体外胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导nod鼠ipscs分化为胰岛素分泌细胞实验研究

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f嘲燃硕士学位论文体外胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导NOD鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞的实验研究硕士研究生：余丹峰指导教师：蔡德鸿教授摘要研究背景l型糖尿病是一种体内胰岛素绝对缺乏所导致的以高血糖为特征的终身性疾病，其发病率正在以3-5％的速度逐年提耐¨。目前1型糖尿病患者在全球大约有2000万，中国至少有100万。1型糖尿病患者需终身胰岛素治疗以维持生命，目前尚没有有效的手段根治1型糖尿病，不合理的胰岛素补充所导致的高血糖或低血糖现象严重，以致各种并发症接踵而至，患者寿命普遍缩短。为了有效控制血糖，防止糖尿病并发症的发生，提高糖尿病患者的生存质量，替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞，胰岛细胞移植蓬勃兴起【2’3】。而胰岛细胞的移植仍面临着两大难题：一、供体来源不足，二、免疫抑制药物的长期使用。自体诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)l主l于不存在伦理和免疫排斥限制【4】，有望成为诱导胰岛素分泌细胞的种子细胞【31。但是iPSCs极低的诱导效率极大制约了其在临床糖尿病治疗中的应用，如何安全高效地将自体细胞转化为iPSCs并诱导分化为有功能的胰岛素分泌细胞成为制约这项技术发展的难点。非肥胖型糖尿病小鼠(Thenonobesediabeticmouse，NODmouse)来源于ICR鼠，是Makion等【5】于1980年通过近亲交配和选择繁殖的一组具有白内障倾向的自身免疫性糖尿病的动物模型，病状的特征为尿频、多饮、高血糖、尿酸强阳性、 摘要高胆固醇血症，是目前人类研究l型糖尿病的良好动物模型【61。本实验利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、Klf4导入NOD鼠尾成纤维细胞中，将其诱导为NOD．iPSCs，并对其干细胞标记的表达及全能性进行了分析鉴定。由于摒弃了原癌基因c．Myc，高了安全性。采用可拆分的半透膜相隔离设计【7J——建立一个胰岛细胞和iPSCs的共培养体系，在化学因子诱导分化【4J的基础上，让胰岛细胞更为精确地模仿胰腺生存的微环境，分泌可溶性因子作用于iPSCs。研究体外胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导是否具有更高的效率，并为之后胰岛素分泌细胞的分离纯化、功能检测、移植实验提供便利，建立优化的技术平台。第一部分目的：1．利用三因子(Oct4、Sox2、Klf4)构建NOD小鼠诱导性多能干细胞系。2．对所获得的iPSCs进行鉴定及全能性分析，以期获得与胚胎干细胞类似的多能干细胞。方法：1．制备逆转录病毒：包含Oct4，Sox2和Klf4三个基因的逆转录病毒质粒pMXs—Oct3、pMXs—Sox2、pMXs-Klf4及参照质粒pMXs—EGFP购自Addgene公司，使用DH5a细菌进行扩增后将4个质粒分别转染至逆转录病毒包装细胞Plat．E，48h后收集病毒上清，过滤、浓缩后用于感染鼠尾成纤维细胞。2．分离与培养NOD鼠尾尖成纤维细胞(tail．tipfibroblasts，TTFs)：无菌分离成年的NOD鼠尾真皮，37。C下5％C02孵育5d，在这期间成纤维细胞从尾组织中迁移出来，消化后接种至平皿培养。1．3代内的细胞用于iPSCs的诱导。3．逆转录病毒感染TTFs及生成iPSCs：将收集的病毒上清感染生长良好的TTFs，约1周时可首次看到iPS克隆，20d左右iPS克隆可长至足够大被挑取扩大培养。4．鉴定iPSCs的生物学特性：通过镜下观察、碱性磷酸酶染色、反转录PCRTl 硕士学位论文(RT．PCR)、免疫荧光实验及畸胎瘤形成实验等对iPSCs形态、多能性基因表达情况、干细胞表面标记及全能性等进行鉴定分析。结果：1．制备逆转录病毒：逆转录病毒质粒转染Plat．E细胞48h后，荧光显微镜下可见绿色荧光表达(pMXs—EGFP)，转染效率约在50—70％之问，细胞状态良好。2．分离与培养NOD．TTFs：TTFs原代培养在接种后3．4h贴壁，细胞呈长梭形、多边形或不规则形，中间1．2个圆形或卵圆形的核，原代TTFs杂细胞较多，随着传代次数的增多，其纯度增高，一般第二代后即可得到较纯的细胞。3．逆转录病毒感染TTFs及生成iPSCs：包含三个干细胞基因的逆转录病毒感染TTFs后大约一周左右可以在镜下首次看到iPS克隆，而后克隆继续增殖，12d左右形成肉眼可见的iPS集落，16．20d时克隆长至足够大，此时进行挑取、消化、接种至饲细胞上传代培养。4．鉴定NOD—iPSCs的生物学特性：从TTFs获得的iPSCs镜下观察呈典型的克隆状生长，圆形或椭圆形，与饲细胞分界清楚；RT-PCR、碱性磷酸酶染色及免疫荧光检测iPSCs高表达胚胎干细胞相关基因及蛋白；种植在免疫缺陷鼠体内能够形成向内中外三个胚层分化的畸胎瘤，表明iPSCs具有多潜能性。未感染逆转录病毒的TTFs不具有上述胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESCs)相关的细胞特性。结论：1．通过转导三个重编程因子(Oct4、Sox2、Klf4)可以将NOD鼠尾尖成纤维细胞诱导为多能干细胞，即NOD．iPSCs。2．NOD．iPSCs具有类似胚胎干细胞的生物学特性，并能维持长期多次传代，表明初步建立了NOD．iPS细胞系。关键词：NOD鼠，尾尖成纤维细胞(TTFs)，逆转录病毒，重编程，诱导性多潜能干细胞(iPSCs)III 摘要第二部分目的：1．体外将NOD—iPSCs诱导分化为胰岛素分泌细胞。2．采用大鼠胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导方法，建立一种更为安全、高效的诱导体系。方法：1．获取共培养所需大鼠胰岛细胞：6只SD大鼠隔夜禁食，麻醉后丌腹后沿大鼠胆总管内逆行注入预冷的0．5mg／ml胶原酶P溶液8～10ml，使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺。用Ficoll非连续密度梯度离心法纯化大鼠胰岛细胞。将获得的大鼠胰岛细胞种植于培养皿中，1640培养基+10％澳洲胎牛血清+2％双抗培养。用双硫腙(Dithizone，DTZ)染色检测胰岛的纯度，吖啶橙(AcridineOrange，AO)-碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)染色检测胰岛的活率。2．诱导iPSCs分化为胰岛素分泌细胞：实验分组：实验组：NOD鼠iPSCs+化学因子培养基+大鼠胰岛细胞共培养对照组1：NOD鼠iPSCs+化学因子培养基对照组2：NOD鼠iPSCs+胰岛细胞共培养+FP培养基培养，不加任何诱导剂。对照组3：单独培养NOD鼠iPSCs，不加任何诱导剂化学因子诱导法：第一阶段：将iPSCs种植在Matrigel基质胶(1：50)包被的培养mloo，Dfl2培养基(补充0．2％BSA，0．5xN2和O．5xB27)培养4天，同时加入诱导因子100ng／mlactivinA和luMwortmannin将其诱导成内胚层细胞。第二阶段：第4天更换培养基为F12／IMDM(1：1，补充0．5％BSA，0．5％ITS和0．5×B27)，并加入诱导因子2“MRA、20ng／mlFGF7及50ng／mlNOGGIN培养4天，将其诱导为胰岛内分泌细胞。IV 硕士学位论文第三阶段：第8天更换培养基为高糖DMEM(补充0．5％BSA，1％ITS和1×N2)，并加入50ng／mlEGF培养5天，促进胰岛祖细胞／胰岛内分泌细胞扩增。第四阶段：第13天更换培养基为DFl2，并加入1％ITS、10ng／mlbFGF、10mMnicotinamide、50ng／mlExendin-4和10ng／mlBMP2培养7-9天，促进胰腺内分泌细胞成熟。共培养方法：将iPSCs与大鼠胰岛细胞以半透膜相隔离，使两种细胞互不接触，培养液可以相互交流，大鼠细胞分泌的可溶性因子可以自由通过半透膜。将iPSCs接种于12孔板底层，培养，孔板中置入transwellinsert，在孔板上接种p细胞，insert直径选0．49m，保证细胞不能通过但培养液及可溶性因子可以通过。每10天更换一次新取大鼠胰岛细胞。3．检测胰岛素分泌细胞相关指标：通过形态学观察、双硫腙染色、RT-PCR、免疫荧光染色以及葡萄糖刺激试验检测诱导生成的细胞是否具有胰岛素分泌细胞的相关功能。结果：1．形态学观察及DTZ染色：诱导培养后，实验组及对照组1细胞逐渐聚集生长，约14天左右开始出现大小不一的细胞团。第20天时每个实验组Transwell培养体系及对照组1各有20---30个细胞团，形态不规则。富含锌离子的细胞团经DTZ染色后呈棕红色，其余细胞不着色。对照组2及对照组3未出现细胞团，细胞不着色。2．RT-PCR检测PDX．1表达：实验组及对照组l诱导后的细胞从第8天开始表达PDX．1蛋白，并且从第8天至第20天表达逐渐增强。对照组2及对照组3未见PDX．1表达。3．葡萄糖刺激胰岛素释放试验：实验组及对照组l细胞诱导培养第4、8、12、16、20天时，高糖刺激后可检测到胰岛素分泌，说明诱导后的细胞对葡萄糖刺激有反应，实验组和对照组1细胞诱导第8天时有微量胰岛素分泌，且实V 摘要验组高于对照组(P0．05)。对照组2，对照组3培养上清中未测到胰岛素分泌。证明实验组分泌胰岛素最多，对葡萄糖刺激反应最大，且实验组早于其他组别产生胰岛素分泌，差异有统计学意义(P<0．05)。4．免疫荧光染色：实验组及对照组l诱导后第20天的细胞表达胰岛素(绿色荧光)、C肽(红色荧光)。对照组2、3细胞不表达上述各种蛋白。结论：1．NOD．iPSCs能够在体外诱导生成类似体内的胰岛素分泌细胞，对高糖刺激有反应，具有储存分泌胰岛素的功能。2．大鼠胰岛细胞能分泌某些可溶性因子通过共培养体系加速分化进程，提高分化效率。因此，化学因子联合共培养体系为一种更为高效的诱导iPSCs分化为胰岛素分泌细胞的方法。关键i司：NOD鼠源诱导性多能干细胞(Thenonobesediabeticmouse-derivedinducedpluripotentstemcells，NOD．iPSCs)共培养胰岛细胞化学冈子胰岛素分泌细胞VI 硕士学位论文Combintion"thIsletCells。CoculturenationwithIsletellsinocultureandChemicalFactorsEnhanceInducedPluripotentStemCellsDerivedfromaType1DiabetesMouseModelDifferentiationtoInsulinProducingCellsinvitroName：YUDan—fengSupervisor：Prof．CAIDe-hongABSTRACTType1diabetesisallabsolutedeficiencyofinsulincausedbyhighglucoseasthecharacteristicsofthelifelongdisease，itsincidenceisincreasingatthespeedof3-5％．Currentlythereareabout20millionpeoplewithT1DMinTheworld，andatleast1millioninChina．Type1diabetesmellituspatientsrequirelifelonginsulintherapy，thereisnoeffectivemethodtocuretype1diabetes．Unreasonableinsulincomplementcauseshyperglycemiaorhypoglycemia．Andthenvariousofcomplicationsensue．Patientsoftensufferandhaveshortenedlifetime．Inordertoeffectivelycontrolbloodglucose，preventtheoccurrenceofcomplications，andimprovethequalityoflifeofpatientswithT1DM，replacedamagedthepatient’Sownimmunesystemcellsthatsecreteinsulin，isletcelltransplantationisbooming．