拟南芥氮素营养相关基因的图位克隆及其初步功能验证

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万方数据分类号：盘"I【1箩jUDC：锄5。：密级：单位代码：10798拟南芥氮素营养相关基因的图位克隆及其初步功能验证Map--basedCloningofArabidopsisNNutritionGenesandPreliminary量。UnctJonalVerlllcatlonn·●_f’∽■二级学科：作物遗传育种研究方向：分子遗传育种研究生：麻艳超指导教师：东方阳教授徐江研究员所在院所：生命科技学院2014年6月 万方数据独创性声明lIIitlIIIIIIIIIIIIIIIIlY2762076本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇鱼越竖整堂瞳或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：季衣手互殛签字日期：晰年∥月J尸日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑苎垦趑堙整堂睦有关保留、使用学位论文的规定。特授权塑兰垦越堙堇堂睦可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名徘憋签字日期．彻午年‘月垆 万方数据缩略词英文缩写英文全称中文名称K旺’NRNiRGS／GOGATGSGOGATASCPSaseRFLPPCRRAPDDAFSSRSSLPISSRSTSSCARAminoAcidTransporterNitrateReductaseNitriteTeductaseGlutamineSynthetase／GlutamateSynthasePathwayGlutamineSynthetaseGlutamateSynthaseAsparagineSynthetaseCarbamylPhosphataseRestrictionFragmentLengthPolymorphismPolymeraseChainReactionRandomAmplifiedPolymorphicDNAAmplifiedFingerprintsSimpleSequenceRepeatsSimpleSequenceLengthPolymorphismInter-simpleSequenceRepeatSequenceTaggedSiteSequenceSharacterizedAmplifiedRegion氨基酸转运体硝酸还原酶亚硝酸还原酶谷氨酰胺合成酶／谷氨酸合成酶途径谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶天冬酰胺合成酶氨甲酰磷酸酶限制性长度多态性聚合酶链反应随机扩增多态性DNA分子标记DNA扩增指纹简单序列片段简单序列长度多态性简单序列重复间区序列标签位点序列特征化扩增区域cAPscleavedAmplifiedP。lYmorpllic酶切扩增多态性序列CS曰母训珂瑁多念1王t}予少USequenceDeftvedCleavedAmplifiedPolymorphic衍生的酶切扩增多态性dcAPss．equence序列厂r岁USNPSingleNucleotidePolymorphism单核苷酸多态性AS—PCRAllele．SpecificPCR等位基因特异性PCR 万方数据摘要氮素是植物生长发育所必需的矿质元素之一，同时是影响农作物产量的主要因素之一。随着氮素资源和环境问题日益严峻，利用转基因技术提高作物的氮素利用效率具有重要的理论和应用价值。本研究以由EMS诱变拟南芥C01．0生态型背景材料获得的两株耐低氮突变体Int3和Int5为材料，利用基因图位克隆的方法，筛选到与拟南芥氮素营养相关的重要基因。利用Int3突变体材料成功克隆到TT8基因，在拟南芥中，m基因的表达产物为TT8蛋白，该蛋白属于碱性螺旋．环一螺旋(basic．helix—loop．helixdomain．bHLH)转录因子。在Int3突变体中，m基因外显子上的第760个碱基由C突变为T，导致编码氨基酸的密码子由CAA突变为终止密码子UAA，氨基酸翻译提前终止，基因发生无义突变；通过对Int5突变体氮素相关基因图位克隆，最终将目的基因定位于SSLP分子标记5-5654与5-5443两个分子标记之间，标记之间距离为21lkb，跨越了MKPll、F2K13和F5E19共3个BAC重叠克隆群。本研究还开发了21对SSLP分子标记和两对CAPS分子标记，同时改进了根据SNP位点等位基因差异设计分子标记的方法，为基因检测和图位克隆提供更丰富的分子标记资源，节省研究时间，提高克隆效率。目前，丁髓基因研究表明该基因主要调节类黄酮次级代谢产物的合成途径，但在氮素代谢调节方面还没有充足的相关报道。本研究通过Int3突变体在低氮胁迫下的表型鉴定，根据突变体地上部及地下部氮素含量的测定结果和突变体对氮素的吸收非损伤微测结果，推测TT8转录因子参与了氮素代谢的调控过程；结合Int5突变体在低氮条件下的表型鉴定结果和地上部及地下部氮素含量测定结果以及对氮素吸收的非损伤微测结果表明，该基因在植株的氮素吸收过程中发挥作用；最终，本研究为今后更深一步研究氮代谢相关机理以及通过转基因技术提高作物的氮素利用效率奠定了良好的基础。关键词：拟南芥；氮素营养；基因克隆；功能鉴定II 万方数据ABSTRACTNitrogen(Misoneofthenecessarilymineralelementsforplantgrowthanddevelopmentaswellasadominicaleffectfactoroncropproductivity．AstheproblemofNresourceandenvironmenthasbeenincreasinglysevere，itisgreattheoreticalandapplicablevalueforincreasingNutilizationefficiencythroughtransgenictechnique．111t11iSstudy,twomutantsresistanttoNdeficient．Int3and伽巧formArabidopsisthalianaCol一0mutatedbyEMSwereusedasmaterialstoidentifyimportantgenesrelatedtoNnutritionwimmap-basedcloningtechnique．刀召geneWasclonedwimInt3mutant．ThegenetranslationproteinproductisTT8，whichbelongstobasic-helix—loop-helixdomain(bHLH)transcriptionfactors．IntheInt3，the760mbaseof册exonWasmutatedfromCtoT-whichleadstononsensemutationcausedbygeneticcodon“CAA”changingintostopcodon．FormutantInt5，thelocationofcandidategenewasnarrowedbetweenSSLPmolecularmarker5-5654and5-5443，whichWas21lkbandoverlap3BACContigs，suchasMKPl1，F2K13andF5E19．Duringthecloning，21pairsofSSLP,1pairofCAPsand2pairsofSNPmolecularmarkersweredevelopedandaPCR-·basedAS·-PCRmethodwasmodifiedandoptimized，theseenrichedthemolecularmarkerresourceformap·basedcloning，savedagreatdealoftimeandimprovedcloningefficiency．Thecurrentresearchabout刀召mainlyfocusedonflavonoidbiosynthesispathway,whilethereislittleprogressonitsroleinmgulationofNmetabolism．Inthisstudy,transcriptionfactorTT8wassuggestedtobeinvolvedintheregulationofNmetabolismthroughanalysisofInt3mutant’SphenotypeunderstressofNdeficient，Ncontentinrootandshoot，andNabsorptionresultsbyusingnon·invasivemicro-testtechnique(NMT)．Atthesametime，consideringNMTresultsandthephenotypeunderstressofNdeficient．thegeneInt5wouldplayacriticalroleinNuptake．ThefunctionalanalysisofbothgenesshouldlayasolidfoundationforfurtherstudiesofNutilizationmechanisminplantandapplicationoftransgenictechniquetoimproveproductivityoncrops．Keywords：Arabidopsis；nitrogennutrition；geneclone；functionalverificationIII 万方数据目录缩略词⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一IIABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．III第一章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1拟南芥简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2植物体内的氮素营养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．3植物对氮素吸收、同化和再利用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．3．1植物对氮素的吸收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．3．2植物对氮素的同化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3．3植物对氮素的再利用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．4基因定位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．81．4．1遗传标记方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．4．2分子标记方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．4．3基因克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．121．