非洲猪瘟病毒p30重组蛋白的表达及单克隆抗体制备

《非洲猪瘟病毒p30重组蛋白的表达及单克隆抗体制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、扬9、H大学硕士学位论文非洲猪瘟病毒p30重组蛋白的表达及单克隆抗体制备硕士研究生：储德文导师：孙怀昌教授中文摘要非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervires．ASFV)引起的一种高度致死性传染病，强毒株感染的死亡率高达100％。该病一直在许多非洲国家流行，近年来流行范围有扩大趋势，已传播到格鲁齐亚、俄罗斯等邻国，使我国养猪业面临巨大威胁。ASFV能以软蜱和非洲野猪作为储存宿主和传播媒介，具有复杂的感染与免疫逃避机制，目前无任何疫苗用于防疫，因此快速、准确的诊断对防止该病

2、传入和控制具有重要意义。p30是ASFV的主要结构蛋白和强免疫原性蛋白之一，重组p30是非常重要的ASFV诊断抗原。为了制备p30重组抗原和单克隆抗体用于ASFV诊断，本研究将E75株ASFVp30基因序列优化成大肠杆菌密码子偏爱序列，将人工合成的序列插入原核表达载体pET-30a，用重组载体pET-P30转化大肠杆菌感受态细胞，用IPTG诱导重组蛋白表达，SDS．PAGE分析结果显示：表达的His．p30融合蛋白为预期的30kD，主要以包涵体形式表达。用镍柱亲和层析法从重组菌裂解物纯化得高纯度的His．p30融合蛋白，以纯化蛋白为抗原免疫小

3、鼠，每次免疫后采血分离血清。以重组蛋白为包被抗原，用方阵试验确定最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数，用建立的间接ELISA对免疫小鼠血清进行检测，结果显示4次免疫小鼠血清的抗体效价为1：1638400；按照常规的杂交瘤制备方法，取免疫小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用ELISA筛选杂交瘤细胞阳性克隆，用有限稀释法进行亚克隆，经过三次亚克隆后获得两株稳定分泌p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以重组p30为抗原，用杂交瘤细胞培养上清进行间接免疫荧光和Westernblot检测，结果显示分泌的单克隆抗体能与p30特异反应；用2株杂交瘤细胞注射小

4、鼠，收集腹水进行抗体效价测定，结果显示3H7A7和6D10G7株杂交瘤腹水单抗的ELISA效价分别为215和217。关键词：非洲猪瘟病毒；p30蛋白；原核表达；单克隆抗体制备储德文：非洲猪瘟病毒p30重组蛋白的表达及单克隆抗体制备2ExpressionandMonoclonalAntibodyPreparationofthep30RecombinantProteinofAfricanSwineFeverVirusM．S．Candidate：ChuDewenSupervisor：Prof．SunHuaichangAbstractAfficans

5、winefever(ASF)isahighlylethaldiseaseinpigscausedbyA衔canswinefevervirus(ASFV)．ThemortalityofthevirulentstraininfectionCallbe100％．ThediseasehasbeingprevalentinmanyA衔cancountriesandhastransmittedrecentlytoourneighboringcountriesincludingGeorgiaandRussia，whichposesagreatthreatt

6、oswineindustryinChina．ASFVCanuseA饿canwildpigsandsoftticksasthevirusrepertoireandtransmissionvectors、析thhighlycomplicatedinfectionandimmuneevasionmechanisms．Precently,novaccineisavailableandthusquickaccuratediagnosisisveryimportantforpreventionoftransmissionandcontrolofthedi

7、sease．P30isoneofthemajorstructuralandhighlyimmunogenicproteinofASFV,whichhasbeenusedastheantigenfordiagnosisofthevirus．Inthisstudy,weoptimizedthep30genesequenceofE75strainASFVforE．coliexpressionandclonedthesyntheticsequenceintoprokaryoticexpressionvectorpET-30a．Therecombina

8、ntvectorpET-P30wastransformedintoBL21(DE3)E．coliandexpressionoftheHis-p30fusionpro