Isletcelltransplantationstillfacestwomajorproblems：first，theshortageofdonor,two，long-termuseofimmunosuppressivedrugs．Autologousinducedpluripotentstemcells(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)duetothelackofethicsandimmunerejectionlimit，isexpectedtobecometheseedcellinducedbyinsulinsecretingcells．ButiPSCsverylowinducingefficiencygreatly ABSTRACTrestrictitsapplicationinclinicaltreatmentofdiabetes，howtoimprovethesafeandefficientautologouscellsintoiPSCsandinducedtodifferentiateintofunctionalinsulin-producingcellsbecomedifficulttorestrictthedevelopmentofthistechnology．Non-obesediabeticmice(Thenonobesediabeticmouse，NODmice)fromICRrat，madeoutbyMakionin1980throughtheanimalmodelofagroupofinbreedingandselectionbreedingwithcataracttendencyofautoimmunediabetessymptoms，characterizedbyfrequentmicturition，polydipsia，highbloodglucose，uricacidstronglypositive，hypercholesterolemia，isthegoodofhumantype1diabetesanimalmodel．Reversetranscriptionvirus3stemcellgeneOct4，Sox2，Klf4intoNODmousetailfibroblastswereusedintheexperiment，theinductionofNOD—iPSCs，andthestemcellmarkerexpressionandpluripotencyisanalyzed．Duetoabandontheprotooncogeneofc-Myc．it’Smoresafety．TheCO-culturesystemusingsemipermeablemembraneCanbesplitphaseisolationdesignof·-·-theestablisbanentofapancreaticisletcellsandiPSCs，baseddifferentiationinchemicalfactoLlettheisletcellsmoreaccuratelymimicsthemicroenvironmentofpancreassurvival，secretionofsolublefactorsiniPSCs．Studyofisletcellswereculturedandinducedbythecombinationofchemicalfactorismoreefficient．Andfortheseparationandpurification，aftertheinsulin-producingcellsinthefunctiontest，transplantationexperimentsprovideconvenient，establishingthetechnicalplatformforoptimization．Pluripotentstemcells，whichhavethepotentialtodifferentiateintoanyofthethreegermlayersandtheabilitytoself-renew,possesssignificantapplicationperspectiveandsuperiorityincellreplacementtherapy、genetreatmentanddevelopmentalbiologyandSOon．Atpresent，themostknownpluripotentstemcellsareembryonicstemcells，whichweregenerallygeneratedfromtheinnercellmassofblastocysts．ThePluripotentstemcellsalsoCanbeobtainedbysomaticcellnuclear 硕士学位论文transferorcellfusion．However,embryonicstemcellresearch，especiallyhumanembryonicstemcells，needstodestroytheembryooreggcells，thusraisesmanyethicalarguments，andmaysufferimmunerejectioninclinicalapplicationandsomeotherproblems．TheemergenceofiPScellsbringsthehopetosolvetheseabove’mentionedproblems．ComparedwithESCs，iPScellshaveuniqueadvantages：①iPScellswereinducedfromsomaticcells．therewerenoethicalproblemsthatESCsfaced；②iPScellshadawidevarietyofsources．theyCanbeobtainedfrompatients’somaticcells(includinglesionsomaticcells)，tomeetthelargenumberrequirementsintheclinicaltransplantationtreatmentbyclonalproliferation．③TheiPScellsfrompatientsCanavoidtheproblemofimmunerejectionwhichhadbeentroubledtheregenerativemedicine．Therefore，sincetheappearanceofiPStechnology,tremendousprogresshadbeenmadeinthestudyoftheinductionefficiency,safetyandclinicalapplications．Thus，theNODmousepresentsanopportunitytotesttheeffectivenessofinducedpluripotentstemcells(iPSCs)asatherapeuticmodalityforT1DM．Inthisstudy，weintroduced3factors(Oct4，Sox2andKlf4)intothetail-tipfibroblasts(TTFs)ofNODmousebyretrovirusinfectionandsuccessfullyobtainediPScellsderivedfromTTFs．ThenanalyzedandidentifiedtheexpressionofstemcellmarkersandpluripotencyoftheiPScells．PART1Objective：1．Togenermetheinducedpluripotentstemcells(iPSCs)fromNODmouseTTFsbyintroducing3definedfactors，Oct4、Sox2、Klf4．2．ToanalyzeandidentifythebiologycharacteristicsoftheiPScells，includingtheexpressionofstemcellmarkers，pluripotencyandSOon．Inordertoobtain ABSTRACTpluripotentstemcellssimilartoembryonicstemcells．Methods：1．Preparationoftheretrovirus：Theretroviralvectors，containingthethreegenesofOct4，Sox2andKlf4，pMXs-Oct3、pMXs—Sox2、pMXs-Klf4andReferenceplasmidpMXs—EGFPwereboughtfromtheAddgenecompany．ThenthefourplasmidswereamplifiedbyDH5abacterial，followingtransfectthefourplasmidsintotheretroviruspackagingcells，Plat-Ecells．48hoursaftertransfection，CollectedviralsupematantsandthenusedforinfectionofTTFsafterviralsupernatantswerefilteredandconcentrated．2．IsolationandcultureofmouseTTFs：SterileseparatedNODmouseTTFs．Digestedcellsintosinglecellsuspensionandthenplantedthecellsuspensionto100．mmtissueculture．Thecellswithin3generationsCanbeusedforinductionofiPScells．3．RetroviralinfectionofTTFsandiPScellsgenerated：CollectedtheviralsupematantfromthePlat—EdishandtheninfectedTTFsingoodcondition．Changedthemediumeverydayuntilthecoloniesbecamebigenoughtobepickedup．Coloniesshouldfirstbecomevisibleapproximatelyaweekaftertheretroviralinfection．Theyshouldbecomelargeenoughtobepickeduparoundday20．4．IdentificationofbiologicalCharacteristicsofiPScells：Analyzedthemorphology,pluripotencygeneexpression，stemcellsurfacemarkersandpluripotencyoftheiPScellsMicroscopy,alkalinephosphatasestaining，reversetranscriptionPCR(RT-PCR)，immunofluorescenceassayandteratomaformation．Resuits：1．Preparationoftheretrovirus：48hoursafterthefourretroviralvectorstransfectedintothePlat-Ecells，greenfluorescentproteinCanbevisibleunderafluorescence 硕士学位论文microscope(pMXs·EGFP)，withthetransfectionefficiencyabout50—70％．AndthePlat-Ecellswereingoodcondition．2．Isolationandcultureofmouseembryofibroblasts：TheprimaryTTFscultureadhered3-4hafterplanted，andthecellswerefusiform，polygonalorirregularinshape，inthemiddleofcellstherewere1-2roundorovalnucleus．TheprimaryTTFscontainedlotsofhybridcells，Withtheincreaseofpassages，thecellpurityincreased．Generally,relativelypurecellscanbeobtainedafterthesecondgeneration．3．