5研究目的及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14第二章突变体表型鉴定及遗传背景纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．1材料与试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．1．1研究材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．1．2常用仪器与设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．1．3常用试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．2研究方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l72．2．1拟南芥种植⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2．2拟南芥杂交⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．182．2．3种子收获⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．4突变体表型鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．5突变体遗传背景纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．6基因遗传分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．3研究结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19 万方数据2．3．1突变体表型鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．3．2突变基因遗传分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．4结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．4．1结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．222．4．2讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一22第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．1研究材料与试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．1．1研究材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．1．2常用仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．13研究试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．243．2研究方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2．1基因定位研究方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．243．2．2候选基因测序方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．273．2．3生理数据测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．273．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．3．1SSLP标记多态性鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．3．2Fl代杂交结果鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．283．3．3突变基因定位结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．293．3．4分子标记开发结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363．3．5生理研究结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363．4结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．4．1结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．383．4．2讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41发表论文和参加科研情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．49致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一50 万方数据第一章文献综述1．1拟南芥简介拟南芥是双子叶十字花科植物，是芥菜家族的一员。拟南芥不是具有主要农艺意义的植物，但是在植物分子生物学和遗传学研究中是最受欢迎的模式生物【11。拟南芥作为模式生物，具有非常重要的优势。第一，拟南芥生长分布广泛【2】，在亚洲、欧洲、非洲、北美洲和澳洲等地均分布着拟南芥，并且我国多个省市如内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等地区也有分布。第二，植株形态个体d,t31，成熟植株株高一般为15．30cm左右，可以在生长室、生长箱、温室、窗臂架和室外等多种环境中生长，并且对生长环境要求不严格，便于培养种植。第三，生长周期短【4。5】，从种子春化开始到收到第一批角果需要约6—8周时间，同时种子小且量大，每株植株可以收获上千粒种子。第四，基因组小[61，单倍体植株基因组中有5条染色体，单倍体染色体组总长约为7000万个碱基对，是目前己知的高等植物中基因组最小的植物。第五，拟南芥的授粉方式为自花授粉17】，基因纯合度高，受到物理因素、化学因素、生物因素或其他诱变手段进行诱交时容易产生多种突变，便于基因克隆、文库筛选和功能验证等分子水平上的研究。由此，拟南芥在基因工程和作物遗传改良上成为重要的研究工具。同时。2000年12月拟南芥全基因组序列测序工作完成【8】，这就为逆境胁迫响应功能基因(如低氮胁迫响应基因)的图位克隆在拟南芥中的应用提供了便利条件。1．2植物体内的氮素营养氮素是植物生长发育所必需的矿质元素之一，构成蛋白质、氨基酸、叶绿素等物质的重要成分[91。植物的生长发育，如根的构型【101、叶片发育‘111、种子休眠[121和植物开花㈣等都显著受到氮素供应的影响。氮素在植物体干物重中占的比例接近2％，是作物从土壤中吸收量最多的元素，同时也是除了水以外对作物 万方数据第一章文献综述生长发育影响最重要的元素。氮素是构成蛋白质的基本元素。氨基酸是构成蛋白质的基本结构单位，每个氨基酸都含有一个氨基和一个羧基。在形成蛋白质过程中，无机氮素首先被植物的根吸收，在体内被同化为谷氨酸，再有谷氨酸转化为其他氨基酸，经过氨基和羧基的脱水缩合，折叠修饰作用后构成蛋白质。植物体内还含有游离氨基酸，这部分氨基酸不构成蛋白质，在机体内以游离状态存在。氮素是核酸的重要成分。核酸是生命的遗传物质，由核苷酸构成，每个核苷酸包含有一分子核糖，一分子含氮碱基和一分子磷酸基团构成。氮素存在于嘌呤和嘧啶碱基中，占核酸的的15％一16％。核酸是植物生长发育和生命活动的物质基础，遗传信息从DNA转录到RNA，再有RNA传递给蛋白质，完成基因表达，调控生命正常活动。氮素是光合色素的重要组成成分。植物在叶绿体上进行光合作用，机体通过光合作用将外界无机物变为有机物，为机体的生命活动储存物质积累并提供能量。氮素是叶绿素和叶绿体的重要组成成分，叶绿素a和叶绿素b中均含有氮素，从而氮素直接或者间接影响植物体的光合作用。当氮素供应不足时，植物叶片会变黄，光合作用减弱，产物减少，从而导致作物产量显著降低。氮素还是酶的主要组成元素，酶几乎参与机体所有生命活动，在各种代谢活动和生化过程中起到催化的作用。机体内大部分酶的本质是蛋白质，氮素是构成蛋白质的基础物质，因此氮素在生物体的代谢活动中发挥重要作物，从而直接或间接影响植物的生长发育。氮素还参与其他物质，如维生素类物质和体内生物碱的合成。维生素在调节机体组织活动中发挥重要的作用。如植物体内的生物氧化过程需要许多氧化还原酶、黄酶的辅酶或辅基，维生素B2通过与蛋白质相结合，成为这些黄素蛋白，在氧化过程中发挥作用。因此，在植物生长发育过程中，氮素是非常重要的矿质元素。氮素不仅是生命物质的重要组成元素，同时硝酸盐在信号通路中也发挥重要的功能。大量的研究证明，硝酸盐参与信号响应，并调节基因转录【14】，植物细胞通过迅速的感知硝酸盐，启动硝酸盐信号通路，从而调节基因的表达和响应器官代谢活动[15-16】。近年来，由于不合理的施用氮肥造成了日益严峻的氮素资源和环境问题。缺氮会限制农作物的产量；而氮肥施用过量则不仅造成资源浪费，而且还会引 万方数据第一章文献综述起环境污染，同时过多或过少的氮肥都会对农作物的产量和品质造成不良影响。因此，研究作物氮代谢的机理，提高作物对氮肥的吸收、利用效率具有重要的理论和应用价值。1-3植物对氮素吸收、同化和再利用1．3．1植物对氮素的吸收土壤中的氮素含量常常受到如降雨、气温、风、土壤类型和PH等因素的影响发生变化，因此对土壤环境的适应性是影响植物吸收氮素的一个重要因素。N03’和M矿是植物根系从土壤中吸收的无机氮素形式。由于具有毒性，铵首先被根同化，然后再以有机形式运输到地上部分。相反，硝酸盐可被同化为铵，再在根或茎中合成氨基酸。一般来说，适应低PH的成熟植物倾向于吸收铵和氨基酸，而适应高PH的植株倾向于吸收硝酸盐【17】。植物是对氮素的吸收呈季节性和昼夜波动，以此保障植物持续正常的生长和发育【1引。植物根系对氮素吸收与对其它矿质离子吸收相似，氮素从土壤溶液进入植株根部表观自由空间，其后透过质膜进入细胞内部。植物从外界环境获取氮素主要通过3条途径：(1)直接吸收土壤中的铵或有机氮；(2)通过硝酸还原酶还原无机氮转化为植物可直接利用的有机氮；(3)通过固氮菌对N2的固氮作用【l91。植物根是吸收硝酸盐的主要器官。植物进行硝酸盐吸收时，为了将硝酸盐转运到地上部，硝酸盐需要在根的木质部进行装载。在拟南芥的根中由外到里存在4层细胞：表皮、皮层、内皮层和中柱鞘。表皮含有凯氏带，限制质体外水和离子的扩散。离子首先到达木质部周围，穿过质膜进入木质部，在木质部装载，之后再进行长距离运输【201。植物体内有两套转运机制配合根对从土壤中吸收硝酸盐并转运到整个植株机体中i21,22】。通过电生理试验和分子试验研究表明，高亲和与低亲和的硝酸盐吸收是由质子／硝酸盐转运体介导的[23-251。根据植物吸收系统对硝酸盐的亲和性，分为低亲和转运系统(Low-affinitytransportsystem，LATS)和高亲和转运系统(High-affinityTransportSystems，HATS)，前者由NRTl基因介导，后者由NRT2介导。NRTl家族中包括53个成员，其中51个基因在植物体的不同组织中表达【26J，这就表明一些成员发挥着特殊的功能作用。在拟南芥NRTl家族中，AtNRTl．