犬瘟热病毒m、f、h基因重组杆状病毒的构建、鉴定与表达研究

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1、分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：2012653硕士学位论文犬瘟热病毒M、F、H基因重组杆状病毒的构建、鉴定与表达研究Construction,identificationandexpressionofrecombinantbaculovirusofM,FandHgenesofcaninedistempervirus作者姓名：虞一聪学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：分子病毒学指导教师：夏咸柱研究员所在学院：动物科学技术学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交

2、的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻

3、读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签

4、字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要近年来，病毒样颗粒（virus-likeparticles，VLPs）作为一种同时兼顾安全性和免疫原性的疫苗形式逐渐成为病毒疫苗研究热点和未来发展趋势之一。研究表明副黏病毒基质蛋白M是VLPs形成和出芽的主要驱动力，与表面糖蛋白（F、H）共表达后可以形成VLPs且大小与真实病毒粒子相似，同时可保证有足够的保护性抗原。因此，具有天然构象的M、F和H蛋白的表达是犬瘟热病毒VLPs组装的前提条件。本研究基于杆状病毒-昆虫细胞表达系统分别构建了表达犬瘟热病毒M、

5、F和H蛋白的重组杆状病毒，并通过原核表达蛋白制备鼠抗M、F、H蛋白及兔抗H蛋白多克隆抗体，对各重组杆状病毒在昆虫细胞中目的蛋白的表达分别进行了鉴定，为包装犬瘟热病毒VLPs奠定了物质基础。主要研究内容如下：1、犬瘟热病毒M、F和H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备以小熊猫源犬瘟热病毒驯化致弱株LP为研究对象，分别针对其M、F和H蛋白的主要抗原表位区设计克隆引物，通过RT-PCR扩增去除跨膜区和信号肽序列而保留主要抗原表位区片段，将编码序列大小分别为1005bp、1050bp和1104bp的CDVM、F

6、、H基因片段分别克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，构建重组质粒pET-30a(+)-M、pET-30a(+)-F和pET-30a(+)-H。将各表达质粒转化宿主菌BL21（DE3），在0.4mMIPTG和37℃条件下诱导表达4h后，经SDS-PAGE分析结果显示重组质粒pET-30a(+)-M、pET-30a(+)-F和pET-30a(+)-H在大肠埃希菌中分别诱导表达出分子质量为43ku、40ku和46ku的重组蛋白，大小与预期相符，主要以不溶性包涵体形式存在。Westernblot鉴定结果

7、显示M、F、H重组蛋白均能被犬抗CDV多克隆抗体特异性识别。以经Ni-NTA亲和层析纯化后的M、F和H重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠和兔，经3次免疫后采血，分离血清，制备鼠抗CDVM、F和H蛋白多克隆抗体及兔抗H蛋白多克隆抗体。2、犬瘟热病毒M、F和H蛋白重组杆状病毒的构建、鉴定与表达为构建表达具有天然构象的犬瘟热病毒M、F和H蛋白，分别将CDVLP弱毒株M、F和H基因ORF克隆至pFastBac™1载体中，测序验证后转化至DH10Bac™感受态细胞，同源重组获得穿梭质粒rBacmid-M、rBac

8、mid-F和rBacmid-H，将其分别转染Sf9细胞获得相应重组杆状病毒rpFB-M、rpFB-F和rpFB-H。I分别以上述制备鼠抗CDVM、F和H蛋白多克隆抗体及兔抗H蛋白多克隆抗体对相应重组杆状病毒进行IFA鉴定，结果显示各重组病毒在感染细胞的细胞膜上均可见特异性荧光反应；同时，对各重组杆状病毒感染细胞进行Westernblot检测，结果可见分子量分别为37ku、63ku和68ku左右的重组基质膜蛋白（rM）、融合蛋白（rF）和血凝素蛋白（rH）