RetroviralinfectionofTTFsandiPScellsgenerated：iPScoloniesshouldfirstbecomevisibleinthemicroscopeapproximatelyaweekaftertheretroviralinfectionofTTFs．Andthentheclonescontinuedtoproliferate，about12dformediPScoloniesvisibletothenakedeye．Thecoloniescouldgrowtolargeenoughwhen16-20days，andthenpickedtheiPScoloniesandplantedtofeedcellsforpassagedculture．4．IdentificationofbiologicalCharacteristicsofiPScells：TheiPSCsgeneratedfromtheTTFsshowedthetypicalclone-likegrowthobservedundermicroscope，roundoroval，andhadclearboundarieswithfeedingcells．RT-PCR，alkalinephosphatasestainingandimmunofluorescencestainingdemonstratedthatiPScellsexpressedembryonicstemcellgeneandprotein．TeratomaformationassaysindicatedtheiPSCspossessedtheabilitytodifferentiateinto3-germlayersbothinvivoandinvitro．Asacontrast，theTTFsnotinfectedwiththeretroviraldidnothavetheseabove．mentionedEScellcharacteristics．Conclusion：1．TheiPScellsCanbeinducedbytransductionthreereprogrammingfactors(Oct4，Sox2，Klf4)intomouseembryonicfibroblasts．2．TheiPScells，withES-likebiologicalcharacteristics，canbelong-termpassagedV ABSTRACTandmaintainedthepluripotency，whichmeansthemouseiPScelllinesarepreliminarilyestablished．KEYWORDS：tail-tipfibroblasts(TTFs)；Retrovirus；Reprogramming；Inductionofpluripotentstemcells(iPSCs)obieetive：PART2ThisstudyistodevelopahighlyefficientapproachtoinduceiPSCsderivedfromNODmousecellstodifferentiateintoinsulinproducingcells(IPCs)invitro．Methods：WedevelopedacoculturesystemofRatisletcellsandNODmouse—derivediPSCs(NOD-iPSCsl、析thtranswellinsert．TheNOD-iPSCswereinducedintoIPCsusingchemicalfactorsunderafour-stageprotoc01．Theidentificationofthefunctionoftheinducedcellswereperformedbyobservingmorphologicalchanges，dithizone(DTZ)staining，RT-PCRdetermining，immunofluorescencestaining，testingglucose-simulatedinsulinsecretionbyELISA．Theresultsalsocomparedwiththegroupofonlyusingchemicalfactors．Results：Afterbeginningdifferentiationabout14days，morphologicalchangesofformingclustersgraduallywereobservedfollowinginductionunderaninveaedmicroscope．AndDTZ—stainedcellclustersformed．ThemRNA(PDX一1)associatingwithpancreaticprogenitorcellswasexpressedbyRT-PCRtechnologyfromday8today20．InsulinandC—peptideincellswasexaminedbyimmunocytochemistry．Comparedwiththegroupofonlyusingchemicalfactors，thegroupofcocultureandchemicalfactorsreleasedmoreinsulinandalsoearlierin 硕士学位论文responsetoglucose，thedifferencewassignificant(P<0．05)．Conclusion：WedevelopedamethodforstepwisedifferentiationofNOD-iPSCsintoIPCscombiningwithisletcellsincocultureandchemicalfactorsinvitro．TheseIPCsCanstoreandreleaseinsulininresponsetoglucose．RatisletCansecretesomesolublefactorswhichenhancetheefficiencyofthedifferentiation．Thiscombinationmethodseemstobeamoreeffectiveprotoc01．WeproposethatNOD—iPSCswillprovideausefultoolforinvestigatinggeneticsusceptibilitytoautoimmunediseasesandgeneratingacellularinteractionmodelofT1DM，pavingthewayforthepotentialapplicationofpatient—derivediPSCsinautologousbetacelltransplantationfortreatingdiabetes．KEYWORDS：Thenonobesediabeticmouse—dedvedinducedpluripotentstemcells．NOD-iPSCs；Coculture；Isletcells；Chemicalfactors；Insulinproducingcells；Vll 硕士学位论文目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯i前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1刖舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、Klf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析⋯．．7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．24结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．30第二部分体外化学因子及共培养联合诱导小鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一31实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．36结j沧⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39讨{沦⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一45附录：英文缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5l硕士期间论文发表情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．53南方医科大学学位论文原创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55 硕士学位论文前言1型糖尿病是一种体内胰岛素绝对缺乏所导致的以高血糖为特征的终身性疾病，其发病率正在以3-5％的速度逐年提高⋯。目前1型糖尿病患者在全球大约有2000万，中国至少有100力．。典型l型糖尿病的特点包括发病年龄较轻，起病迅速，“三多一少”等症状明显，常有自发酮症倾向，胰岛素分泌显著下降甚至缺失，需终身胰岛素治疗维持生命，目前尚没有有效的手段根治1型糖尿病，不合理的胰岛素补充所导致的高血糖或低血糖现象严重，以致各种并发症接踵而至，患者寿命普遍缩短。为了有效控制血糖，防止糖尿病并发症的发生，提高糖尿病患者的生存质量，替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞，胰岛细胞移植蓬勃兴起【2’3】。如何高效获得可供移植的胰岛细胞成为研究热点。1．体细胞重编程生成多潜能干细胞的策略通过从患者自体获得的细胞，并将其诱导产生多潜能干细胞是再生医学最理想的途径。目前研究采用的成体细胞重编程方法主要有以下几种pJ。一、体细胞核移植(SomaticCellNuclearTransfer，SCNT)：将成体细胞核利用显微注射技术注入一个去核卵细胞中，将其移植入代孕母体中可形成克隆，或通过在体外培养可获得与该成体细胞基因型完全匹配的ES细胞。然而，细胞核重编程的效率会随着供体细胞的分化程度加深而降低pJ，存在技术难度大、效率低、克隆动物早死或发育异常以及论理学限制等问题，使其在临床的应用受到质疑。二、细胞融合(cellfusion)：将多潜能ES细胞与分化的细胞融合，诱导重编程。这种方法产生的融合细胞具有ES细胞一样的特性，但这种细胞融合效率极低，且产生的是四倍体，不管是在细胞替代治疗，还是在发育生物学研究中都有很大的局限性[10J。三、细胞提取物(cellextract)：将成体细胞核暴露在卵母细胞或ES细胞提取物中。这种方法有助于在生化水平和动态分析重编程过程，但这种方法不能形成稳定的重编程，不能改变细胞的命运。四、细胞外植培养(cellexplantation)： 前言在体外适当的条件下培养提取得到生殖细胞，挑选重新获得多潜能性的永生化细胞系。缺点是获取生殖细胞要求有创性的手术，且可能只限于生殖细胞⋯J。上述方法均可获得多潜能干细胞，但这些方法在技术、细胞来源、免疫排斥、伦理等方面都遇到了障碍，从而限制了这些多能性细胞在理论研究和治疗上的应用。2006年R本京都大学ShinyaYamanaka通过将特定的细胞因子导入成体细胞，成功的诱导为ES样干细胞lI川，并将其命名为诱导性多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)。该技术操作较简单，而且不需要使用卵细胞或胚胎细胞，从而巧妙地避丌了胚胎干细胞研究应用带来的伦理道德问题，因此iPSCs的诞生为干细胞研究带来了新的希望，被誉为生命科学领域的里程碑。2．重编程所需转录因子的选择直接将体细胞重编程为多能干细胞为再生医学提供了极其宝贵的资源，使得用非胚胎材料获得病人特异的任何谱系的细胞成为可能。现行的获得诱导性多能干细胞的方法各异，但其核心都依赖于一组经选择的转录因子。2006年，由日本科学家ShinyaYamanaka在日本京都大学首先建立了iPS细胞技术【l纠(即将成熟分化的体细胞重编程为胚胎样干细胞的技术)。Takahashi矛lYamanaka选择24种在小鼠早期胚胎、ES细胞或者肿瘤细胞中丰富表达的转录因子，通过筛选、组合，发现用Oct4．Sox2．c．Myc和Klf4四个因子(这4个因子也被称为Yamanaka因子)可以有效地将胎鼠成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast，MEF细胞)和小鼠尾尖成纤维细胞(TTFs)诱导形成形态和生长特点类似ES细胞的克隆，l[JiPSCs。这些iPSCs表达ES细胞的特异性标志基因；免疫缺陷型小鼠皮下注射iPSCs可以发生畸胎瘤，且畸胎瘤中有来自3个胚层的组织；注射iPSCs至tdx鼠囊胚中也可形成嵌合体。但尚未能形成存活的嵌合体小鼠，而且没有生殖系转移的能力。