J『 万方数据第一章文献综述(最初称为Chll)是最先被发现和分离的成员【2¨，在根尖表皮细胞和成熟区的皮层和内皮层中均表达，具有双亲和性【28．29】；AtNRTl．2只在根表皮表达，并属于ATSf30l。一旦根吸收硝酸盐后，就会通过几层细胞膜被转运到各个组织中。AtNRTl．5位于接近木质部的根中柱鞘细胞膜上，参与硝酸盐从地下部到地上部的转运【3¨。AtNRTl．4基因只在叶柄处表达，并且突变体叶柄中硝酸盐的含量只有野生型的一半13引。AtNRTl．6基因在长角果的微管组织中表达，可能参与硝酸盐从成熟组织到发育中的种子运送[331。还有一类NRTl家族成员不仅可以转运硝酸盐还可以转运二肽或三肽。当硝酸盐浓度较低时，高亲和性转运系统(HATS)对硝酸盐的吸收发挥作用，由NRT2家族介导完成。NRT2家族所有成员的研究还有待加深，拟南芥NRT2家族有7个成员，AtNRT2．J是拟南芥HATS家族中的重要成员，其与NAR2蛋白互作发挥功能【34】；AtNRT2．7主要参与硝酸盐在角果中的转运和储存【35|。植物根从土壤中吸收氮素的另一种主要氮源是铵态氮。根据PH依赖性和电生理学方法对不带电的NH3和带电荷的NH4+的研究表明，在所有的生理条件下，离子是参与膜转运的主要物质形式【361。植物体通过铵盐转运蛋白(Ammoniumtransporters，AMT)直接从外界吸收铵盐。植物也有两套铵盐吸收系统：高亲和吸收系统(HATS)和低亲和吸收系统(LATS)。在拟南芥中，彳脲族中有6个成员，分为爿M丌和AMT2，其中AMTl有5个成员，AMT2有一个成员1371。AtAMTl．，基因在根部的表达首先发生在根冠，然后是侧根和主根，这种表达顺序与根部的结构以及感受N素饥饿的顺序是一致的，同时与基因在叶部表达受抑制也是一致的139J。AtAMTl．2同时在叶部和根部表达，根部是叶部的5倍且在根部独立负责N素的供应【40J；AtAMTl．3同时在叶部和根部表达，根部表达是叶部的10倍[4l】；4“．伽．5表达水平较低[421。通过利用T-DNA插入突变体对AtA^打家族成员研究表明，4纠肘丌．门铂彳纠M丌．3转运铵态氮的能力相似，参与转运量约为30-35％，而AtAMTl．2转运能力较低为18-25％【43|。AtAMT2．，同时在叶部和根部均表达，但在叶部表达水平高于根部，并且可以独立负责叶部N素的供应H4]。水稻的彳臁族中有10个成员【38】，包括3个OsAMTI，3个OsAMT2，3个OsAMT3和1个OsAMT4[45J基因。Kumarl46J在研究不同N水平OsAMTl在根中表达量的影响时，发现在72h内OsAMTl．J表达量水平以及高亲和NH4+的流入量降低了6倍左右，同时O“』忉．2和G叫』倒．3的表达量水平分别降低了3．6币D1．6倍；此外，m爿』岍20在根、茎中是组成型表达，发挥重要的作用。4 万方数据第一章文献综述通过对植物根的正向和反向遗传学的研究表明，根还参与了氨基酸的吸收[47-481。氨基酸的吸收由氨基酸转运体家族A(mmoniumtransporters，ATF)完成，其中LHTl属于ATF家族，在根对氨基酸的吸收中发挥了重要作用；当外部离子浓度较高时，AAPl(Aminoacidpermeasel)蛋白会参与不带电的氨基酸的转运[49】。氮素在植物生长发育以及农业生产中都是不可替代的元素，对于其吸收机理的研究虽然取得了一定的成就，但仍处于起步阶段，对水稻中的10个OsAMT基因研究中仍有6个基因发挥的具体功能是未知的，而拟南芥的6伽tA臁因中也只彻叫M玎家族中的3个基因研究得较多。因此，对氮素吸收分子机理的深入研究以及对这些基因的表达调控及功能作用仍需要进行更深一步的研究。1．3．2植物对氮素的同化高等植物从土壤中吸收硝酸盐和铵盐后，将硝酸盐消化为铵盐，之后铵盐再被同化为各种氨基酸。硝酸盐的同化在地上部和地下部可以同时发生，但是在细胞质和细胞器基质中硝酸盐的同化是分开的。在根或茎中硝酸盐的同化的进行取决于外界因素，如植物物种、外部硝酸盐浓度、温度和光强度等因素【50I。例如，当外界光强足够时，叶片同化硝酸盐所用的能量低于根同化硝酸盐所需能量。在胞质中，硝酸在硝酸还原酶(Nitritereductase，NR)的作用还原成亚硝酸盐【5¨，其中，NR是一个复合酶，由血红素铁和钼辅因子构成，也存在于玉米和大麦中。亚硝酸盐生成后，在亚硝酸还原酶(Nitritereductase，NiR)的作用下还原为铵盐。由硝酸盐还原后形成的铵盐以及通过光呼吸或氨基酸再回收形成的铵盐都会进入谷氨酰胺合成酶／谷氨酰胺．2．酮戊二酸氨基转移酶途径(Glutaminesynthetase／glutamine．2．oxoglutarateaminotransferasepathway,GS／GOGAT)，从而被进一步同化152’53J。谷氨酰胺合成酶(GS)将铵盐固定到谷氨酸分子上，铵盐被同化为谷氨酰胺，随后谷氨酰胺在在谷氨酰胺．2．酮戊二酸氨基转移酶(Glutamine一2一oxoglutarateaminotransfcrase，GOGAT)的作用下生成两分子的谷氨酸盐。研究证明，玉米种也含有谷氨酰胺合成酶(GS)1541。GS有GSl(Glutaminesynthetaseisoenzyme1，GS1)和GS2(glutaminesynthetase2isoenzyme，GS2)两种同工酶，GSl由多个基因编码不同的多肽，主要存在于植物根、种子和茎的韧皮部中，与机体内氮化合物的合成与运输有关；GS2由单基因编码，主要存 万方数据第一章文献综述在于叶片中，可以同化铵盐形成谷氨酰胺。在植物机体中，GOGAT主要以两种形式存在：第一类为NADH．GOGAT，以NADH作为电子供体，主要存在于非光合组织中；第二类为Fd．GOGAT，以铁氧还蛋白作为供体。叶片中主要是Fd．GOGAT发挥作用，参与光合作用和光呼吸过程。II⋯n⋯'．|n1l-d1,-4'。●¨．”一h一¨tI^¨_·⋯J⋯jh～⋯i。⋯⋯n。p。『tir·h⋯。⋯n⋯lD萄⋯uf，———————————--‘“∞⋯N(GuohuaXu．2012)图1_1根从土壤中吸收的氮源主要是铵态氮和硝态氮，图示为根对氦素的吸收，同化的再利用过程Fig．1-1SchematicroutesofNuptakefromtherhizosphereincludingthesourceoffertilizerNtobeacquired，mainlyintheformofammoniumandnitratebyroots，transportationandassimilation，andremobilizationinsidetheplant注：箭头的粗细表示植物体内氮和糖的相对量。缩写表：AMT，铵离子转运体；AS，天冬酰胺合成酶：Asn，天冬酰胺：Asp．天冬氨酸：GDH，谷氨酸脱氢酶：Gln，谷氨酰胺：Glu谷氨酸：GOGAT．谷氨酸合成酶；GS，谷氨酰胺合成酶：NAC．AT，NAC家族转录因子：NiR，亚硝酸还原酶，NR，硝酸还原酶：NRT，硝酸转运体。Note：Thethicknessesofthearrowsschematicallyrepresenttherelativeamountsofnitrogenandsugarinsidetheplant．Abbreviations：AMT,ammoniumtransporter；AS，asparaginesynthetase；Asn，asparagine；Asp，aspartate；GDH，glutamatedehydrogenase；Gln，glutamine；Glu，glutamate；GOGAT,glutamine-2-oxoglutarateaminotransferase；GS，glutaminesynthetase；NAC-TF，certaintranscriptionfactorsbelongingtotheNACfamily；NiR,nitritereductase；NR，nitratereductase；NRT,nitratetransporter．除了GS／GOGAT循环，还有3种酶参与了铵盐的同化，即天冬酰胺合成酶(Asparaginesynthetase，AS)、氨甲酰合成酶(Carbamoylphosphatesynthase，CPSase)矛11谷氨酸脱氢酶(Glutamatedehydrogenase，GDH)。天冬酰胺合成酶(AS)6 万方数据第一章文献综述依赖ATP将谷氨酸盐同化为谷氨酸和天冬酰胺【55】，在拟南芥中，3种基因参与编码AS，即爿5m，ASN2和ASN3。氨甲酰磷酸酶(Carbamoylphosphatesynthase，CPSase)可以参与形成瓜氨酸和精氨酸的前体物质氨甲酰。谷氨酸脱氢酶(GDH)在高浓度铵盐胁迫条件下也可以将铵转化为谷氨酸，不过，GDH在细胞中的主要活性是催化谷氨酸脱氨反应156|。1．3．3植物对氮素的再利用植物体具有再利用氮素的能力，氮素以硝酸盐和铵盐的形式被根吸收，随后被同化为氨基酸，用于合成蛋白质后，将进一步被不同的生活途径利用。通常氮素的再活化往往发生在植物衰老的组织。Gallais[571通过测定几种植物不同器官氮素总量来研究氮素的再利用，结果表明植物体叶片中的蛋白质，特别是光合质体中的蛋白质在衰老过程中会被广泛的降解，主要用途是为新形成的器官(如新叶和种子)提供足够的氮素营养成分。在植物衰老过程中，叶绿体是氮素的主要来源，而Rubisco是氮再利用的主要来源。在拟南芥和油菜中，氮素可以重新活化，氮素可以从衰老的叶子中转移到处于营养期的叶子以及处于繁殖期的种子中【5驯；在水稻中，成熟衰老的叶片可以为稻穗顶端的新叶提供将近64％的氮素。在拟南芥器官生长的早期和后期衰老阶段，氮素从莲座叶片转移到花器官和种子的速率相似[59J，同时，拟南芥的营养生长阶段和衰老阶段很容易被区分开，这就表明氮素的再分配迁移率和处于营养阶段的衰老的叶子相关联【6⋯。氮素的再利用也受环境中氮素供应的影响。在作物中，灌浆期是一个很重要阶段，在植物成熟期和籽粒填充期，氮素的吸收和固定均会速率下降【6¨。在籽粒灌浆期，氮素的供应普遍不能满足种子对氮素的大量需求，这就需要不同器官相继给种子提供氮素162J。研究表明，玉米、小麦和水稻中叶子中N的再活化存在差异，随物种不同而变化163|。植物对氮素的吸收、同化和再分配过程保证机体的正常运行畔J(如图1．1)。在当前农业实践中，加强作物品种对氮素限制的适应性显得尤为重要，提高氮Hv,平U用率，可以有效地控制已经造成的严重的但污染，同时可以节约作物生产成本。因此，利用分子手段完善耐低氮作物的品种改良，对于提高作物产量是至关重要的。 万方数据第一章文献综述1．4基因定位1．4．1遗传标记方法遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。在现代分子育种研究中，遗传标记的发展是由最初的形态标记、细胞学标记、蛋白质标记，到现在成为基因定位和辅助选择的主要手段的DNA分子标记【651。形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异，典型的形态标记用肉眼即可识别和观察；细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征，染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性；作为遗传标记的蛋白质通常可分为酶蛋白质和非酶蛋白质二种，在非酶蛋白质中，用得较多的是种子贮藏蛋白，同时可以根据电泳谱带的不同来显示酶蛋白在遗传上的多态性：DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映166]。1．4．