非洲猪瘟病毒p72基因单克隆抗体的制备及其重组杆状病毒的构建

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1、华中农业大学硕士学位论文非洲猪瘟病毒P72基因单克隆抗体的制备及其重组杆状病毒的构建姓名：杨晓红申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：曹胜波201206非洲猪瘟病毒P72基因单克隆抗体的制各及其重组杆状病毒的构建非洲猪瘟病毒P72基因单克隆抗体的制备及其重组杆状病毒的构建摘要非洲猪瘟(AfricanSwineFever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(AfricanSwineFeverVirus，ASFV)弓I起的猪的一种急性、烈性传染病。临床上以高热、全身性出血和高死亡率为特征。该病对养猪业危害巨大，被OIE列为A类疫病。尽管我国尚无该病的传入，却时刻面临传入的风险

2、。因此，开展该病诊断方法和疫苗的储备性研究，对于该病的防范具有重要意义。本研究利用原核表达的ASFVP72蛋白作为免疫原，制备了P72蛋白的单克隆抗体，并构建了P72基因的重组杆状病毒，为非洲猪瘟的诊断方法和免疫预防等研究奠定了基础。具体研究内容如下：1．P72基因的原核表达及其单克隆抗体的制备根据已发表的序列，设计合成了ASFVP72基因，并将其克隆至原核表达载体pGEX．KG，得到重组原核表达质粒pKG．P72。将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后，SDS．PAGE检测证实，P72蛋白以可溶性形式在大肠杆菌中获得了高效表达。以纯化的P72蛋白作

3、为免疫原，免疫BALB／c小鼠，并通过细胞融合和间接ELISA方法筛选，获得了5株能稳定分泌针对P72蛋白的特异性单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为1El、1F3、3F1、3Dll、4F10，单抗亚类鉴定均属于IgG2。。经间接免疫荧光和WesternBlot分析，获得的5株单克隆抗体均能与P72原核和真核表达蛋白发生特异性反应。2．P72基因重组杆状病毒的构建在构建真核表达质粒pcDNA．P72的基础上，用BglII+XbaI双酶切该质粒，获得CMV-P72表达框，并将其插入到转移载体pFast．VSV-G中，得到重组转移质粒pFast．G．P72。将该转移质粒转化DH

4、l0Bac大肠杆菌感受态，通过蓝白斑筛选得到阳性重组穿梭载体Bacmid．G．P72。将提取的重组Bacmid．G．P72DNA转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒BV-G．P72。将重组杆状病毒转导EPC细胞，并通过问接免疫荧光实验和WesternBlot分析，证实P72基因在真核细胞中得到了表达。关键词：非洲猪瘟病毒；P72基因；单克隆抗体；杆状病毒华中农业大学2012届硕士研究生学位论文PreparationofMonoclonalAntibodiesagainstP72geneofAfricanSwineFeverVirusandConstructionoft

5、heRecombinantBaculovirusAbstractAfricanswinefever(ASF)isanacuteandfulminatinginfectiousdiseasecausedbyAfricanswinefevervirus(ASFV)indomesticpigs．Themortalitycanbe100％withsymptomssuchasfeverandhemorrhage．Bynow,thisdiseasehasdonegreatharmtoswineindustryworldwide，itisdeclaredtobeoneofthe“L

6、istA”diseasesbyOIE．ThereisriskforincomingofASFeventhoughthereisnoASFinourcountry．Therefore，itisveryimportanttostudyondiagnosticmethodsandvaccineforpreventingthedisease．TheaimofourstudyWastoobtainP72proteinofASFVexpressedinprokaryoticexpressionvector．Then，wepreparedmonoclonalantibodyagai

7、nstP72protein，andconstructedtherecombinantbaculovirusofP72gene．TheseareveryusefulfordiagnosticmethodsandpreventionofASF．Themainprojectsareasfollows：1．ProkaryoticexpressionofP72geneandPreparationofMonoclonalAntibodiesagainstP72proteinAccordingtopublishedsequenceoftheP72gene，itWa