说明这些iPSCs有一定的多潜能性，但与ES细胞还是有较显著的差别。后续的研究优化了这一技术，同时通过一组严格的分析，证明iPSCs与胚胎干细胞极其类似。iPSCsi邑够发育、分化成体内的所有细胞，包括可生育的配子细胞，2 硕士学位论文[iPiPSCs是全能干细胞【13·151。Yamanaka当初确定的四因子中Oct4是第一个被确定为多能性主要调节者的基因。Nichols等人表明【161，Oct4缺陷的胚胎能够发育至囊胚阶段，但内细胞团细胞并不具有多能性。Oct4的表达谱表明，它可能调节细胞早期发育的命运。胚胎干细胞中，0ct4似乎以剂量依赖性的方式调节细胞命运【171。0ct4的活动水平觉定了胚胎干细胞的三个不同的命运：1)表达量增加2倍将会使ES细胞转化为原始内胚层和中胚层；2)抑StJOct4会诱导滋养外胚层的形成；3)只有一个最佳数量的Oct3／4可维持干细胞自我更新。这些结果表明，胚胎干细胞拥有一个形成网络的调节机制来保持Oct4表达处于最佳水平，从而确保多能性。Nanog是较新发现的一个维持ES细胞亚全能性的关键基因，Chambers等(18】的研究提示Nanog可能参与调节Oct4的表达。根据TirNanog的名字命名的Nanog，被发现具有在缺乏白血病抑制因子(LIF)的情况维持干细胞自我更新的能力。裴端卿等【19】做的一个报告基因分析表明，Nanog拥有两个强大的转录激活子，这暗示NaJlog可能激活Oct4表达。众多研究表明，对于Oct4启动子，Nanog是一个强有力的激活子，并由此参与调节胚胎干细胞Oct41燃t201。Sox2往往与Oct4一起调节基因的表达【2¨，例如0ct4、Sox2参与了Fgf4表达的调节。基因敲除实验表明：Sox2是上胚层和胚外外胚层形成所必需的，这表明Sox2和Oct4共同参与指定胚胎着床时多能干细胞的命运。Sox2对于调节多个影nlfiJOct4表达的转录因子是必要的，以此维持必要水平的0ct4表达并稳定胚胎干细胞的多能性状态【221。c．Myc是一种原癌基因，其编码蛋白的靶基因中很多促进细胞增殖与转化【231。c．Myc蛋白可能诱导广泛的组蛋白去乙酰化【241，JA而iLoct3／4与Sox2绑定至特异位点。KIf4且1]Krfippel-1ikefactor4，KIf4在分化的有丝分裂后的皮肤和消化道上皮细胞中高表达。Klf4既是肿瘤抑制因子，又是致癌基因。在培养细胞中表达3 前言KIf4能抑制DNA合成和细胞周期的进行【251。3．iPSCs：研究进展iPS出现时间不长，便已在提高效率和应用到各种模式生物上取得了很大进展。美[]Scripps研究所的丁胜研究员在CellStemCell上报道了利用Oct4矛Idx分子将人的体细胞重编程为iPSCs【261。周琪及曾儿一【27】等人构建了37株iPS细胞系，然后把其中6株的iPSCs分别注入1500多枚四倍体囊胚，最终孕育出世界上第一批完全由iPSCs孕育而成的活体小鼠，有力地证明了iPSCs具有和ESCs一样的“全能性”。其他如在单基因(Oct4)诱导【2引、联合使用如维生素C【291、多西环素、丙戊酸等多种化学小分子诱导等【14·30】诸多方面亦获得了突破性进展，极大的提高了iPS技术的安全性及诱导效率。2008年weraig等【31】将iPS诱导分化为神经祖细胞和多巴胺能神经元，后者植入帕金森模型小鼠的纹状体后能改善症状。哈佛大学研究小组p刮通过iPS技术将肌肉萎缩性侧索硬化患者的病态细胞转化为诱导多能干细胞，并最终在体外分化为正常的运动神经元。2008年KeisukeTateishi首次使用人皮肤成纤维细胞来源的iPSCs定向分化为胰岛样细胞【j川。4．iPSCs转化为胰岛样细胞的应用研究现状iPSCs在形态学、表观遗传学、全基因表达谱及分化潜能方面与ES细胞极其相似，并且由于其个体特异来源性，使之可避免伦理及免疫排斥问题，因此iPSCs成为细胞治疗以及组织器官再生领域最有前景的种子细胞之一。目前，模拟体内胰岛B细胞发育过程是最常采用的定向诱导分化策略。2006年，D·Amour等【341改良了的5步法体外诱导定向分化方案(即hES细胞_定型内胚层_肠管内胚层_胰腺内胚层和内分泌前体细胞一表达激素的内分泌细胞)可将hES细胞诱导分化为能够产生胰岛素、胰高糖素、生长抑素、胰多肽的胰腺内分泌细胞，这些细胞的胰岛素合成接近成人胰岛的水平，但C．肽释放能力仅类4 硕士学位论文似于胎儿胰岛13细胞。随后的研究证实，上述方案中的诱导因子活化素A(activinA)和全反式维甲酸在干细胞向定型内胚层分化和随后向胰腺内分泌前体细胞分化中分别发挥了至关重要的作用，并且分化后的胰岛素分泌细胞移植到糖尿病小鼠体内具有明显的降血糖效应【35,36】。另有报道显示，一些小分子化合物也可调控ES细胞的分化，如定型内胚层诱导因子l(inducerofdefinitiveendoderm1，IDEl)和IDE2可成功诱导小鼠ES和hES细胞向定型内胚层分化，效率要高于活化素A137J，利用小分子物质IndolactamV可促进定型内胚层细胞高效率地转化为胰腺前体细胞13引。2009年，邓宏魁等提出较为高效的利用化学因子将人iPSCs诱导为成熟的胰岛素分泌细胞的四步诱导法【39J。2011年，HirokiSaito等证明用iPSCs在体外可以诱导为有功能的具有3D结构的胰岛细胞【401。同年，Tayaramma等的实验通过在常规的诱导途径中加用了indolactamV(ILV)和胰高血糖素样肽．1(GLP．1)，完善了人iPSCs诱导为胰岛样细胞的技术平台【4¨。此外，采用小鼠胚胎胰芽制备含有可溶性因子的条件培养基1421，或者与小鼠D细胞株共培养【43】，可在体外诱导小鼠ES细胞定向分化为胰岛素分泌细胞。采用大鼠胰腺部分切除后的再生胰腺组织制备的条件培养基，可诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞ⅢJ。与成年小鼠离体胰岛、离散胰岛细胞或小鼠B细胞株共培养，可促进胰腺干细胞分化为成熟B细胞【4引。以上研究均表明：iPSCs可成功地被诱导分化为胰岛样细胞，为大量生成iPS源性的符合临床需求的胰岛素分泌细胞提供了基础及理论支持。综上所述，发育和增殖中的胰岛组织存在能够促进干细胞向胰岛13细胞分化的重要诱导因子，干细胞与其分化微环境之间的相互作用是决定干细胞向胰岛B细胞分化和成熟的关键因素。因此，条件培养基、与胰岛组织共培养等方法有望成为诱导干细胞进一步分化成熟的新策略。5．本研究目的与意义本研究旨在通过逆转录病毒介导的方法将三个干细胞因子Oct4，Sox2和Klf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞，诱导其重编程为多潜能干细胞(iPSCs)，并对其生 前言物学特性进行分析鉴定，以获得能够稳定传代的类ES细胞NOD．iPS干细胞系。建立一个大鼠胰岛细胞和小鼠iPSCs的共培养体系，在化学因子诱导分化的基础上，让胰岛细胞更为精确地模仿胰腺分化发育的微环境，分泌可溶性因子作用于iPSCs。研究共培养体系下诱导生成胰岛样细胞的效率，建立优化的技术平台，以期找到更为高效的诱导分化方式，并为之后目的细胞的分离纯化、功能检测、移植实验提供便利，为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病的临床应用打下基础。6 硕士学位论文第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、Klf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析材料与方法1．实验材料1．1实验动物与细胞来源(1)NOD鼠：SPF级，购买于中山大学实验动物中心提供。(2)免疫缺陷鼠(裸鼠)：SPF级，由南方医科大学实验动物中心提供。(3)逆转录病毒包装细胞plat．E：由本实验室保存提供。1．2逆转录病毒质粒载体及菌株包含Oct4，Sox2和Klf41Ⅱt个基因的逆转录病毒质粒pMXs—Oct3、pMXs-Sox2、pMXs—Klf4及参照质粒pMXs-EGFP从美国Addgene公司购买。大肠埃希菌(Escherichiacoli)DH5a株为本式实验室保存提供。1．3主要试剂试剂名称生产商非必须氨基酸溶液(NonessentialAminoAcids)美[]Invitrogen公司DMEM高糖培养基(含葡萄糖4．59／L)美[]Invitrogen公司去钙镁PBS溶液美国Invitrogen公司0．25％胰酶／lmMEDTA溶液美国Invitrogen公司2-巯基乙醇(beta．mercaptoethan01)美[]Invitrogen公司L．谷氨酰胺(L．Gin)美[]Invitrogen公司青霉素／链霉素美[]Invitrogen公司胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)美[]Invitrogen公司7 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、KIf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析嘌呤霉素(Puromycin)明胶(Gelatin)灭瘟素(BlasticidinShydrochloride)海地美溴铵(Polybrene)Fugene6转染试剂丝裂霉素C(MitomycinC)LIF，LeukemiaInhibitorFactor二甲亚砜(DMSO)Triton．X100碱性磷酸酶染色试剂盒焦碳酸二乙酯(DEPC)去内毒素质粒提取试剂盒(大提)质粒提取试剂盒(小提)SSEA_l鼠抗、Nanog兔抗Alexa标记羊抗鼠、兔二抗BSA(牛血清白蛋白)Trizol试剂DNALadderMarkerRT-PCR试剂盒TaqDNA聚合酶dNTPMixture无RNA酶水德国Sigma公司德[]Sigma公司德I雪Sigma公司德[]Sigma公司瑞士Roche公司美国Chemicon公司德[]Sigma公司北京鼎国公司德国QIAGEN公司Promiga公司美国Abcam公司美[]Invitrogen公司大连Takara公司1．4主要器材名称厂家细胞培养皿(各规格)细胞培养板(各规格)O．22um孔径过滤器美国Coming公司美国Millipore公司8 硕士学位论文0．451am孑L径醋酸纤维酯膜滤器无RNA酶的枪头(各规格)SmartSpecTM3000紫外分光光度计UV-3000型紫外分析仪GSG凝胶图像分析管理系统T-GradientThermoblockPCR扩增仪JYZOOC水平电泳仪Mifli．6K微型离心机WP700PZI微波炉Sigma3K18式高速低温冷冻离心机TS．1型脱色摇床PIPETMAN(亘)移液器BCD．58～C冰箱MDF．382E超低温冰箱HHBl1500电热恒温烤箱HWSl2型电热恒温水浴锅SKY-200B恒温培养摇床PYX．YDH恒温培养箱QL．901旋涡混合器PB．20标准型PH计HV-50高压蒸气灭菌锅电磁炉WCJ．802型控温式磁力搅拌器FA2004型电子天平SW二CJ．1F型洁净工作台1285型ClassIIA／B3生物安全柜美国Millipore公司美国Axygen公司美国Bio—Rad公司珠珠海黑马医学仪器有限公司珠海黑马医学仪器有限公司德国Biometra公司北京君意东方电泳设备有限公司珠海黑马医学仪器有限公司佛山格兰仕集团德国Sigma公司江苏海门市麒麟医用仪器厂法国GILSON公司青岛海尔股份有限公司同本SANYO公司广州医疗设备厂上海一恒科技有限公司上海苏坤实业有限公司上海市跃进医疗仪器一厂江苏海门市麒麟医用仪器厂德国Sartorius公司日本HIRAYAMA公司佛山美的集团江苏泰县姜捻无线电厂上海良平仪器仪表有限公司苏州安泰空气技术有限公司美国FormaSeientifie公司9 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2．KIf4导入NOD鼠尾尖戊纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析1．5溶液及培养基配制明胶铺被培养皿先准备10×浓度(1％w／v)的明胶储备液：将19明胶粉末溶解于100ml蒸馏水中，高压灭菌后4"C下保存。准备O．1％(1×)明胶溶液：将50ml上述lOx的明胶溶液微波加热溶解后加于450ml蒸馏水中混匀即得，滤过除菌后4"C保存。明胶包被：在平皿中加入足够体积的明胶溶液以铺满底部，一般对于35．，60．，100．nlm的平皿分别加l，3，5ml左右的明胶，在37"(2下孵育至少30min，用前吸去多余的液体。O．5％胰酶／5．3raMEDTA溶液制备0．05％胰酶／0．53mMEDTA：将10ml0．5％胰酶／5．3mMEDTA溶液加入90mlPBS中混匀即可。制备0．1％胰酶／lmMEDTA：将20ml0．5％胰酶／5．