2分子标记方法DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，如核苷酸碱基的插入、缺失、倒位和易位等多态性(6刀，随着分子技术不断的深入研究，分子标记的种类很多就延伸到了依据各种序列多态性。1980年，人类遗传学家Botstein等首次提出DNA限制性片段长度多态性作为遗传标记的思想，随后1985年PCR技术诞生。到目前，科研工作者已经开发出多种各具特色的DNA标记技术，为实现不同的研究目标提供了丰富的研究方法手段和工具16引。1．基于DNA分子杂交的分子标记以DNA分子杂交为基础的分子标记方法，即用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子，之后用同位素或非同位素标记的随机基因组克隆、eDNA克隆、微卫星或小卫星序列等作为探针进行DNA分子问杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。根据这种应用开发的最早的标记技术为限制性长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)。RFLP原理是当限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变(如碱基序列插入、缺失、倒位，易位或其他序列重排)时，将会引起限制性酶切位 万方数据第一章文献综述点的增加或缺失。经过酶切后，与经过同位素或者非同位素标记的DNA探针进行杂交，由于酶切位点的变化，DNA中与该探针同源的片段长度发生变化，表现出限制性片段长度的多态性【69。73J。RFLP标记具有共显性，尤其是在进行突变体基因定位时，F2代群体的所有的遗传信息均可以显示出来。同时，RFLP标记表型出重复性和稳定性好等优点；但需要对探针进行同位素标记，较为复杂不适用于较大量样本标记，成本较高，具有一定局限性，2．基于PCR的分子标记聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行数次，使目的DNA得以迅速扩增。PCR具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。该技术的发明在分子标记标记中发挥了重要作用，在基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究中，以及疾病的诊断或其他任何与DNA和RNA相关的领域均发挥了重要的作用。(1)随机扩增多态性DNA分子标记(RandomAmplifiedPolymorphicDNA。RAPD)RAPD标记的方法是以DNA为模板，以人工合成的随机多肽核苷酸序列为引物，在热稳定DNA聚合酶作用下，进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离，染色后，在紫外透视仪上检测多态性p4|。RAPD标记所用的引物长度通常为9．10个碱基，大约只有常规的PCR引物长度的一半，由于引物较短，因此在扩增产物时一般使用较低的退火温度。RAPD标记的优点是对DNA需要量极少，对DNA质量要求不高，操作简单易行，不需要接触放射性物质，一套引物可用于不同生物的基因组分析，可检测整个基因组；但也存在局限性，一般表现为显性遗传，不能区分显性纯合和杂合基因型，因而提供的信息量不完整。另外，由于使用了较短的引物，RAPD标记的PCR易受研究条件的影响，结果的重复性较差。(2)DNA扩增指纹(DNAAmplifiedFingerprints，DAF)DAF标记原理与RAPD标记相似，使用随机引物进行产物扩增【75】。在PCR扩增产物时使用的引物序列较短，一般为5—8个核苷酸，因此随机结合到模板上的位点比较多，DNA扩增条带较多，是检测DNA片段长度多态性的快速、经济、有效的技术；但仍存在一些局限性，由于DAF使用了更短的引物，PCR稳定性较低。(3)简单序列长度多态性(SimpleSequenceLengthPolymorphism，SSLP)基因组中通常存在含有1．3个核苷酸的重复序列，这些重复序列在不同的物种中重复的次数不同。SSLP分子标记就是是根据串联重复排列微卫星序列两侧的单9 万方数据第一章文献综述一序列设计引物，扩增出包含这些重复序列的大概150-200bp产物，经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产物，比较扩增带的迁移距离，可以判定不同个体在染色体某个基因座上的多态性，其中这种多态性的多少，主要取决于不同生态型物种间所含有的重复序列重复次数，该标记方法与简单序列重复(Simplesequencerepeats，SSR)176】标记原理类似，并且，该标记分布广泛，检测手段简单、稳定和可靠，在基因定位和克隆中，具有广泛的应用价值；但该标记方法要求微卫星两侧单一序列信息是己知的，因此也存在一定限制【『”J。(4)简单序列区间重复分子标记(Inter-simpleSequenceRepeat，ISSR)ISSR是以单引物的PCR为基础，扩增两个序列相同但方向相反的SSR直接的一段DNA序列[78]。ISSR的引物为锚定的微卫星DNA序列，一般在引物57或者37端接上2．4个锚定碱基。在PCR反应中，锚定引物使用特定的退火，从而扩增与引物互补的间隔间隔不太大的重复序列间的DNA片段。ISSR研究成本低、操作简单、并且多态性丰富；但其局限性在于摸索PCR扩增最适反应条件需要一定时间，其标记多为显现标记。(5)序列标签位点(SequenceTaggedSite，STS)分子标记STS标记使用的特异引物是根据单拷贝的DNA片段两端的序列设计，从而可以扩增出长约几百bp的特异序列161|。STS标记采用常规PCR所用的引物长度，因此PCR分析结果稳定可靠。同时，RFLP标记经两端测序后可转化为STS标记。STS在基因组中往往只出现一次，从而能够界定基因组的特异位点。该标方法在基因组作图上具有非常重要的作用，通过PCR或杂交途径来完成物理作图，同时也可作为比较遗传图谱和物理图谱的共同位标【79]。(6)序列特征化扩增区域(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion。SCAR)SCAR标记是由RAPD标记转化而来的【80,81】。该标记方法是首先回收RAPD产物，之后进行测序，再根据测序结果设计引物，再次进行PCR，扩增出的同样大小的特异带，就是SCAR标记。该标记方法重复性较强、对反应条件不敏感、结果稳定，因此具有很强的应用性。3．基于酶切位点和PCR反应的分子标记(1)酶切扩增多态性序列分析(CleavedAmplifiedPolymorphicSequenceAnalysis，CAPS)分子标记CAPS又称为PCR．RFLP【82】，是广泛应用的传统分子标记技术。该方法的原理是在RFLP基础上，利用PCR扩增出目的区问产物。根据扩增区间因单碱基差异而造成酶切位点的增加或缺失，再利用相应的酶处10 万方数据第一章文献综述理扩增产物，之后进行电泳检测，根据电泳的分离结果，即可检测SNP位点的差异峭31。该方法快速、简洁，但是无法检测不涉及到酶切位点改变的SNP，因此仍存在一定的局限性。(2)衍生的酶切扩增多态性序列分析(DerivedCleavedAmplifiedPolymorphicSequenceAnalysis，dCAPS)分子标记dCAPS是以CAPS为基础[84,85]，在进行PCR扩增产物时，通过在引物中引入一个或少量错配碱基创造酶切位点，之后再进行相应酶切反应，根据电泳产物分离结果，检测sNP的有无。该标记方法对研究技术要求不高，且操作简单，在遗传学研究中被广泛应用。4．基于单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由于单个核苷酸发生插入、缺失、转换和颠换变异所引起的DNA序列的多样性。在大部分有机体基因组中，SNP是存在最普遍和稳定的遗传多样性类型【861。SNP在生物基因组中具有数量多、分布广等特点，是目前广泛应用的第三代分子标记187删J。(1)扩增阻遏突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS)分子标记ARMS(扩增阻遏突变系统)又称为等位基因特异性PCR(Allele．SpecificPCR，AS—PCR)【91．92】，其原理是：根据等位基因分别设计两个上游引物，将等位基因的特异碱基位于引物37．末端，分别与同一个下游引物构成PCR体系。由于TaqDNA聚合酶缺乏3’．5，夕h切校正活性，只有当引物3，末端与模板严格互补的上游引物才能得到PCR扩增产物，反之，则无PCR产物。因此根据电泳检测产物的有无，即可鉴定单碱基的多态性。这种方法适用于己知多态位点等位基因的检测。在AS．PCR基础上，科研工作者又对此方法进行了优化改进，Cha等一玉舛J在设计等位基因特异性引物时，有靠近SNP位点的3个碱基中增加了一个错配碱基；Drenkard1951等通过优化两次PCR的循环数来提高检测结果，并开发SNAPER程序软件为每个SNP等位位点设计16种类型特异性引物，这种改进显著提高了SNP等位位点的检测效率。(2)基因芯片技术(Genechips)基因芯片又称DNA芯片(DNAchips)或生物芯片(Biologicalchips)，其原理是用制备带荧光标记的待测样品与固定在芯片上的阵列探针杂交，或者用制备无荧光标记的待测样品与固定在芯片上的微阵列探针杂交，之后进行染色，根据杂交信号强弱的差异进行检测p6。。为加快杂交反应速度，美国Nanogene公司研制了Nanochip电子微阵列[97，98J，通过 万方数据第一章文献综述在杂交位点引入电场而使杂交和冲洗过程的速度大大增加。该方法是利用核酸杂交原理建立的一种高度集成化、微型化和自动化的检测技术，已在基因多态性分析方面广泛应用。1．4．3基因克隆对于基因序列功能的研究有两种方法，即反向遗传学(Rversegenetics)和正向遗传学(Forwardgenetics)。反向遗传学是根据基因组己知的序列和表达序列标签(EST)或转录相关信息进行基因研究的方法；正向遗传学是根据特殊的突变表型研究基因序列的方法。反向遗传学方法着眼于基因本身，通过特定的序列或在基因组中的位置来验证特定基因的特殊功能，科学家最初利用已知序列的模式生物(如拟南芥，果蝇等)，采用基因敲除方法、内源和外源序列标签元件以及T-DNA插入突变体等方法试图研究特定基因的功能【蛾100]；正向遗传学的特点是利用已经获取的感兴趣的突变表型研究目的基因，利用T-DNA插入或者转座插入突变材料进行正向遗传学研究，可以通过分析其临近的序列标签或标记位置进行基因鉴定；对于由于化学因素或辐射引起的突变，需要采用图位克隆的方法进行研究【101‘104】。图位克隆(Map．basedCloning)又称为定位克隆(PositionalCloning)，属于正向遗传学范畴，由Couslon于1986年提出【1051，该方法是根据功能基因在基因组染色体上的位置分离出具有感兴趣表型的基因。其原理是，植物基因组中包含所有功能基因稳定的基因座，利用分子标记技术通过遗传分析将基因定位到染色体具体位置上，经染色体步移(ChromosomeWalking)不断缩小筛选区域或者利用染色体登陆(ChromosomeLanding)等方法找到突变基因，最后经遗传转化试验验证目的基因功能[106,1071(如图1．2所示)。科研工作者于2000年完成拟南芥C01．0基因组核苷酸序列测序工作，同时完成Ler生态型基因组大部分序列测序工作以来，图位克隆方法在拟南芥正向遗传学研究中被广泛利用。拟南芥C01．0和Ler两种生态型存在的序列差异主要表现为插入／缺失多态性(Insersion／DeletionPolymorphisms，Indel)和单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)两种形式。