌｌ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＥｎｖｉｒｏｎꎬ２００６ꎬ２９(６):展[Ｊ].草业科学ꎬ２０１０ꎬ２７(７):１０５￣１１１１１２２￣１１３７