3mMEDTA溶液加入80mlPBS中混匀即可。分装后--20℃下保存。琼脂糖凝胶电泳缓冲液5xTBE缓冲液：Tris549，硼酸27．59，0．5mol／LEDTA20ml(3．729)，加800ml灭菌超纯水，加热溶解后，定容至1L，调节PH至8．0．8．3。50xTAE缓冲液：Tris2429，冰乙酸57．1ml，O．5mol／LEDTA100ml(18．69)，加800ml灭菌超纯水，加热溶解后，定容至lL，调节PH至8．0。1％BSA封闭液牛血清白蛋白lg，D．PBS100ml，充分溶解后，每支lml分装，--20℃保存备用。0．2％TritonX．100TritonX．1000．2ml，D．PBS100ml，充分混匀，4"C保存。嘌呤霉素嘌呤霉素用蒸馏水溶解使其终浓度为10mg／ml，0．22¨m过滤除菌分装，--20℃下保存。稻瘟霉素溶于蒸馏水中使其终浓度为10mg／ml，0．22“m过滤除菌分装，--20oc下保存。聚凝胺将0．89的聚凝胺溶于10ml蒸馏水中制成lOx(80mg／m1)储备液。1×工作液：lml的lOx储备液加9ml蒸馏水稀释，0．22um过滤除菌，4℃下保存ES培养基DMEM含15％FBS(v／v)，2mML．Gin，1×10叫M非必需氨基酸，l×1010 硕士学位论文-4M2．巯基乙醇，50U／ml青霉素和50mg／ml链霉素。500ml的该培养基按以下比例配制：75ml胎牛血清FBS，5mlL．Gin，5ml非必需氨基酸，lml2．巯基乙醇，2．5ml青／链霉素，最后用DMEM定容至500ml，混匀即可。40C下保存一星期。FP培养基(成纤维细胞和Plat．E细胞用)DMEM含10％FBS，50U／ml青霉素和50mg／ml链霉素。500ml的该培养基按以下比例配制：50ml胎牛血清FBS，5ml非必需氨基酸，2．5ml青／链霉素，最后用DMEM定容至500mI，混匀即可。4"C下保存一星期。对于Plat．E细胞，每10mlFP培养基中需加入1Hl浓度为10mg／ml嘌呤霉素储备液和10}al浓度为10mg／ml稻瘟霉素溶液。细菌培养基LB(LuriaBroth)液体培养基：1％胰蛋白脉，O．5％酵母提取物，10／oNaCI，调pH值至7．0，加灭菌超纯水定容至1000ml，高压灭菌(103．43Kpa)20min，40C保存。LB固体培养基：1％胰蛋白脉，O．5％酵母提取物，I％NaCI，1．5％琼脂粉，调pH值至7．0，加灭菌超纯水定容至1000ml，高压灭菌(103．43Kpa)20min，待冷却到50．60"C时，无菌操作倒普通平板，4"C保存。LB(Amp+)液体培养基：含氨苄青霉素(Amp+)100州ml的LB液体培养基，40C保存。LB(Amp+)匿I体培养基：含氨苄青霉素(Amp+)100I．tg／ml的LB固体培养基，40C保存。4％多聚甲醛在放置磁力搅拌棒的容器中，将4克多聚甲醛(EM级)溶解于100mlPBS，加入数滴lN的NaOH溶液，在通风厨中60℃加热(打开瓶盖)使溶解，冷却至室温，调整PH值为7．4，使用前新鲜配制。lOOxMitomycinC2mg的mitomycinC用2ml灭菌超纯水溶解，0．5ml／分装，铝箔纸包裹，40C保存2周使用。1．6所用引物名称及序列 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2，KIf4导入NOD鼠尾尖戊纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析产物引物名称引物序列退火(bp)Esgl-FGAAGTCTGGTTCCTTGGCAGGATG56℃230Esgl-RACTCGATACACTGGCCTAGCFgf4·FCGTGGTGAGCATCTTCGGAGTGG55℃196Fgf4一RCCTTCTTGGTCCGCCCGTTCTTANanog-FAGGGTCTGCTACTGAGATGCTCTG56℃363Nanog-RCAACCACTGGTTTTTCTGCCACCGNrobl(Daxl)-FTGCGGTCCAGGCCATCAAGAG56℃232NrObl(Daxl)-RGGGCACTGTTCAGTTCAGCGGATCUtfl．FGGATGTCCCGGTGACTACGTCTG54℃343Utfl．RGGCGGATCTGGTTATCGAAGGGTOct3／4(end)一FTCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC59℃223Oct3／4(end)一RTGCGGGCGGACATGGGGAGATCCZfp42(Rexl)·FACGAGTGGCAGTTTCTTGGGA58℃286Zfp42(Rexl)一RTATGACTCACTTCCAGGGGGCACTSox2(end)·FTAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA58℃296Sox2(end)一RTTGCCTTAAACAAGACCACGAAANacl．FCCACAATGAAGAGGACGAAG60℃157Nacl．RTTGCCAATCTGGTTGATAAGTOapdh-FGGCACAGTCAAGGCTGAGAATG55℃142Gapdh-RArGGTGGTGAAGACGCCAGTA2．实验方法2．1逆转录病毒质粒的准备2．1．1质粒pMXs-Oct3、pMXs-Sox2、pMXs-KIf4及参照质粒pMXs-EGFP转化感12 硕士学位论文受态大肠杆菌(DH5n)(1)从．70。C冰箱中取出感受态细菌，握于手心融化后立即放至冰浴10min。(2)准备1．5mlEP管，每管中加入感受态细菌509l，将质粒稀释50倍后加109l至EP管中，将EP管内容物混匀，放置冰水中30min。(3)从冰水中取出EP管立即放入预加热至42。C的循环水中，刚好放置90s，不要移动管。(4)快速将管转移至冰浴，冷却3min。(5)没管加800“lLB培养基，水浴加热至37℃，后将管转移至U37"C摇床，150r／min，孵育45min。(6)取适量已转化的感受态细菌均匀涂布LB／Amp琼脂平板培养基，37。C过夜培养。2．1．2pMX质粒DNA的小量提取与鉴定(1)菌液的准备：从LB／Amp平板挑取单克隆菌落于3mlLB／Amp液体培养基中，置于37。C摇床过夜培养(12．16h)，此时细菌生长至稳定期，菌液厚重、浑浊。(2)将3ml培养过夜的阳性菌在室温(24℃)下10000xg离一t]'10min。弃上清，将离心管倒置至吸水纸上去除剩余水分。(3)加入250“l重悬液，振荡至完全重悬。(4)加入250¨l细胞裂解液，颠倒离心管6～8次，彻底混匀。室温孵育5min。(5)加入350“l中和液，立即颠倒离心管6～8次，彻底混匀。(6)室温下10000×g离心细菌溶解产物20min，上清移至新的1．5ml离心管，再次离4二,20min，将上清移至新离心管。(7)彻底摇匀除内毒素树脂，加50¨l到离心管中，室温孵育10min，在孵育过程中每隔3minN烈振荡5sec。(8)将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30sec，吸取上清至新离心管，弃去沉淀。13 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4，Sox2，Klf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析(9)加入200“lGTC(5M／L)，与上步分离的上清剧烈振荡混和。如果GTC产生沉淀，37℃加温10min，冷却到25℃使用。(10)彻底重悬磁珠，加150ul至溶液中，剧烈振荡混和，室温孵育2～3min。(11)将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30sec，弃上清，离心管继续放置2"--3min，去除剩余液体。(12)将离心管从磁架上取出，加入200gl4／40洗脱液。剧烈振荡15see重悬磁珠微粒。4／40洗脱液可以去除无关蛋白，如核酸酶。(13)将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30sec，弃上清，离，t7管继续放置2-～3min，去除剩余液体。(14)将离心管从磁架上取出，加入1．0ml80％乙醇洗涤微粒。剧烈振荡10sec，将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30sec，弃上清，离心管继续放置2"～3min，去除剩余液体。(15)重复操作步骤(13)两次。(16)洗涤完最后一遍后，打开离心管盖，放置在磁珠分离架10min，去除残余液体。(17)将离心管从磁架上取出，加入240gl去离子水，振荡10sec，在室温孵育lmin。将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置3min后，将上清小心移至新离心管中。140009离一l二,10min，上清移至新管中，同时计算上清体积。(18)加入0．5体积醋酸铵(7．5M／L)和2．5体积95％乙醇，混匀后室温下14000xg离一t715min。d,,t7吸出上清，用lml70％乙醇洗涤沉淀，室温下14000xg离心5min。小心吸去上清，空气中干燥5min，用30”l去离子水溶解。(19)分别取lul，2ul，3ul反应产物电泳，估计质粒浓度。14 硕士学位论文(20)用分光光度计测OD值及核酸浓度，并送公司测序鉴定。2．1．3pMXs质粒扩增与大量抽提(A)细菌培养、收获和裂解(1)新鲜培养板中挑取单克隆于2．5mlLB培养基，37。C，300rpm培养8h。(2)取100．200ul上述菌液接种于100mlLB培养基接种于LB培养基，37℃，300rpm培养14．16h。(3)将获得的菌液4"C，60009离，t],15min。(4)加入10mlBufferP1充分重悬菌斑。(5)加入10mlBufferP2，轻柔颠倒4—6次混匀彻底，室温(15．25℃)孵育5min。(6)加入10mlBufferP3，立刻轻柔颠倒4．6次彻底混匀，冰上孵育20min。(B)细菌裂解物过滤、收集、清理(7)将细菌裂解物倒入随试剂盒提供的注射后针筒内，在室温下静置10min，再次期间不要插入活塞，室温孵育完后，取下注射器前的旋帽，并将注射器活塞轻轻推入针筒内，将针筒内细菌裂解物过滤到一个50ml的离心管。(8)Dn2．5mlBufferER至滤过液中，上下颠倒约10次混匀，然后置于冰上孵育30min。(C)用QIAGEN-tip绑定、清洗和洗脱质粒DNA(9)向QIAGEN—tip500qhJJIl／k10mlBufferQBT平衡柱子，通过重力使其自然流空。(10)将从第8步获取的上清移入柱子，使其自然流下通过滤膜。(11)用2X30mlBufferOC冲洗柱子。(12)用15mlBufferQF洗脱DNA。(D)沉淀、清洗、溶解DNA(13)加入10．5ml(0．7倍体积)室温异丙醇到洗脱液中沉淀DNA。立刻混匀，4℃，不低于150009离一t),30min。小心弃上清。(14)jJfl／X．5ml室温70％酒精，不低于150009离，t二,10min。小心弃上清避免碰到沉15 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、KIf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析淀。(15)空气中干燥沉淀5．10min，用合适体积的质粒溶解液(TE，PH8．0或Tris．CI，PH8．5)溶解DNA。2．2iPSCs系的构建和培养2．2．1NOD鼠TTFs分离培养：(1)从成年NOD鼠上切下尾巴，PBS清洗。(2)用注射针头在鼠尾上做纵向切口，手工剥离表面真皮，在用剪刀把剩余部分剪成lmm2大小碎块。往六孔板(事先明胶包被)的每个孑L；0112块碎片和2mlMF．stat培养基，37*(2下5％C02孵育5d。在这期间成纤维细胞将从尾组织中迁移出来。(3)用无菌镊把尾组织碎块取出，丢弃。把MF．stat培养基换成2mlFP培养基，继续培养至细胞融合。(4)吸去培养基，每孔用2mlPBS漂洗两次，加0．3m10．05％胰酶／0．53mMEDTA，37℃下孵育10min。(5)每孔加2mlFP培养基，悬浮细胞，将六孔细胞收集到一个15．ml离心管中，1609离，t=‘,5min。(6)弃去上清液，加10mlFP培养基重悬细胞，然后将其转移到100．mm平皿中培养(第二代)。(7)当细胞开始汇合，吸去FP培养基，PBS漂洗一遍，jJHlml0．05％胰酶／0．53mMEDTA消化5min。消化好后力I：19mlFP培养基使细胞重悬，然后按1：4的比例传代至新的平皿(第三代)。对于制备iPS，我们用三代以内的TTFs以避免细胞传代衰老。2．2．2SNL细胞(TTF饲养层制备)：往生长良好的TTFs中加入终浓度为1299／ml的丝裂霉素C溶液，37。