根据这两种多态性形式可以设计不同类型的分子标记，在拟南芥图位克隆中应用较多的分子标记是SSLP和SCAPS分子标记。在实际图位克隆过程中，可以根据拟南芥相关信息网站公布的标记信息，同时也可以根据己知的多态性信息自行设计标记引物， 万方数据第一章文献综述进行目的基因的克隆及定位。Arondelll08】首次利用该方法克隆到了FAD3基因。1，构建作图群体在拟南芥中，以野生型C090生态型背景为例，首先将野生型C01．0种子利用EMS试剂进行诱变，反复回交后得到的稳定遗传的突变体。再以突变体作为父本与另一种生态型(常用的是Landsbreg(Ler)或Wassileskijia(WS))作为母本进行杂交，收获Fl代种子。利用Fl代材料进行突变基因遗传分析，根据Fl代植株突变表型的出现或消失可以判定控制性状基因型的显隐性。如果表型性状与突变体表型性状相同则该突变基因是显性遗传，如果没有表现出突变表型则该基因是隐性遗传。再由F1代种子自交得到F2代种子，从F2代中筛选出与突变体表型相同的植株作为基因克隆的作图群体【。091。2．基因粗定位植物体在进行减数分裂过程中会发生交换和连锁现象。遗传距离代表减数分裂过程中，同源染色体上的非姐妹染色单体间发生交换的重组率；遗传距离越短，代表分子标记距离目标基因越近；反之，遗传距离越远，代表分子标记距离目标基因越远。通常用厘摩(cM)来表示遗传距离，两位点间的遗传距离范围变化可以从0cM(完全连锁关系)到5cM(无连锁关系)。利用200．300株F2代作图群体，选择合适的分子标记将目的基因定位在基因组某一染色体10—20cM的范围内，之后再利用更大的作物群体将目的基因缩小到4cM的范围内。通常，通过拟南芥信息网站(如*air,http：／／www．arabidopsis．o叫)找到位于基因组5条染色体上均匀分布的分子标记(为了操作便捷，一般选用SSLP标记)，利用小群体分别检测各个群体再各个标记上的交换值，计算各分子标记与目的基因的遗传距离。最终，再将目标基因定位于某一染色体上的两个标记之间ll川J。3．基因精细定位构建更大的作图群体，在粗定位的基础上，利用染色体步移方法，使用合适的分子标记(如SSLRCAPS和SNP等)，进行精细定位，将突变基因精确的定位于20kb(约为O．12cM)甚至更小的遗传间隔，然后对20kb的这段序列测序，通过与野生型的序列进行比较可以筛选出多个侯选基因1111J。 万方数据第一章文献综述123口ro_F．嗤ar’m}phe衄‘，peF，一。需苫蔷鬣；。。，7‘oonmoercernaklale口en日ESgrow鲫F2p“叫1事均qpoF：>徽<4CMresotJ。。：)n。：-口en晰pel507homozFgousF2●grow3400F{瑚nBgenc巾fpe>徽。==-●aHF：plants_^协fLaniong10口ro_F，totprogenypr,eno'叶peF3rscom幻mntstestings●口ueno■Dt●^⋯㈤蚓|。艮雌雌．^川v㈦Ii．扩PhenoWl冲600F，pJa嗤$tot吐喇150homozygozem，川㈨一F～2～rnar。lKer：1Geno^ype3000-4000F9p|arta协finO200-300嘴combm日，虹．图I-2图位克隆原理图(Jander,2002)Fig1-2Map—basedcloning(Jander,2002)1．5研究目的及意义氮素在植物生长发育以及农业生产中是不可替代的元素，近年来，随着分子生物学技术的发展，如分子标记、转基因技术均为作物的抗性改良提供了分子水平上的可靠依据，同时丰富了作物抗性改良的手段和方法。利用转基因技术提高作物的氮素利用效率具有重要的理论和应用价值，而这项工作的首要环节就是要克隆到与植物氮素吸收、转运和同化相关的重要基因，并对其功能进行深入细致的分析。本研究以模式植物拟南芥为材料，经EMS诱变后筛选出耐低氮的突变体，随后采用图位克隆的方法试图分离出与氮素营养相关的基因，分析其在植物氮素吸收、同化、转运过程中发挥的作用，为今后通过转基因技术提高农作物的氮素利用效率奠定良好基础。 第二章突变体表型鉴定及遗传背景纯化第二章突变体表型鉴定及遗传背景纯化在基因图位克隆过程中，纯合的突变体材料直接影响基因的定位结果。实验室前人以拟南芥Col，0野生型种子为材料，用甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone，EMS)化学诱变方法，获得两株耐低氮突变体Int3和Int5。本研究分别以C01．0野生型为母本，突变体为父本，经过多次回交，纯化两株突变体遗传背景：并以Col-0野生型为母本，纯合突变体为父本，进行杂交，收获Fl代种子，利用F】代自交得到的F2代群体进行突变基因遗传分析。2．1材料与试剂2．1．1研究材料突变体Int3；突变体Int5；zhikuquan20150807野生型C01．0。2．1．2常用仪器与设备表2-1常用仪器设备仪器名称仪器型号塑厂塞2．1．3常用试剂1．常用MS培养基配方万方数据 —————●_________--_______-__-_-_____——-—————_—_——●—__—_————__———————————————————一一一釜三皇窒銮堡耋型笙壅墨望堡堂茎丝些．(1)l％MS培养基(1L)NN：10g／L：(数量和单位间有一个空格)琼脂粉：10g／L；MS粉：4．46g／L；PH：5．70．5．75：用蒸馏水定容至1L。(2)0．6％MS培养基(1L)蔗糖：10g／L；琼脂粉：6g／L；MS粉：4，46g，L；PH：5．70．5．75：用蒸馏水定容至1L。2．无氮培养基母液配方(1)大量元素(40x)／500mlMgS04‘7H20：7．4g；KH2P04：3．4g；zhikuquan20150807CaCl2’2H20：8．89。(2)微量元素(200×)／LMnS04’H20：3．8g；ZnS04’7H20：1。73g；H3803：1．25g：KI：0。166g；Na2M004·2H20：0．05g：CuS0451420：0．005g；COCl2‘6H20：O．005ga(3)有机元素(100x)／L甘氨酸：0．2g；盐酸吡哆醇：O．05g；烟酸：O．05g；肌醇：O．05g。(4)铁盐(100x)／L16万方数据 第二章突变体表型鉴定及遗传背景纯化FeS04‘7H20：2．78g；EDTA‘2Na：3．73g。3．无氮培养基配方(1L)大量元素：MgS04．7H20(40x)，KH2P04(40x)，CaCl2·2H20(40x)各25mL；微量元素(200x)：5mL；铁盐(100x)：10mL：KCl(1X)：9．4mL；蔗糖：10g；琼脂粉：8g；用超纯水定容至1L，NaOH及HCl调PH5．70．5．75之问。4．NaClO消毒液配方(500mL)曲拉通：0．05mL；NaClO：2．5mL：用超纯水定容至500mL。5．SDSDNA提取液(400mL)Tris．HCl(0．5mol／L)：160zhikumL；quan20150807NaCI：5．844g；EDTA：3．7224g；SDS：2g；用超纯水定容至400mL。2．2研究方法2．2．1拟南芥种植1．拟南芥种子消毒与春化将种子分装在己灭菌的1．5ml离心管中，在无菌操作台中加入1m1上述NaCIO种子消毒液，持续剧烈震荡10min，使种子与消毒液充分接触，用无菌水洗涤5次，之后将种子放入4。C冰箱中春化2d。2．拟南芥种子点布于培养皿将1ml枪头去尖部制造细小的平孔，高温湿热灭菌，121℃，20min。将小的橡胶塞浸泡在酒精中。在无菌操作台中，用镊子夹取橡胶塞，使表面酒精挥发干净。之后将橡胶塞套在枪头较粗口一端，即万方数据 万方数据第二幸突变体表型鉴定及遗传背景纯化形成一个小型滴管。用滴管将已春化的种子在离心管中吹打几下，使种子悬浮，再吸取少量种子，均匀布点在1％MS培养基表明，盖好培养皿盖，用封口膜封住扣合边缘，将培养皿竖直放入培养箱中，22℃光照培养。3．拟南芥幼苗移植营养土种子在1％MS培养基中培养7d后，长出1．1．5cm的主根，用镊子小心地将幼苗转移到0．6％MS培养基中(不要损伤幼苗和根)，封好封口膜，将培养皿平放入培养箱中，22℃光照培养，促进根的生长。此步骤在无菌操作台中完成，并利用酒精灯制造无菌区，镊子使用前后都要灼烧至通红。将营养土和蛭石按照1：1的比例混匀，装入塑料袋中，121℃高温湿热灭菌20min，降温后，搅拌均匀分装在培养钵中，每12个营养钵为一组放入一个托盘中。移苗前，先用水湿润培养土，但控制湿度不能太高。幼苗在0．6％MS培养基中生长5．7d，用镊子夹取幼苗，将其种在培养土中，尽量将根扎在营养土深处，注意不要损伤植株的根和胚轴，并对每颗幼苗编上编号，记录移栽日期。用湿润的黑色塑料膜盖在营养土钵边缘，黑暗条件培养2d后，揭开塑料膜，进行正常生长，温室生长环境为22"C光照16h，19"C暗环境8h。2．2．2拟南芥杂交1．亲本的选择母本：花未开放，且雌蕊和雄蕊均未从花萼中露出的花蕾可以作为母本。父本：花朵完全开放的植株可以作为父本。当去掉花瓣和雌蕊，可以看到正处于释放花粉的雄蕊，其表面呈现出的黄色颗粒即为花粉。2．杂交前准备先将作为父本植株提前2d种入营养土中，这样作为父本的植株比母本植株早开花，从而保证杂交过程中可以提供足量的花粉。3．杂交方法用镊子小心去母本的花瓣，花萼和雄蕊，露出雌蕊：再用镊子小心去掉花瓣和雌蕊露出雄蕊的花粉，夹取花粉在雌蕊柱头上来回涂抹，使花粉均匀洒落在柱头上，保证杂交的成功。在杂交的枝梗上缠绕上红色细绳，做好标记，并用剪开瓶底的矿泉水瓶盖住枝梗，用长木签支撑，作为一种瓶罩保护雌蕊不会再接收其他花粉，注意不要影响杂交果的生长，并适当保持湿润。做好杂交后，要随时观察，若杂交成功，雌蕊会正常生长；若未成功，雌蕊会慢慢枯蔫。10d后可以摘去矿泉水瓶罩。 万方数据第二章突变体表型鉴定及遗传背景纯化2．2．3种子收获当植物结出的角果由绿色开始变成黄色时，注意随时观察角果生长状态，选择角果表皮呈黄色且出现裂痕时，用剪刀轻轻剪下角果并收集到1．5ml的离心管中，再放入少量变色硅胶粒，保持干燥，记好标号和种子收获时间，置于4oc冰箱保存。2．2．4突变体表型鉴定将野生型Col一0及两株Int3和Int5突变体分别进行种子消毒后，于4。C避光春化2d，将种子点在1％MS培养基中，生长7d后，将幼苗分别转移到无氮培养基中，随时观察突变体和野生型材料的表型性状差异，以MS培养基正常处理作为对照。2．2．5突变体遗传背景纯化将筛选出的表型明显的突变体作为父本与野生型Col一0为母本进行杂交，得到F1种子后，自交得到F2代种子，挑选出有表型的突变体，与野生型C01．0母本进行回交，重复上述步骤3次，达到纯化突变体遗传背景的目的。2．2．6基因遗传分析分别将两株突变体Int3和Int5与野生型Col一0进行杂交，收获F1代种子。利用Fl代材料进行突变基因遗传分析，根据Fl代植株突变表型的出现或消失首先判定基因型的显隐性。如果F1代表型与突变体表型相同则控制该性状基因是显性遗传，如果Fl代群体没有表现出突变表型则该基因是隐性遗传。再由Fl代材料自交得到F2代群体，根据F2代群体分离比，确定突变基因种类。2．3研究结果2．3．1突变体表型鉴定结果1．Int3突变体表型鉴定结果通过不同筛选条件处理发现：将突变体Int3种子和野生型C01．0种子消毒后，4。C避光春化2d，随着铺在1％MS培养基中光19 万方数据第二章突变体表型鉴定及遗传背景纯化照培养(光暗周期分别为16／8h)，生长7d后，转苗至无氮培养基中，当无氮处理3d时，突变体与野生型材料出现表型差异，野生型植株叶片表型黄化，子叶及生长点均变成紫色，开始出现死亡状态；而突变体叶色绿，生长状态正常，表现为耐低氮性状(如图2．