抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白单克隆抗体的制备.pdf

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1、动物医学进展，2012，33(12)：64—67ProgressinVeterinaryMedicine抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白单克隆抗体的制备陈轶，吴晓东，邹艳丽，赵金山，包静月，曹金山，王志亮(1．中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266114；2．内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018)摘要：为了制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73蛋白的单克隆抗体(MAb)，原核表达并纯化了该病毒的重组VP73蛋白，按常规方法免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，对杂交瘤细胞进行筛选，阳性孔经3次有

2、限稀释法亚克隆，最终获得了一株稳定分泌抗ASFVVP73蛋白MAb的杂交瘤细胞株，命名为1C8。EIISA检测和Westernblot分析表明，所获得的MAb与重组VP73蛋白呈阳性反应，腹水效价为1．024×10，该MAb的抗体类型为IgG1亚类。关键词：非洲猪瘟病毒；VP73蛋白；单克隆抗体中图分类号：$852．43；$852．65l文献标识码：A文章编号：1007—5038(2012)12-0064—04非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是一种由倩等口对非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位非洲猪瘟病毒(

3、Africanswinefevervirus，ASFV)感进行了预测。本研究在对ASFVVP73蛋白主要抗染引起的猪的急性、烈性、高度接触性传染病口]。原表位区原核表达的基础上，制备了相应的单克隆ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟抗体。病毒属(Asfivirus)惟一成员_2]，为具有囊膜的双股1材料与方法DNA病毒，蜱类是其主要自然宿主和传播媒介[3]。1．1材料ASFV感染猪后以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官1．1．1菌种、质粒、动物和细胞宿主菌E．coli出血为临床特征，病死率极高]。因此，ASF

4、是世界BL21(DE3)为Invitrogen公司产品；重组质粒动物卫生组织(OIE)要求法定报告的动物疫病，也pET32a—vp73、非洲猪瘟病毒阳性血清、Balb／c小鼠是《中华人民共和国动物防疫法》规定的一类动物疫及小鼠骨髓瘤细胞株(SP2／O)均由中国动物卫生与病。流行病学中心保存。ASFV整个基因组含有160个～175个开放阅1．1．2试剂非预染蛋白Marker和预染蛋白读框(()RF)，编码150种～200种蛋白质]。根据Marker为Fermentas公司产品；HisBindPurifica—Pubmed中所列西班

5、牙BA71V分离株全基因序列tionKit为Novagen公司产品；BCA蛋白定量试剂显示，ASFV基因组含有151个主要阅读框，编码数盒为Biomiga公司产品；弗氏完全佐剂、弗氏不完全量众多的蛋白]。VP73蛋白是ASFV的主要结构佐剂、PEG和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠蛋白，由B646L基因编码，全蛋白分子质量约为73和羊抗猪IgG均为Sigma公司产品；HT、HAT和ku_8一。VP73蛋白是病毒粒子20面体衣壳的重要组DMEM均为Invitrogen公司产品；胎牛血清为成部分，产生于病毒感染的晚期，约占整个病

6、毒粒子蛋白的32E93。VP73蛋白在ASFV结合和进入易ThermoFisherScientific公司产品。其他试剂均为感细胞过程中有很重要的作用¨1，并对病毒粒子衣国产分析纯。壳的产生起至关重要的作用[1。ASFV大多数分1．2方法离株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几1．2．1免疫原的制备个蛋白具有免疫原性。有研究表明，不同区域AS—l_2．1．1重组质粒的鉴定和表达用BamHI和FV分离株诱导产生的抗VP73蛋白抗体的相应抗XhoI双酶切重组质粒pET32a—vp73，将酶切产物原表位都相当保守l1。VP73蛋

7、白的免疫原性很稳进行30g／L琼脂糖凝胶电泳。将重组质粒定¨]，可以被用来作为血清学检测和免疫制剂。李pET32a—vp73委托宝生物工程(大连)有限公司测收稿日期：2012—05—10基金项目：国家公益性行业(农业)科研专项经费(200903037)作者简介：陈轶(1986一)，男，内蒙古包头人，硕士研究生，主要从事猪瘟病毒研究。*通讯作者陈轶等：抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白单克隆抗体的制备65序。将空质粒pET32a(+)和重组质粒pET32a—用MAb亚类鉴定试剂盒对MAb的亚类进行鉴定。vp73分别转化至E．coliBL2

8、1(DE3)感受态细胞中。单抗腹水作倍比稀释，采用间接ELISA测定单抗腹将重组菌接种至含氨苄青霉素抗性的LB液体培养水的效价。基中，37℃振摇至OD600nm值约为0．6，加入终浓2结果度为0．8mmol／L的IPTG，诱导4．5h，菌体裂解2．1重组质粒酶切