C，5％C02中孵育2．25h，吸去含丝裂霉素C的培养基。用PBS漂洗两遍后，0．25％胰酶／lmMEDTA}fi化成单细胞悬液，以3．0x104／cm2密度接种到明胶铺被过的平皿16 硕士学位论文中，过夜培养。铺好的饲养层在l～7d内可以较好地支持iPSCs的生长并维持其全能性。2．2．3d,鼠iPSCs系的构建第一天：复苏Plat．E细胞，接种至明胶铺被的100mm培养皿中，置于37℃，5％C02温箱孵育过夜。第二天：用3ml新的培养基替换掉旧培养基，新培养基中加1“l10mg／ml嘌呤霉素(终浓度为1ktg／m1)和10“l10mg／ml稻瘟霉素S(终浓度为101ag／m1)，继续置于37℃，5％C02温箱孵育至细胞长到80％．90％融合度。第四天：按l：5的比例将细胞接种到新的100．mm平皿，2至JJ3天后细胞开始汇合。第六天：将处于对数生长期的Plat．E细胞用4ml0．05％胰酶／0．53mMEDTA消化下来，进行细胞计数并将细胞浓度调整至U8x105／ml。接种8×106细胞(10m1)于100．mm平皿，置于37"(2，5％C02温箱孵育过夜。第七天：准备1．5一ml离心管，加入O．3mlDMEM。用移液器}3H27-dFugene6转染试剂于上述准备好的离心管中，用手指轻弹混匀，室温孵育5min。将9pgpMXs质粒DNA(编码有Oct4，Sox2，Klf4)逐滴加入到含Fugene6／DMEM的离心管中，用手指轻轻弹击混匀，室温下孵育15min。将DNA／Fugene6混合液逐滴加至lJPlat．E平皿，37"C，5％C02温箱孵育过夜。同时作为转染的适宜对照，用pMXs逆转录病毒载体GFP监测转染效率，常规得到的转染效率700／0---80％。第八天：吸去含有转染试剂的培养基，加10ml新鲜FP培养基(DMEM含10％FBS，50U／ml青霉素和50mg／ml链霉素)，将细胞放回温箱继续孵育。在100．mm平皿中将TTF(<3代)培养至大约90％融合度(约2x106细胞／平皿)。用3ml0．25％胰酶／0．53mMEDTA消化并进行细胞计数，将细胞浓度调整到8×104／ml，吸10ml细胞悬液(8×105细胞)加到SNL细胞(丝裂霉素处灭活过的)铺被的100．ITIITI平皿。37"C，5％C02温箱孵育过夜。第九天：用一个lO．ml无菌一次性注射器收集Plat．E平皿中的培养基，然后17 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4，Sox2，KIf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析通过0．45／am孑L径醋酸纤维酯膜过滤，转移到一个15．ml离心管。往滤过的10ml含病毒培养基中加5}Il8mg／ml的聚凝胺，用吸管上下轻轻吹打混匀，聚凝胺终浓度为499／ml。将等体积含Oct4，Sox2，Klf4逆转录病毒的培养基混合。吸去一个TTF平皿中的培养基，再加入10ml聚凝胺／逆转录病毒培养基，于37。C，5％C02孵育4h至过夜不等。第十到至十一天继续用FP培养基换液，每天一次。第十二天改用ES培养基(DMEM含15％FBS，2mML．Gin，l×10--4M非必需氨基酸，1×10--4M2-巯基乙醇，50U／ml青霉素；F't150mg／ml链霉素)换液，每天换液直至克隆长到足够大能被挑取。克隆能够首次被肉眼看到大约在病毒感染后～周左右。20天左右长到足够大被挑取。2．2．4iPSCs克隆挑取和体外扩大培养：用移液器(设定在291)在15min之内尽可能多的挑取克隆至964[,板，加O．25％胰酶37℃下孵育15min。／JHES培养基并用吸管上下吹打成单细胞悬液。将细胞悬液转移到一个含有TTF饲细胞的24孔板，jJl：13001xlES培养基，置于37。C，5％C02温箱孵育至细胞长N80．90％融合度，将细胞传代到6孔板中扩大培养。2．3iPSCs的获得与扩大培养2．3．1iPS克隆挑取(1)病毒感染TTFs后每天换液，约第7天吸去FP培养基，换成ES培养基，直至克隆长到足够大能被挑取。克隆能够首次被肉眼看到大约在病毒感染后一周左右。(2)20天左右能长到足够大被挑取。(3)准备好一个96孔板，每个孔等份加入20pl0．25％胰酶／lmMEDTA。(4)弃去平皿中的培养基，7)1口10mlPBS轻柔漂洗。(5)吸去PBS，再!JIl5mlPBS。(6)用一个移液器设定在21al，挑取克隆，并将其转移到含胰酶的96孔板中，在15min之内尽可能多的挑取克隆。挑取完后，将板置于37℃下孵育15min，让克18 硕士学位论文隆细胞在胰酶的作用下分散开来。(7)孵育完，往每个孑L／JHl80rtlES培养基，并用吸管上下吹打成单细胞悬液。(8)将细胞悬液转移到一个含有饲细胞的24qrL板，力[13009lES培养基，置于37。C，5％C02温箱孵育至细胞长N80一90％融合度。2．3．2iPSCs的扩大培养与冻存(1)吸去培养基，用lmlPBS漂洗细胞一至两遍。(2)去除PBS干净，加0．1ml0．25％胰酶／lmMEDTA，37℃孵育10min。(3)／310．4mlES培养基，用吸管上下吹打细胞成单细胞悬液。(4)将细胞悬液转移到一个6孔板，加1．5mlES培养基，于37℃，5％C02温箱孵育至六孔板中细胞长N80．90％融合度。在这段时间，准备冻存细胞，如下。(5)吸去培养基，2mlPBS漂沈一遍。(6)PBS去除干净，加O．3ml0．25％胰酶／lmMEDTA，37。C下孵育10min。(7)力12mlES培养基，吸管上下吹打细胞成单细胞悬液。(8)把细胞悬液转移到一个15一“离心管，细胞计数，1609离心细胞5min。(9)弃上清，用ES培养基重悬细胞，使其浓度为2x106／ml。(10)准备2×的冻存液(20％DMSO和80％ES培养基)，往每个冻存管中等份加入0．5ml。(11)再把0．5ml细胞悬液加到冻存管中，轻轻混匀(12)将冻存管放到细胞冷冻箱，一80℃放置过夜。长期储存，将冻存细胞放入液氮罐中。2．4iPSCs的观察与鉴定2．4．1iPSCs的形态学观察光镜下观察NOD鼠iPSCs，TTF细胞形态，比较两者之间的形态学差异以及观察NOD鼠TTFs变成iPSCs的过程。2．4．2iPSCs基因表达分析：本实验从三个感染过病毒的平皿中挑取iPSCs，经过消化传代，获得了多个iPS细胞系，传至第10代时选取3个iPS细胞系进行RT．PCR19 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、KIf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析分析。iPS及TTF细胞总RNA提取(1)将细胞平皿中的培养基吸去，直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2／ml匕g例加入。)JlTrizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入．70℃长期保持。(2)12，000rpm离一t二,5min，弃沉淀。(3)按200ul氯仿／mlTrizolJJl入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。(4)4。C12，0009离。1二,15min。(5)吸去上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA矛I蛋白质，则保留下层酚相存于4。C冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。(6)按0．5ml异丙醇／mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5．10min。(7)4。C12，0009离一I二,10min，弃上清，RNA沉于管底。(8)按lml75％乙醇／mlTrizolijl入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。(9)4。C8,0009离一1二,5min，尽量弃上清。(10)室温晾干或真空干燥5．10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。(11)可用50ulH20，TEbuffer或0．5％SDS溶解RNA样品，55．60℃．5．10min。注：H20、TE或0．5％SDS均须用DEPC处理并高压。(12)No．D值定量RNA浓度。反转录反应RNasefreedH20uptO10¨l试剂名称使用量TotalRNAO．5一lggdNTPMixture(10mMeach)1glOligodTPrimer(50rtM)1gl20 硕士学位论文(1)在Microtube管中配制下列混合液。(2)65℃保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。(3)离心数秒钟使模板RN～引物等的混合液聚集于Microtube管底部。(4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。试剂名称使用量上述模板IⅢ～引物等的混合液lO“l5xPrimeScriptBuffer4plPrimeScriptReverseTranscriptase(200U／I．t1)0．5plRNaseInhibitor(40U／I，t1)0．5lalRNasefreedH20upto20“l(5)42℃保温30分钟。(6)70"C保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。PCR反应(1)按下列组成配$1]PCR反应液，全量50111。试剂名称使用量上述cDNA溶液1-5“ldNTPMixture(2．5mMeach)81．tlForwardPrimer(10p,M)1“lReversePrimer(10pM)1pl10×LAPCRBufierII(M92+P1us)5肛lTaKaRaLATaq(5U／jxl)O．5“ldH20upto50pl21 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、KIf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析(2)PCR反应条件如下：热至95。C，循环30．35次。预变性变性退火延伸后延伸PCR产物电泳94℃根据引物设置72℃纂)30-3溯环(1)称取琼脂糖干粉，倒入0．5xTBE电泳缓冲液中，微波炉加热融解，配制1％．2％琼脂糖凝胶。准备制胶槽，装好梳齿。(2)琼脂糖完全融解后，取出摇匀。每100ml加入2ul10mg／mll拘溴化乙锭(EB)，混匀倒入制胶槽，30．40min后凝固。此步骤不宜过早取出梳齿。(3)等胶完全凝固后，小心拔出梳齿，转移至电泳槽中上样电泳。每孔上样量5．109l，同时设置合适的DNAmarker。120mV，25mA电泳30．40min。(4)电泳结束后，小心取出凝胶至凝胶成像系统分析。2．4．3iPS细胞特异性标记的检测：免疫荧光染色检测NOD鼠iPSCsNanog及SSEAl的表达。(1)吸去培养板(24孔板)培养液，4％多聚甲醛固定iPSCs20min。(2)PBS冲洗两次，各10min。(3)0．2％tritonx．100／PBS通透10min。(4)PBS冲洗10min。(5)4％羊血清／PBS封闭30min。(6)上述封闭液稀释一抗至工作浓度(Abcam抗体的稀释比例一般为l：50．100)，4度孵育过夜。(7)PBS冲洗三次，各10min。(8)PBS按1：50tL例稀释带荧光标记的二抗，暗室中孵育1h。(9)PBS冲洗三次，各10min。加入100p1DAPI染液，暗室中孵育10min。22 硕士学位论文(10)PBS漂沈一次，留少许PBS在荧光镜下观察。2．4．4碱性磷酸酶染色(1)固定试剂准备：]JN65ml丙酮和8m137％甲醛到25ml柠檬酸盐溶液中，置于玻璃瓶中并盖紧瓶口。保存于2—8℃冰箱，预热至18—26℃使用。(2)量取45ml去离子水，调整温度到18—26℃(3)准备重氮盐溶液：将一个FastBlueRRSalt(试剂盒提供)胶囊中内容物溶解到步骤2中准备的去离子水中，磁力搅拌使其充分溶解。(4)力1]2mlNaphtholAS．MXPhosphateAlkalineSolution溶液到稀释的重氮盐溶液中，充分混匀后置于玻片染色缸中。(5)将柠檬酸一丙酮一甲醛固定剂预热到18—26℃，将载玻片浸入于固定剂中30s，在去离子水中轻轻漂洗45s，不要让载玻片干燥。(6)将载玻片置于碱性染液混合物(步骤4)中于18--26。C孵育15分钟，避免浸入染液的玻片见光，完成后去除染液。