1)。魂茂(CK)MS培养基MSmedium静轴无氮培养基Nonitrogenmedium图2．1Int3突变体与野生型C01．0表型差异Fig．2-1PhenotypeofInt3mutantandwild-typeCol一0歹学舟旁母睁闷尹缸；南·、。署毒雒每k、．，么(cK)MS培养基无氮培养基MSmediumNonitrogenmedium图2．2Int5突变体与野生型C01．0表型Fig．2-2PhenotypeofInt5mutantandwild-typeCol-020矗．警基≯ 万方数据第二章突变体表型鉴定及遗传背景纯化2．历巧突变体表型鉴定结果通过不同筛选条件处理发现：将突变体Int5种子和野生型Col一0种子消毒后，4。C避光春化2d，随着铺布在1％MS培养基中光照培养(光暗周期，16／8h)，生长7d后，转苗至无氮培养基中，当无氮处理3d时，突变体与野生型出现表型差异，野生型植株叶片黄化，子叶及生长点均变成紫色，而突变体生长状态正常，表现为耐低氮胁迫性状(如图2．2所示)。2．3．2突变基因遗传分析1．Int3突变基因显隐性关系确定结果Int3突变体与野生型Col一0杂交后，获得Fl代群体，经无氮胁迫后观察表型，发现子一代群体表型与野生型相同，说明该基因为隐性突变；Fl代自交获得F2代群体，挑选500株植株低氮胁迫，统计后代表型分离比，并利用公式X2=(观察值．理论值)2／理论值计算结果显示，Int3基因为隐性单基因突变(如表2．2)。表2-2F2代表型分离比卡方检验结果类型植株数目野生型表型突变体表型分离比卡方检验(x2)2．胁巧突变基因显隐性关系确定结果突变体与野生型杂交，获得F．代群体，经无氮胁迫后观察表型，发现子一代群体表型与野生型相同，说明该基因为隐性突变：Fl代自交获得F2代群体，挑选300株植株低氮胁迫，统计后代表型分离比，并利用公式X2=(观察值．理论值)2／理论值计算结果显示，Int5基因为隐性单基因突变(如表2—3)。表2-3F2代表型分离比卡方检验结果类型植株数目野生型表型突变体表型分离比卡方检验(x2) 万方数据第二章突变体表型鉴定及遗传背景纯化2．4结论与讨论2．4．1结论本研究在低氮胁迫处理下，分别对两种突变体Int3和Int5进行了表型鉴定，结果表明，两株突变体均表现耐低氮性状；通过遗传分析，确定两株突变体的氮素相关基因均发生隐性单基因突变。2．4．2讨论本研究利用野生型与突变体进行多次回交，纯化突变体的遗传背景，为后续的基因图位克隆及定位提供可靠的材料。通过观察表型可以看出，在相同的低氮胁迫处理下，两株突变体表型相似，均表现出耐低氮作用。因此推测，由于EMS诱变引起的突变是随机的，Int3和Int5两株突变体可能是同一基因发生突变；也可能是同一基因家族成员或不同类型基因发生突变。若是后者，则可以为耐低氮基因功能研究提供更加丰富的材料。 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证氮素在植物生长发育以及农业生产中都是不可替代的元素，研究作物氮代谢的机理，对提高作物对氮肥的吸收、利用效率具有重要的理论和应用价值。本研究以筛选出的耐氮突变体Int3和Int5为材料，采用图位克隆方法分别克隆耐氮相关基因，并进行初步功能研究，为今后通过转基因技术提高农作物的氮素利用效率奠定良好基础。3．1研究材料与试剂3．1．1研究材料由第二章研究得到的Int3和Int5两株纯合突变体Landsbregerecta(Ler)野生型材料3．1．2常用仪器设备表3-1常用仪器设备Tabie3．1Laboratoryinstrumentsandequipment仪器名称仪器型号生产厂家 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证3．1．3研究试剂1．组织培养试剂(具体配方如第二章所述)1％MS培养基；0．6％MS培养基；无氮培养基；NaClO消毒液；2．分子试验试剂SDS提取液(具体配方如第二章所述)；PCR反应体系所用试剂：ddH20：10×PCRBuffer(10×。含M92+)；dNTP：引物；Taq酶。3．TAE(50x)缓冲液(1L)Tris：242g；EDTA-Na2：37．2g；ddH20：800mL：冰乙酸：57．1ml；ddH20定容1L。3．2研究方法3．2．1基因定位研究方法1．定位群体构建(1)杂交材料的准备将拟南芥突变体种子和Ler野生型种子分别用种子消毒液消毒，4。C春化两天后将种子点布于1％MS培养基中培养7d，再将幼苗转移到O．6％MS培养基中生长5d，此后将幼苗移植到营养土中生长，准备杂交。(2)F1代杂交材料鉴定以突变体材料作为父本、野生型Ler作为母本，进行杂交，收获Fl代种子。按上述方法将F1代幼苗移植到培养土中，待幼苗生24 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证长约15d左右，提取幼苗叶片DNA，选取多态性良好SSLP标记进行PCR鉴定，根据电泳条带多态性的结果确认杂交是否成功。(3)挑选作图群体根据鉴定结果，种植杂交成功的Fl代杂合子，自交，收获F2代种子。将F2代进行低氮胁迫处理，挑选出具有表型的个体组成定位群体，分单株提取DNA，放于．20℃冰箱保存，用于基因的图位克隆。2．DNA提取方法按上述方法配置SDS提取液；取植株幼苗新鲜叶片1—2片或整棵幼苗，放置于1．5ml离心管中：用电钻打磨叶片，并加入600gLSDS提取液，上下翻转充分混匀，反应7-8min；4。C，12000rpm离心10min，取上清液；加入800uL氯仿，轻轻上下颠倒，充分混匀，放置4"C冰箱中，反应30min，期间随时重复轻轻上下颠倒，促进反应完全；44C，12000rpm离心10—15min，弃上清；加入600—800pl75％的酒精，室温静置5min，12000rpm，离心5min；弃上清，重复上步反应；弃上清，倒置离心管30min，使残液流尽后；加入适量ddH20，4。C冰箱过夜，分装适量工作液，剩余放入．20℃冰箱内长期保存。3．PCR反应(1)PCR反应体系表3-2PCR反应体系Table3．2PCRreactionsystemddH2011．4uLDNA1gL10xPCRBuffer含M92+)2uLdNTP(2mM)0．8儿L引物FP(10mM)1gL引物RP(10mM)1gLTaq酶(5u／V1)0．1gL(2)PCR反应程序94℃预变性2min；94℃变性30s；52．58"C退火30s；■35cycles72℃延伸30s；。72℃延伸5min；4。C终止反应。4．琼脂糖凝胶电泳。(1)根据扩增产物的大小，制备不同浓度的琼脂糖凝胶称取琼脂糖，加 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证入适量1×TAE，微波加热至溶液呈澄清透亮的溶液，静置1rain，倒入胶班槽内，垂直插入适合孔径的梳子；室温静置，直至胶凝固，垂直轻轻拔出梳子。(2)将1×TAE电泳缓冲液倒入电泳槽中，将琼脂糖胶放入电泳槽中。吸取8．10ulPCR产物与Loadingbuffer混匀后点样到胶孔中，设定时间和电压进行电泳；注意样品由负极向正极移动。(3)将跑完电泳的胶放入EB盒中，染色15min；凝胶成像仪扫描结果，照相，分析电泳结果。5．分子标记选择。根据C01．0和Ler序列差异的种类设计不同类型的引物：(1)SNP序列差异类型(如图3—1)：选用CAPS或dCAPS标记方法，设计引物扩增片段酶切，电泳检测酶切产物，判断引物多态性。(2)Indel序列差异类型(如图3．2)：选用SSLP标记方法，设计扩增长度约为150．200bp的引物，并分别以C01．0和Ler为模板扩增PCR产物，电泳检测引物多态性。洲～屹潜兀℃C亿-A觚订TⅨ婚而～⋯⋯I|Il⋯¨ll|ILⅣ～垅途T1℃C亿用馘玎TRXm图3-1单核苷酸多态性Fig．3-1SinglenucleotidepolymorphismCd．OTTGATTII|||IIIlI⋯⋯¨IlL彰向∞恰内蛳G代咒鹾笼m∞陷℃图3-2插入．缺失多态性Fig．3-2Insertion-deletionindel6．开发根据SNP设计AS．PCR标记方法由于TaqDNA聚合酶缺乏3'-5’外切校正活性，只有当引物3’末端与模板严格互补的上游引物才能得到PCR扩增产物，反之，则无PCR产物。由此，本研究根据拟南芥C01．0和Ler两种生态型中的等位碱基位点，分别设计两个上游引物，将等位基因的特异碱基位于引物3’一末端，分别与同一个下游引物构成PCR体系，分别进行两轮PCR，最后利用电泳检测产物的有无，即可鉴定单碱基的多态性。7．交换值计算方法交换值(％)=(重组配子数／总配子数数)×100％公式(1) 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证3．2．2候选基因测序方法1．PCR产物纯化方法将PCR产物转移到1．5ml离心管中，加入PN溶胶液(体积比1：5)，轻轻混匀，室温静置10min；将溶液转移到制备管中，制备管置于2ml的离心管中，静置15mira12000g，室温离。th,1min，弃掉离心管中的液体，将制备管重新放回离，th,管中；向离心管中加入700lalBufferW2(以加入酒精)，12000g，室温离心1min，弃掉离心管中的液体，将制备管重新放回离心管中；向离心管中加入500plBufferW2(以加入酒精)，12000g，室温离心1min，弃掉离心管中的液体，将制备管重新放回离心管中；12000g，离心4min，将制备管放入新的离心管中，开盖挥发酒精2min；在制备管中央垂直滴入适当体积ddH20，室温静置30min；12000g，离心4min，弃掉制备管，产物在4。C冰箱放置6h，放入．20℃冰箱，保存。2．候选基因测序在低氮胁迫处理条件下，挑选出表型明显的突变体幼苗，及时转移到0。6％MS培养基中正常培养7d，之后将幼苗种植到培养土中，生长约15d后，取新鲜叶片提取DNA，在44C冰箱放置6h，放入．20℃冰箱，保存；根据候选基因信息设计引物，PCR扩增突变体DNA，回收产物，送至生工进行测序，根据返回的测序结果，利用NCBI进行BLAST序列比对，鉴定候选基因。3．2．3生理数据测定方法1．植物地上部和地下部全氮测定方法分别取同一时期，同一处理样品的地上部和地下部，烘干，磨样；分别取样0．200Xg，加入催化剂，进行消煮：扩散皿外室吸取消煮液2mL，并将碱性胶液涂抹到扩散皿外室边缘，皿边与毛玻璃完全粘合，室内加入3mL硼酸指示剂溶；消煮完全后，放置直至温度下降至40℃，2h，测定全氮含量。2．根对氮离子流吸收非损伤微测方法将Int3突变体种子和野生型C01．0种子消毒后，4℃避光春化2d，铺布在1％MS培养基中培养(光暗周期，16／8h)，生长7d后，转苗至无氮培养基中胁迫处理3d，进行非损伤微测。该方法可以利用特异性离子电极，在不接触被测样品的情况下获得进出样品的各种分子和离子浓度、流速及其运动方向的信息。 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证3．3结果与分析3．3．1SSLP标记多态性鉴定结果以SSLP标记Ciw9为例验证已知标记多态性(如图3．3)。根据tair网信息可知，Ciw9位于第五染色体K16E1克隆群，物理位置为17044001b，为SSLP标记，在Col一0和Ler之间Indel差异为20bp，由生工合成引物后，以Col-0和Ler为模板进行梯度PCR，经4％的琼脂糖凝胶电泳分离产物结果显示，该标记多态性良好，Tm值可选择53．4℃、55．2℃和56"C进行产物扩增。图3-3Ciw9多态性梯度PCR检测结果Fig．3-3PolymorphismofCiw9byladderPCR3．3．2Fl代杂交结果鉴定1．／nt3突变体与Ler杂交Fl代材料鉴定利用多态性明显的SSLP标记Ciw2引物扩增Fl代群体，部分结果如图3．4所示，／nt3与Ler杂交Fl代中11号和17号株系仅显示了与Ler连锁的标记带型，表明未杂交成功；其他材料均显示出双亲的标记带型，表示杂交成功图3-4Int3xLerFl代部分材料杂交结果Fig．3-4HybridizationresultsofInt3xLerFImaterial2．／nt5突变体与Ler杂交Fl代材料鉴定利用多态性明显的SSLP标记Ciw2引物扩增／nt5与Ler杂交Fl代群体，部分结果如图如图3-5所示，1、4、7、9、13、18和20号株系标记带型与Ler一致，表明未杂交成功；6号株系标记带型 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证与C01．0标记带型一致，可能是由于收种子时混收突变体种子导致；其他株系表型出双亲的共显性标记带型，表明杂交成功。LerC01．01357911315171921图3．5Int5xLerFl代部分材料杂交结果Fig．3-5HybridizationresultsofInt5xLerF1material3．3．3突变基因定位结果1．Int3基因定位结果。(1)Int3基因粗定位结果从http：／／www．arabidopsis．org／网站上获取平均分布于拟南芥基因组5条染色体上的SSLP标记信息(如图3—6)，并由生工合成各对引物(如表3．3)。利用200株F2代群体分别进行SSLP标记鉴定，将目的基因定位在染色体具体位置上。根据遗传距离计算结果发现Int3基因位于第四染色体上Ciw5和Ciw6两个marker之间，两标记间的遗传距离为14cM；Int5基因位于第五染色体上Ciw8和CTRl．2之间，两标记的遗传距离为5．5cM。CMMakerCMMakerGMMakerCMMakerCMMaker10Dagal2647D_1l6，DC3h,4834n‘^610●7C¨42DM7lD88Dngall39ChrIChrⅡChrmcllrI、，Clu-V图3-6拟南芥染色体组粗定位SSLP分子标记Fig．3-6ArabidopsisgenomeSSLPmakerforroughmappoingCOM～一～一洲踟M823L副一峥哪 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证(2)Int3基因精细定位结果如图3．7所示，利用粗定位得到的Ciw5与Ciw6两个标记，对构建好的1143株F2作图群体进行鉴定，从中挑出重组个体，再利用新开发的分子标记(如表3—4)，从染色体步移的方法，从两端逐步逼近目的基因。通过此种方法，最终将目的基因定位于标记SSLP标记4-6179与SNP4．6265之间，二者之间的物理距离为86kb，跨越两个BAC重叠克隆群，分别是T17A8和T5L19，共含有29个基因。表3-3拟南芥染色体组基因粗定位的SSLP标记序列信息!苎!!三i：!垒翌!!垒2旦!i!量!翌2尘!兰兰生￡翌坐!!!．o!翌兰韭翌翌已!旦量SSLPFP(5'-3’)RP(5'-3‘) 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证表3．4／nt3基因精细定位分子标记序列信息Table3-4MakersforfinepositioningofInt3geneMakerFP(5'-3’)FuP(5'-3。)(3)候选基因筛选及表型鉴定通过文献阅读发现TT8基因是花青素合成途径上的转录因子，调控二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因的表达。当高蔗糖诱导条件下，m基因调控DFR基因的转录翻译，合成花青素积累，使野生型子叶及生长点均变紫红色；若m基因缺失，导致DFR基因的表达受到抑制，则植株子叶及生长点无花青素积累仍然为绿色。本研究利用蔗糖浓度30mM的1％MS培养基处理突变体和野生型材料，以10mM正常蔗糖浓度培养基为对照，验证该基因突变表型。观察结果(如图3—8)显示，突变体子叶及生长点为绿色，而野生型子叶及生长点均变紫红色，得到与图l—l相似的表型。因此将m基因作为候选基因进行测序。 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证4-6035％k524-55114．58084器舻嘴2246诬clwe图3．7／m3基因在染色体上的定位区间Fig．3-7ChromosomelocationofInt3gene注：垂直线对应的是定位标记；箭头表示标记所在的BAC重叠群；数字表示重组子数量。Note：Verticallinesindicatemakers；ArrowsindicateBAC；Numbersindicatethenumberofrecombinant．C01．．0Int3C01．．0Int3MSmediUin30mMsucrose图3-8／nt3突变体与野生型C01．0表型Fig．3-8Phenotypeofln3mutantandwild—typeCol-0(4)m候选基因测序及序列比对在低氮胁迫下挑选表型明显的突变体，提取DNA。设计TT8候选基因引物，进行PCR扩增，将PCR扩增产物纯化后送到生工进行正、反向双向测序。在NCBI对突变体候选基因测序结果进行序列比对，结果显示：突变体中m基因外显子的第760个碱基由C突变为T，编码氨基酸的密码子由CAA突32 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证变为UAA，导致翻译提前终止，基因在该位点产生了无义突变(如图3-9，3．10，3-11．3-12)。2536185557313618549737361854374336185377493618531T|lII|I|lI||II|『⋯II|I|II|I|||⋯I|I|¨|||Il||||I⋯||⋯IIAAGAAGAAGT^G^AG¨6^G^TGACA．ATGTC^6^6G^^^TGA6GCTTOGCTCTCCTGATGATG^^G^TGTTTcc¨打j^¨TcTAcAcTcTGATcTTcATATT“ATC．UjCccATAcGT⋯|II|||||⋯⋯⋯|III⋯III|I|||I|||||⋯⋯||⋯J|I|||IATG^^6ATGTTTccAAl￡蔓“ATcTAcAcTcTGATcTTcATATTG^ATc从ccc^TAcGTTAGGTATATATATCTACCCTkAC-CTACTTATATTTTGCGG^TTTATTTCGCTATATCT从II||11lI1II|I|I||II||I||⋯⋯⋯⋯||⋯IIl||l||⋯I|⋯I|ITACK}TATATA．TATCTACCCTAAGCTACTTATATTTTGCGGATTTATTTCGCTATJUCT从G¨^TTATCATTTGTAT^T^TATGTAGACAcAcATATGGACATGATGA^TCTnTGGAGGII|I|||l|III⋯⋯II|II|⋯I||I|I⋯||I|||⋯⋯⋯|||I⋯I|GAAATTATCATTTGTATATATATGTAGACACACATATGGACATGATGAATCT^ATGGAGG图3-9突变体候选基因序列正向测序结果Fig．3-9Forwardsequencingresultsofcandidategene注：框内表示突变位点。Note：Redboxjndicatesmutatedbase．“TAGTTTCCAcCTTCCTCCATTAGATTCATCATGTCCAT盯GTGTGTCT^cAT^TATATl|||I||l|||||||||||I|I||⋯||⋯⋯|I|lI|I||||III|JI|I|I|||IA^TAGTTTCCAcCTTCCTCCATTAGATTCATCATGTCCATATGTGTGTCT^cATATATAT^cEAATGAT“TTTCTTAG^TATAGc㈨从ATCC6c^¨^TAT从6T瓶TTAGGGT||||⋯⋯||I|I|⋯IIII|l||I|⋯l|⋯Il|||||I|III||||I|lI⋯AcAJbkTGATAATTTCTTAGATATAGcGA^^T“^TCCGc^¨^TATAAGT^GcTTAGG6Tn^G^T^TATATAcCTAACGTATGGGTTGATTC“TATG¨6^TC惦^GTGTA6ATTT?JkUI|I|I||I||I|||I|lI|I|II||||I||l|I|I|lI|⋯I|lII|⋯I||Il|AG^TATATATAcCTAAC6TATGGGTTGATTCAATATG^^G^TC^G^GTGT^GATTTtG^TI．_JTGG^^^CATCTTCATC^TC^G6^6^GCCAAGCCTCATTTCCTCTG^cATTGTCAt_=i：ttl|I|I|||||||||I||l|II|I|||||||I|I|I|I|Il||I|I|||I|II|l¨||l|T6G¨^CATCTTCATCATC^GG^G^GcC从6cCTCATTTCCTCTGAcATTGTCATCTCTT二·i二tj：十十：+t：i十二；}_=H：=；：．{：i{：ATC,CACTTCGTAGGT删GTTC^6^¨||I|I|l|||||⋯11|||J|l||||⋯I|I|l||I||||||⋯||⋯I|⋯||lCTTCTAcTTCTTCTTC6TCTTCGGcTTCTTCATGC^cTTCGTA6GT啪GTTCAG从^图3—10突变体候选基因序列反向测序结果Fig．3—10Reversesequencingresultsofcandidategene注：框内表示突变碱基。Nore：Redboxindicatesmutatedbase．333126185498372618543843261853784926185318552618525826284345l8l818183191514646563062834528282828T13l915l36464656ytytytytrCrCrCrCeJejeubUbubUb日SqS日S日Sytytytytyt盯F盯F盯．F盯"盯F札铀叽孙札孙叽乳 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证4504604704304404S0GTTTCC矗^T■^^^^TCT^C^CTCTG^TC’^TTTTA^TTGG?-^^C^TCTTCATC图3一¨正向测序峰图Fig．3-11Peaksofforwardsequencing注：选中碱基为突变碱基。Note：Themarkedbaseindicatesmutatedbase图3—12反向测序峰图Fig．3-12Peaksofreversesequencing注：选中碱基为突变碱基。Note：Themarkedbaseindicatesmutatedbase2．砌巧突变体突变基因定位结果(1)粗定位结果与Int3粗定位方法相同，利用表3．3中SSLP标记将Int5基因定位于基因组第五染色体上的Ciw8和NGAl51两个marker之间，遗传距离为11cM。(2)精细定位结果如图3．13所示，将构建好的F2代作图群体，利用NGAl51与PATl．2分别对总群体数1637株个体进行PCR检测，将NGAl51处发生重组的个体利用SSLP标记5-5003进行检测，将PATl．2处发生重组的个体利用分子标记5-5907进行检测，通过对重组率的计算，保持目的基因距离两个分子标记之间的距离之和小于这两个分子标记之间的实际遗传距离。利用新开发的分子标记(如表3—5)，从染色体两端逐步步移，逼近目的基因，最终将目的基因定位于SSLP标记5-5654与5-5443两个分子标记之间，二者之间距离为21lkb，跨越了MKPll、F2K13、F5E19三个BAC重叠克隆群，并且候选基因在SSLP标记5-5654处的重组值为0，推测该标记在基因内部或端部。