(7)孵育15min后，将玻片从染缸中移出并用去离子水漂洗2rain，注意不要让玻片干燥。(8)将玻片置于苏木精溶液中复染10rain。(9)用自来水充分漂洗并自然干燥。(10)镜下观察、评价染色效果。2．4．5iPS细胞分化潜能的检测．畸胎瘤实验(1)消化iPSCs，以1×107cells／ml的密度重悬在无LIF的DMEM培养液中(含10％FBS)。(2)取1009l(1x106cells)注A,3—5周龄的裸鼠背部或腹股沟皮下。大约注射4—5周后，注射部位出现肿瘤。(3)麻醉处死动物，剥取肿瘤用4％多聚甲醛固定，切片石蜡包埋，HE染色后显微镜观察，进行组织学分析。23 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2，KIf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析实验结果1．逆转录病毒质粒的准备本实验对质粒pMXs．Oct3、pMXs．Sox2、pMXs．Klf4及参照质粒pMXs．EGFP进行大量抽提纯化(Qiagen试剂盒法)，用异丙醇、75％乙醇沉淀后，得到质粒DNA片状沉淀，约小指指甲大小，最后用2ml去内毒素TEBuffer2ml重新溶解质粒DNA。每个质粒取509l做浓度测定及凝胶电泳分析。本次所的质粒浓度在0．4．0．699／gl，电泳见条带明亮、清晰，无杂条带(图1)，证明质粒抽提成功。1234M*2500bp图1四个质粒人提凝胶电泳结果1．pMXs—EGFP；2．pMXs-Klf4：3．pMXs—Sox2；4．pMXs-Oct4Figl1．pMXs—EGFP；2．pMXs—Klf4；3．pMXs—Sox2；4．pMXs-Oct42．NOD鼠尾尖成纤维细胞的培养NOD鼠TTF原代培养在接种后3．4h贴壁，细胞呈长梭形、多边行或不规则形，中间1．2个圆形或卵圆形的核，原代TTF杂细胞较多，随着传代次数的增多，其纯度增高，一般第二代后即可得到较纯的细胞(图2，A、B)。1．3代的TTF细胞可用于重编程。24 硕士学位论文猡。'舔?I．、I图2．NOD鼠尾尖成纤维细胞形态，图A为原代，x200：图B为第3代，×100Figure2．MorphologiesofNODmiceTTFs．(A)MorphologiesofPrimaryTTFs，x200；(B)MorphologiesofthirdpassageTTFs．×1003．逆转录病毒质粒转染Plat．E细胞以pMXs．EGFP为对照，对四个质粒进行转染，每个质粒转染试剂／质粒比例都是3：1，转染48小时后观察plat．e细胞状态，倒置显微镜下未见到细胞明显变化，荧光下观察报告基因EGFP的表达，可见到大量荧光细胞，转染效率约为50．70％(图3)，转染48h和72h后分别收集病毒上清，0．45pm孑L径醋酸纤维膜滤器过滤后，间隔24h重复感染TTFs。图3逆转录病毒质粒转染Plat—E细胞A．转染B．普通镜下Plat．E细胞，X100。BFigure3RetroviralvectorstransfectedinPlat—Ecells．(A)TheexpressionofGFPaRer48htransfection，×100；(B)Thetransfectedceilsundermicroscope，×10025黧隧 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、Klf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析4．诱导性多能干细胞的产生及鉴定4．1iPS形态学的观察包含三个干细胞基因的逆转录病毒感染TTF后大约一周左右可以在镜下首次看到iPS克隆，而后克隆继续增殖，12d左右形成肉眼可见的iPS集落，15．16d时克隆长至足够大，此时进行挑取、消化、接种至饲细胞上传代培养。本实验从三个感染过病毒的TTF平皿中挑取ips克隆，经过消化、传代扩大培养建立了多个iPS细胞系。未感染病毒前，TTF呈长梭型，通过病毒介导将三个重编程因子(Oct4，Sox2，Klf4)转入TTF后，逐渐出现细胞聚集，形成干细胞样集落，镜下观察细胞呈典型的克隆状生长，集落圆形或椭圆形，与周围边界清晰，集落内细胞密集，折光性强，细胞变小，核质比增大，呈现干细胞的特征(图4)。图4．NOD—TTFs重编程为iPSCsA．iPS集落(dayl2)×100B．镜下iPS细胞形态(dayl5)×100Figure4InducedpluripotentstemcellsfromNOD—iPSCs．A：iPScloneinday12f×lOO)；B：iPScloneinday15(×100)4．2碱性磷酸酶染色碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)在未分化的胚胎干细胞中具有较高的活性。通过AP染色对本次诱导的多个iPS细胞系进行鉴定，结果显示大多数iPSCs高表达AP，iPS克隆呈紫红色，而周围的成纤维细胞则不能被染色(图5)。26 硕士学位论文图5iPSCs碱性磷酸酶染色，×100r]L—Figure5AlkalinephosphatasestainingofiPScells，×100．4．3干细胞标记,SSEA．1和Nanogl拘检测通过免疫荧光染色证实本实验中所获得的iPSCs均表达ES相关蛋SSEA．1和Nanog(图6)隧删图6免疫荧光染色证实iPSCs表达Nanog及SSEA一1，细胞核用DAPI复染，×200。A：相差显微镜下iPSCs；B：Nanog(红色)表达；C：DAPI(蓝色)复染细胞核；D：SSEA．127 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、Klf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析(绿色)表达。Figure6iPScellsimmunostainedwithNanogandSSEAIantibodiesshowingESCmarkerexpression．NucleiwerestainedwithDAPI，×200．A：iPSCs，B：Nanog(red)C：DAPI(blue)，D：SSEA—l(greenl4．4iPS细胞基因表达模式分析4．4．1总RNA的提取本实验通过消化、传代，建立了多个iPS干细胞系，传至第10代时选取3个iPS系及一个原代TTFs提取RNA，最后离心得Nd,片状的RNA沉淀，用309l无RNase水溶解，取109l用于测浓度及电泳分析，其余用于后续的RT．PCR。凝胶电泳可见18S矛t128S两个明亮的条带，28S的条带亮度约为18S两倍，加样孔周围无亮带，证明本次提取的RNA无DNA和蛋白污染(图7)。紫外分光光度仪溯JA260／A280比值在1．9．2．0，说明RNA纯度良好，无降解，无蛋白等污染，浓度在0．2—0．599／pl。】2328S18S图7RNA电泳图像，lane1．3：iPScells：lane4：MEFsFigure7TheelectrophoresispatternoftotalRNA．28 硕士学位论文4．4．2RT．PCR检测iPSCs干细胞基因的表达利用RT．PCR方法对所建立的3个iPS细胞系clonel，clone2和chone3进行分析，ES细胞中高表达的标志基因如Fgf4，Nanog，Utfl，Oct4，Sox2与Dppa5等在iPSCs中也显著表达，而在TTFs中不表达。Gapdh为小鼠管家基因。其中Oct4平ISox2在逆转录病毒感染时已进入细胞，因此此次RT．PCR中所设引物只扩增内源性的Oct4矛ISox2。(图8)Fgf4UtflSox2NanogOct4Dppa5GapdhTTFsiPSCsliPSCs2iPSCs3图8RT-PCR检测干细胞基因在iPSCs中的表达(iPSclonesl一3)Figure8RT—PCRanalysisofiPSCsindicatedthattheyexpressgenesspecifictopluripotentmESCs，TTFswereusedasnegativecontrol，GAPDHwasusedasloadingcontr01．4．5畸胎瘤实验证明iPS细胞多向分化潜能为了证实重编程来源的iPS是否具有多向分化潜能，我们将其注入免疫缺陷鼠皮下，iPSCs接种至裸鼠皮下后约一周左右可以看到畸胎瘤形成，4-6周时畸胎瘤长到直径约lcm大小，取下瘤体HE染色，镜下可见不同胚层来源的多种组织，包括菊形团(神经外胚层)、骨髂肌(中胚层)以及腺样上皮组织(内胚层)(图9)。表明iPSCs具有多潜能性。29 第一部分利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、Klf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析图9iPS细胞形成畸胎瘤。畸胎瘤组织中包含上皮组织(A)、脂肪组织(B)、骨髂肌(c)及三胚层发育(D)等，表明iPS多向分化潜能。右图为裸鼠畸胎瘤。Figure9TemtomaformationofiPSCs．Thetissuesofallthreegermlayers，suchasglandularepithelium，neuraltissue，musculartissueandadiposecells．结论1．通过转导三个重编程因子(Oct4、Sox2、Klf4)可以将NOD鼠尾尖成纤维细胞诱导为多能干细胞，即NOD．iPSCs。2．NOD．iPSCs具有类似胚胎干细胞的生物学特性，并能维持长期多次传代，表明初步建立了NOD．iPS细胞系。30 硕士学位论文第二部分体外化学因子及共培养联合诱导小鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞材料与方法1．实验材料1．1主要材料和试剂：除第一部分涉及材科及试剂外，主要由以’卜．组成：试剂及仪器来源胶原酶IVDMEM／F12培养基，F12／IMDM培养基，澳洲胎牛血清，Hank’S液Matrigel基质胶EGFBMP2，bFGF，BSA，N2，B27，activinA，nicotinamide，Exendin．4FGF7，ActivinARA，Nkx6．1，兔抗小鼠胰岛素抗体，山羊抗小鼠C肽抗体，相关二抗(AlexaFluor标记的山羊抗兔IgG、AlexaFluor标记的驴抗山羊IgG)NOGGIN，wortmanninRT-PCR相关酶、引物Transwell共培养体系AO．PI试剂盒，Ficoll小鼠胰岛素ELISA试剂盒美国Sigma公司美国Gibco公司美国BDBioseiences公司美国Ebioscience公司美国peprotech公司美国RD公司美国Santacruz公司美国lnvitrogen公司大连Takara公司美国Coming公司上海凯基生物美国Abcam公司1．2实验动物：SPF级SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供1．3实验细胞：本实验第一部分得到并冻存的NOD．iPSCs 第二部分体外化学因子及共培养联合诱导小鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞2实验方法2．1获取共培养所需大鼠胰岛细胞2．1．1溶液配制(1)胶原酶P配制：在D．Hank’S液中加入7．5mmol／LCaCl2、10mmol／LHEPES、0．2％酚红指示剂，用NaOH调PH值(7．8)后储存。临用时取上述配制好的溶液按0．5mg／ml加入胶原酶P，0．22um针头滤器过滤除菌后使用。(2)Ficoll400配制：Ficoll配制：称取Ficoll1009，加250mlHanks液(不含CaCI2、NaHCO)，待全部溶解后用上述Hank’S液定容到400ml，此为25％Ficoll；充分混匀后耿92ml，加上述Hanks液定容到100ml，此为23％Ficoll；取80ml用上述Hanks液定容到100ml，此为20％Ficoll；取44ml用上述Hanks液定容到100ml，此为11％Ficoll。全部配制完成后高压或煮沸灭菌，4℃保存。Ficoll1009+Hank’S溶液200ml，完全溶解后加Hank’S至400ml即为25％Ficoll溶液。25％Ficoll92ml+Hank’S8ml即为23％Ficoll溶液。25％Ficoll80ml+Hank’S20ml即为20％Ficoll溶液。25％FicoU44ml+Hank’S56ml即为11％Ficoll溶液。2．1．2大鼠胰岛细胞的获取：(1)成年SD大鼠，8～10周龄，体重250～3009，10％戊巴比妥钠40mg／kg肌肉注射麻醉。(2)固定四肢成仰卧位，酒精全身消毒，胸腹部备皮后常规碘酒、酒精消毒，腹部“个”切口，分层进入腹腔，牵开肠管，显露胰管及胆总管。(3)1号丝线于胰管紧靠肠壁处结扎，胆总管内插入4．