34●●¨iiii¨川¨¨¨¨¨⋯⋯⋯⋯川⋯J●iii川⋯㈩¨k 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证。N⋯GAls⋯oo。5-513⋯05-53s85州。5娜545。57⋯66。⋯，9：2。C⋯IW8chr511型殳兰箩<三竺里T1A1eM—DJ22—焉022一二翌写。竺旦<_一556545-57665—5385MOK4MTGl3MKP-11MV3甍。坚等竺一／F5E19[==>、‘r—3图3一l3Int5基因在染色体上的定位区间Fig．3一l3Chromosomelocationof／nt5gene注：垂直线对应的是定位标记；箭头表示标记所在的BAC克隆群；数字表示重组子数量。Note：Verticallinesindicatemakers；AITOWSindicateBAC：Numbersindicatethenumberofrecombinant．表3。5Int5基因精细定位分子标记序列信息Table3—5MakersforfinepositioningofInt5geneMakerFP(5'-3’)RP(5'-3’)35 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证3．3．4分子标记开发结果本研究在利用Int3和Int5突变体进行氮素营养相关基因图位克隆过程中，新开发2l对SSLP标记：4-4865、4—4891、4-5252、4—55ll、4-5808、4-6035、4．6099、4．6139、4．6179、4—6297、4—6372、4．6422、4—6732分别位于4号染色体；5-5003、5-5257、5-5385、5．5443、5-5654、5-5766、5-5860、5．5907分别位于5号染色体；CAPS标记CAPS4．6297，位于4号染色体；开发根据SNP设计AS．PCR标记SNP4—6265F1和SNP4．6265F2，位于4号染色体，5—5130F1和5—5130F2，位于5号染色体(引物序列信息见表3-4，表3-5)。3．3．5生理研究结果1．低氮胁迫处理突变体地上部、地下部氮素含量测定结果(1)Int3突变体地上部、地下部氮素含量测定如图3—14所示，在无氮胁迫处理7天后，测定突变体及野生型地上部及地下部的氮素含量，结果表明，突变体根部的氮素含量高于野生型，差异显著；地上部氮素含量也高于野生型，差异极显著；初步说明m基因的突变增强了植物对氮素的吸收能力。图3—14Int3地上部、地下部氮素含量Fig．3-14NitrogencontentofshootandrootinInt3图3．15Int5地上部、地下部氮素含量Fig．3-15NitrogencontentofshootandrootinInt5(2)Int5突变体地上部、地下部氮素含量测定结果如图3．15所示，经低氮胁迫7天后测定材料地上部及地下部的氮素含量，结果显示，突变体根部的氮素含量高于野生型，差异显著：地上部氮素含量也高于野生型，差异极显著。初步说明，该基因的突变增强了植物对氮素的吸收能力。36 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证2．突变体对N03。离子吸收的非损伤微测结果(1)非损伤微测技术测定珈8突变体对N03-离子的吸收结果／nt3突变体与野生型在I％MS培养基中正常生长7d后，将幼苗转移至无氮培养基中进行胁迫处理3d，利用非损伤微测技术检测根对N03离子的吸收，以MS培养基处理为对照。结果如图3一16所示，在正常处理条件下，突变体和野生型对N03"离子的吸收没有差异；低氮胁迫处理3d后，Int3突变体对N03"离子的吸收能力明显强于野生型，表明m基因可能参与植物根对N03"离子的吸收。(2)非损伤微测定Int5突变体对N03。离子的吸收结果利用上述同样的方法低氮胁迫处理珈巧突变体，以野生型为对照，利用非损伤微测技术测定根对N03一离子的吸收。由图3．17可以看出，在正常处理条件下，突变体和野生型对N03‘离子的吸收没有差异；低氮胁迫3d后，Int5突变体对N03。离子的吸收能力明显强于野生型，表明Int5突变体相应突变基因也可能在植物对氮素的吸收过程中发挥作用。2∞Efn畎1-眦(n血)0一——一一一一一⋯～一一一一一一Ⅷ一I234567l’101I12131415．．OO_‘00．100Influx夺【hⅦ+H3Influx夺Col-0+Int3(cK)MS培养基无氮培养基MSmediumNonitrogenmedium图3．16非损伤微测Int3突变体对N03"离子的吸收Fig．3-16N03‘ionuptakenon-invasivemicro—measurementofInt3mutant注：正数代表离子外排；负数代表离子吸收；绝对值代表量的大小。Note：Positivevalueindicatesionefflux；Negativevalueindicatesionuptake；Absolutevalueindicatestheamount．^：曲．=u10昌dlH；一■．_oz芑z 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证无氮培养基MSmediumNonitrogenmedium图3．17非损伤微测Int5突变体对N03"离子的吸收Fig．3．17N01‘ionuptakenon．invasivemicro．measurementofInt5mutant注：正数代表离子外排；负数代表离子吸收；绝对值代表量的大小。Note：Positivevalueindicatesionefflux；Negativevalueindicatesionuptake；Absolutevalueindicatestheamount．3．4结论与讨论3．4．1结论本研究对Int3和砌巧突变体地氮胁迫处理的表型鉴定结果及遗传分析结果表明，Int3和胁巧两株突变体基因均发生隐性单基因突变；并根据突变体基因克隆及其生理试验研究结果，得出以下主要结论：1．伽巧基因位于SSLP标记5-5654与5-5443之间，两标记间距离为21lkb，跨越了MKPll、F2K13、F5K19三个BAC重叠克隆群，标记5-5654检测结果重组值为0，该标记位于MKPl1重叠克隆群。根据低氮胁迫下，历巧突变体的表型鉴定结果；突变体对氮素的吸收强于野生型的非损伤微测结果；突变体地上部和地下部氮素含量高于野生型的检测结果推测，该基因在氮素吸收过程中发挥作用。2．利用Int3突变体材料克隆到册基因。在Int3突变体中，册基因外显子上的第760个碱基由C突变为T，导致编码氨基酸的密码子由CAA突变为UAA，氨基酸翻译提前终止，基因发生无义突变。m基因的表达产物为TT8蛋白，该蛋白属于碱性螺旋．环．螺旋(basic．Helix．100p．helixdomain，hHLH)转 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证录因子。根据非损伤微测突变体的氮素吸收能力表明TT8转录因子参与氮素吸收过程：，根据地上部、地下部氮素含量数据分析结果表明，册基因的突变可能增强了植物对氮素的吸收与转运能力。3．4．2讨论氮素是植物生长发育所必需的矿质元素之一，是影响作物产量的重要因素。提高植物对氮素的吸Lt女：N用效率，在现代遗传育种改良工作中具有重大的指导意义。近年来，植物的氮素代谢研究已经取得很大的进展，但仍需要进一步的研究。为了进一步分离出与氮素营养相关的基因，研究其对环境的适应机理和调节机制。本研究以由EMS诱变拟南芥C01．0生态型背景材料获得的两株耐低氮突变体切口和Int5为研究材料，进行基因图位克隆，初步验证其在氮代谢过程中的生理功能。1．分子标记的开发图位克隆在近几年的基因定位研究应用范围广泛，尤其是针对已经完成测序的，本研究开发的21对SSLP标记；1对CAPS标记以及两组根据SNP设计的AS．PCR标记，为今后基因图位克隆提供更加丰富的分子标记，大大节省研究时间和有效提高克隆效率。2．砌巧基因定位及候选基因选择本研究将Int5基因定位于SSLP标记5-5654与5-5443两个标记之间，且在标记5-5654的重组值为0，说明该标记位于目的基因内部或端部：5．5654标记位于5号染色体MK_P11重叠克隆群，该文库含有31个基因，推测目的基因是其中之一；另外，由于Int5突变体表型和Int3突变体表型相似，且基因功能相似，推测该基因可能与m基因位于同一信号通路，在类黄酮的合成中发挥作用，因此进行筛选候选基因时，还可以优先考虑位于标记5．5654与5-5443之间的刑9、At59l7030、At59l7040、At59l7050和AtSgl7010基因，这些基因位于在黄酮类合成中发挥作用。3．m基因的克隆及功能分析本研究利用Int3突变体材料成功克隆到m基因，该基因的表达产物为TT8转录因子蛋白。目前对册基因的研究表明，该基因主要在类黄酮合成途径中发挥重要的调节作用，但在氮素代谢中的具体调节机制中是否发挥主导作用，还需进一步探索。氮代谢及其调理机理的研究主要是植物对氮素的吸收、同化和再利用。硝态氮和铵态氮是植物从土壤中吸收氮素的主要形式，是植物从土壤中吸收氮素 万方数据第三章突变体氮素相关基因图位克隆及初步功能验证的主要器官，主要由NRT和爿脚基因家族介导，但这些成员在调控氮素代谢过程中常常出现功能冗余现象。因此，本研究旨在分离出与氮素营养相关并在氮代谢过程中发挥主导作用的基因，为今后通过转基因技术提高农作物的氮素利用效率奠定良好基础。同时，通过对Int5材料的鉴定和Int5基因定位，为植物氮素营养代谢途径的研究提供了更加丰富的材料，为更深一步研究氮代谢机制奠定了良好的基础。 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万方数据致谢本论文是在导师东方阳教授和徐江研究员的共同执导下完成的。从大学开始，东方教授就是我的指导老师，是他把我带到了科研的领域，让我了解了什么是科研。从大学到研究生期间，无论是生活还是学习工作中，东方老师都给予我极大的关心、帮助和支持，我能深切地感受到老师对待学生就像自己孩子般的那种心情。东方老师不仅是我学术上的导师，更是我人生方向引导者。在本毕业论文研究过程中，徐老师给了我很大的指导，从他身上我学习到了要时刻以认真、严谨和负责的态度对待科研，他对科研工作的热情和见解给了我很多的启发，让我受益匪浅。我觉得自己非常幸运，能够得到两位老师的帮助和指导，从他们身上我学会了要以尊重、热情和负责科研态度对待科学研究。两位老师的人格魅力和科研精神深深地感染着我，在此，向两位老师致以最诚挚的谢意!感谢郭振清老师、周丽艳老师、郭守华老师、陆鸣老师、秦子禹老师、陈于和老师、蔡爱军老师等母校老师以及农科院丁在松老师、黄素华老师等实验室老师在我学习、生活中给予的帮助与支持。感谢迟志海和徐小栋等师兄、师姐在科研过程中给予的鼓励和帮助，本研究非损伤微测技术测定部分数据由徐师兄提供。感谢洪雪、王士银、徐亚玲、张灵、于越、李赞堂、张莉、姜文宇、焦浏、周宝元以及研究室同学的帮助与鼓励。感谢孙会改、王晓青、李乔、宋伟、陈强、韩宝强、代明、武云鹏、杨雪、王林红、孙蕾全体11级研究生同学一路以来的陪伴和支持。最让我难忘的是2011年在我考研成绩不理想的情况下，是母校河北科技师范学院，还有我的导师东方阳教授接受了我，给予我肯定和认可，让我得到继续进行科学研究的机会；同时感谢中国农业科学院作物科学研究所对我的联合培养，为我提供良好的学习环境和科研平台。最后，感谢我的家人给予我的支持和鼓励，谢谢他们无私的爱，让我感觉生活充满美好和幸福。50麻艳超2014年6月12日