5．5号头皮针，丝线结扎固定，切开胸腔，破心放血处死，经胆总管内插管逆行注入预冷的0．5mg／ml胶原酶P溶液8～10ml(视个体大小而定)，使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺，移入预置6mlHank’S液的消化瓶中。插管必须在紧贴12指肠处进针。32 硕士学位论文(4)38"C水浴中静止消化10分钟，取出置于冰浴中用眼科镊撕碎胰腺，很容易撕碎的表示已达到消化的要求。移入消化瓶中振荡15秒使其呈细砂状，加入4。C小牛血清10ml与4。CHank’S液30ml终止消化。振摇时应该用手腕的力用力振摇后呈细小颗粒(泥沙状)。(5)用6009m不锈钢丝网过滤，细胞悬液用50ml离心管1000rpm4。C离心1-2分钟，弃去上清液，沉淀物加入4。CHank’S液洗涤，同样方法离心洗涤，加冷Hank’S液重悬后均分到2根15ml离心管内，1000rpm4℃离心2分钟，弃去上清液。(6)沉淀物加25％Ficoll4ml混匀，其上依次分别加入23％、20％、11％Ficoll溶液和Hank’S液各2ml，3000rpm，4。C离心20分钟，吸出23％"-'20％及20％～11％界面的胰岛，用4。CHank’S液于50ml离心管内离心洗涤2次备用。2．1．3DTZ染色检测胰岛的纯度；Ao—PI染色检测胰岛的活率(1)胰岛DTZ染色：DTZ为螯合指示剂，可与铅，铜，锌等螯合，人和动物(豚鼠除外)的胰岛p细胞因含锌，DTZ染色呈猩红色，其它细胞不着色，故DTZ对胰岛呈特异性染色。(2)无水乙醇配制：DTZ10mg溶于3ml无水乙醇(含50ul浓NHOH)，加Hanks液12ml，此为储存液，临用时用Hanks液(PH7．8)l：100稀释，0．22u孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温10分钟后，镜检。(染色对细胞无明显影响，可继续培养)(3)DMSO配制：DTZ10mg溶于10mlDMSO，用Hanks液(PH7．8)1：1000稀释，0．22u孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温10分钟后镜检。(4)胰岛AO—PI染色：AO为浸润性染料(膜通透性)，可侵入活细胞与双链DNA结合发出绿色荧光、与单链DNA(变性DNA)结合发出红色荧光；PI为排斥性染料(膜不通透性)，不能进入活细胞，与死亡或正在死亡(膜通透性改变)的细胞的核酸结合，发出红色荧光。4。C暗处保存AO．PI试剂，临用前33 第二部分体外化学因子及共培养联合诱导小鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞取0．01mlAO与lmlPI混合，用Hanks液10倍稀释，0．22u孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合10分钟，在荧光显微镜下用490rLrn激发光滤光片，510nm光栅滤光片可同时见到绿色(AO)和红色(PI)荧光。2．2诱导iPSCs分化为胰岛样细胞2．2．1化学因子诱导路线图Day0iPSCS．EndodermPancreaticProgenitorinductionspecializatiOnexpansionOjIPCs准备：复苏培养NOD．iPSCs至含TTFs(丝裂霉素C处理)的100mm平皿。用ES培养基培养，3d后将细胞l：3传代至Matfigel基质胶(1：50)包被的无TTF培养皿中。第一阶段：将iPSCs种植在Matrigel基质胶(1：50)包被的培养皿中后，Dfl2培养基(补充O．2％BSA，0．5xN2和O．5xB27)培养4天，同时加入诱导因子100ng／mlactivinA和lgMwortmannin将其诱导成内胚层细胞。第二阶段：第4天更换培养基为F12／IMDM(1：1，补充0．5％BSA，0．5％ITS和0．5xB27)，并加入诱导因子29MRA、20ng／mlFGF7及50ng／mlNOGGIN培养4天，将其诱导为胰岛内分泌细胞。第三阶段：第8天更换培养基为高糖DMEM(补充0．5％BSA，1％ITS和1xN2)，并加入50ng／mlEGF培养5天，促进胰岛祖细胞／胰岛内分泌细胞扩增。第四阶段：第13天更换培养基为DFl2，并加入1％ITS、10ng／mlbFGF、10mMnicotinamide、50ng／mlExendin．4和10ng／mlBMP2培养7-9天，促进胰岛内分泌细胞成熟。2．2．2共同培养方法：将iPSCs与大鼠胰岛细胞以半透膜相隔离，使两种细胞互不接触，但培养液可以相互交流，大鼠细胞分泌的可溶性因子可以自由通过半透膜。将iPSCs接种于12孔板底层，培养，孔板中置入transwellinsea，在孔板上接种p细胞，insert直径选0．49m，保证细胞不能通过但培养液及可溶性因子可以通过。34 硕士学位论文见图10。胰岛细胞iPS细目色图10Transwell共培养体系Fig10TranswellcoculturesyStem2．2．3实验分组：实验组：小鼠iPSCs+化学因子培养基+胰岛细胞共培养对照组1：小鼠iPSCs+化学因子培养基对照组2：小鼠iPSCs+胰岛细胞共培养+FP培养基培养，不加任何诱导剂。对照组3：单独培养小鼠iPSCs，不加任何诱导剂2．2．4双硫腙(DTZ)染色：50mg双硫腙溶于5mlDMSO中，过滤除菌，将iPSCs及诱导后的细胞团用Hank’S液洗两遍，加入lml该缓冲液及1¨l双硫腙贮存液，37。C孵育20min，倒置显微镜下观察细胞着色情况。实验组进行以上操作时均取底层iPSCs诱导细胞。2．2．5RT-PCR鉴定胰十二指肠同源异型盒基因I(PDX．1)表达：将诱导第4、8、12、16、20天的细胞进行RT-PCR检测，第20天行细胞免疫荧光及RT-PCR检测基因insulin、amylase、glucagon等的表达。分析所获得胰岛样细胞的性质。Pdxl引物序列：上游：5’．GTTCATCTCCCTTTCCCGTGG．3’下游：5’．GGTGGTGGCTTTGGCAATG．3’；循环步骤如下：95℃预变性5min，95。C变性40s，Tm：57℃，退火35s，72。C延伸35s30min，循环32次，取8plPCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统(Bio．RadMolecularImagerChemiDocTMXRS+)，ImageLab全自动图像获取和分析软件下进行观察分析以及采集图片。。35皿闫、一空一空茸孔部上参下一．t—t：一 第二部分体外化学因子及共培养联合诱导小鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞2．2．6酶联免疫吸附实验(ELISA)测定胰岛素分泌水平及葡萄糖刺激胰岛素释放试验：细胞诱导培养第4、8、12、16、20天时，用5．6mmol／L葡萄糖无血清培养基洗两次，再用30．0mmol／L葡萄糖无血清培养基孵育2h，收集上清液，．20。C保存。实验组及对照组2的上层共培养细胞均于低糖培养基漂洗时取下，单独检测底层诱导细胞。用ELISA法检测各上清液中的胰岛素浓度，按说明书进行操作。2．2．7免疫荧光染色：取诱导第20天的细胞，先用37℃PBS冲洗3次，用40∥L多聚甲醛在4。C固定30min，一抗(兔抗小鼠胰岛素抗体，山羊抗小鼠C肽抗体)4℃孵育过夜，PBS漂洗后，滴加荧光标记的二抗(为AlexaFluor标记的山羊抗兔IgG、AlexaFluor标记的驴抗山羊IgG)。和DAPI于室温下共同孵育1h。激光共聚焦显微镜观察。分化的iPSCs经预处理后，仅滴加标记的二抗，作为阴性对照以排除二抗的非特异性染色。实验结果1．形态学观察及DTZ染色：诱导培养后，实验组及对照组1细胞逐渐聚集生长，约14天左右开始出现大小不一的细胞团。第20天时每个实验组Transwell培养体系及对照组l各有20"～30个细胞团，形态不规则。富含锌离子的细胞团经DTZ染色后呈棕红色，其余细胞不着色。对照组2及对照组3未出现细胞团，细胞不着色。见图11。A电‘．，．B’‘．，‘．4’图11：A实验组诱导生成的胰岛素分泌细胞团(100X)B：DTZ染色将胰岛素分泌细胞染成棕红色(100X)36 硕士学位论文Fig1A：IPCclusteroftheexperimentgroup(100X1B：IPCscouldbestainedwithDTZinbrownishred(100X)．2．RT-PCR检测PDX．1表达：实验组及对照组1诱导后的细胞从第8天开始表达PDX．1蛋白，并且从第8天至第20天表达逐渐增强。对照组2及对照组3未见PDX．1表达。见图12。第4天第8天第12天第16天第20天Gapdh下T实验组对照组1对照组2对照组3图12实验组及对照组1诱导后的细胞从第8天开始表达PDX一1蛋白，并且从第8天至第20天表达逐渐增强。对照组2及对照组3未见PDX．1表达。Fig12ThemRNA(PDX—1)associatingwithpancreaticprogenitorcellswasexpressedbyRT-PCRtechnologyfromday8today20andwasexpressedstrongergraduallyinexperimentgroupandcontrolgroup1．Controlgroup2andcontrolgroup3couldnotexpressPDX一1．3．葡萄糖刺激胰岛素释放试验：实验组及对照组1细胞诱导培养第4、8、12、16、20天时，高糖刺激后分泌胰岛素分别为Ong／ml和0ng／ml，(1．67+0．19)ng／ml和(0．45+0．23)ng／ml，(2．97+0．26)ng／ml,tl(2．34+0．11)ng／ml，(3．07+0．17)ng／ml,tl(2．59+0．24)ng／ml，(3．16+0．27)ng／ml和(2．67+0．19)ng／ml。说明诱导后的细胞对葡萄糖刺激有反应，实验组和对照组1细胞诱导第8天时有微量胰岛素分泌，且实验组高于对照组37 第二部分体外化学因子及共培养联合诱导小鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞(P<0．05)；实验组和对照组1从第12天开始胰岛素分泌明显增加(第12天和第8天比，P0．05)。对照组2，对照组3培养上清中未测到胰岛素分泌。证明实验组分泌胰岛素最多，对葡萄糖刺激反应最大，且实验组早于其他组别产生胰岛素分泌，差异有统计学意义(P--j、生活的指路明灯，时至今同仍深感在老师身边学习的同子短暂。衷心感谢在本课题在选题及研究过程中给予悉心指导的张桦教授。张教授多次询问研究进程，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。他一丝不苟的作风，严谨求实的念度，踏踏实实的精神，精湛的临床技术，不仅授我以文，而且教我做人，虽历时三载，却给以终生受益无穷之道。衷心感谢南方医科大学公卫学院病原生物学系吴煜老师、陈晓光教授及每一位老师和同学对我课题和实验的无私帮助和指导。衷心感谢内分泌科陈宏教授，叶仁青教授在专业知识上的耐心传授。感谢杨青护士长、杨力老师、何雷老师、孙嘉师姐、杨晓燕师姐、杨锐师兄、张振师兄、陈容平师兄，以及全科护士们对我工作、学习、生活上的无私关心、指导和帮助，让我在内分泌科的学习生活充满了家庭般的温暖。衷心感谢我的同学：宋青青、严婷、孙靖、罗海钊、陈思、黄懿文，谢谢他们在我学习生活上给予的支持、鼓励和帮助，难忘我们共同的欢乐和深厚的友谊。衷心感谢我的同门：刘海明师兄、孙楠，以及刘锻、李迪、林寒潇、沈群等师弟师妹，多年来在临床和实验上给我的帮助和支持，正是有了他们，科研的路上我才能不寂寞。·衷心感谢我的已经毕业的师兄师姐和还在奋斗的师弟师妹们，因为他们的出色，让我时刻鞭策自己，争取更大的进步。衷心感谢研究生学院以及医院教务处各位领导的指导和关怀，以及其他领S气 致谢导的辛勤工作，为我们完成学业提供了重要保障。我还要特别感谢我的父母和不论在不在我身边的亲友，谢谢他们对我的帮助、支持和无私的爱。最后，特别感谢各位专家评阅论文、参加答辩并给与指导和帮助。54 硕士学位论文南方医科大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明确方式规定外，本研究已发表与未发表成果的知识产权均归属南方医科大学。本人承诺承担本声明的法律效果。作者始销峰吼切易年，月封日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南方医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打tt、／，，)：1、保密口，在～年解密后适用本授权书。2、不保密Z日期：捌弓年占月参}日日期：加f弓年多月弓1日舞伤冉从．钟粥