靶向sirna体外抑制肝癌hepg-2细胞vegf-b基因表达的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文靶向siRNA体外抑制肝癌HepG--2细胞VEGF--B基因表达的研究姓名：马艳鹏申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：唐瑞峰201203中文摘要靶向SiRNA体外抑制肝癌HepG-2细胞VEGF-B基因表达的研究摘要目的：原发性肝癌(简称肝癌)是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，手术切除是目前治疗肝癌首选和最有效的方法。但肝癌患者临床症状出现较晚，症状出现后大多数患者已处于中晚期，手术切除率低，预后差。术后肿瘤的转移和复发是影响患者长期生存的首要原因。肿瘤的生长及转移需要新生血管的生成，血管内皮生长因子家族(vascularend

2、othelialgrowthfactorfamilymembers，VEGFs)可以直接或间接作用于每一个环节促进血管生长。迄今为止发现的VEGF家族有7个成员，包括VEGF．A(即通常所说的VEGF)、VEGF．B、VEGF．C、VEGF．D、VEGF．E(又称viralVEGF)、VEGF．F(又称snakevenomVEGF)以及PLGF(胎盘生长因子placentagrowthfactor)。除了VEGF．E、VEGF．F外，其它VEGF家族成员均由哺乳动物基因编码。VEGF家族在脊椎动物中存在广泛的表达，在不同的物种中其编码序列高度保守。VEGF家

3、族成员及其受体在众多肿瘤组织尤其是实体肿瘤组织(如肝癌)中存在异常表达，并与肿瘤的侵袭、转移、复发等生物学特性密切相关。VEGF．B是VEGF家族成员之一，在各种不同的肿瘤组织中存在异常表达，在肿瘤的侵袭、转移方面起着重要的作用。我们的前期研究显示：VEGF．B在肝癌的生长、侵袭及转移中起重要作用，并与肝癌患者的预后密切相关。因此，抑制VEGF．B基因的表达可望抑制肝癌细胞的增殖、转移。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近些年发展起来的一项新技术，RNA干扰的原理是将与内源性mRNA同源的外源性双链RNA(doublestrandedR

4、NA，dsRNA)经不同途径导入体内或体外的组织细胞，致使特定基因沉默。小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)是RNA干扰的主要效应因子。利用质粒或病毒为载体，将基因靶向siRNA导入细胞内，可对特定基因产生沉默效应。本研究以VEGF．B为靶点，体外构建靶向VEGF．BsiRNA表达质粒载体，并转染肝癌细胞HepG．2，用逆转录聚合酶链式反应技术(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT．PCR)检测分析实验组和对照组VEGF—BmRNA的表达，研究靶向VEGF．BsiRNA对肝

5、癌细胞HepG．2VEGF．B基中文摘要因的抑制作用，为肝癌的基因治疗提供新的靶点和方法，为临床应用提供理论依据。方法：扫描分析人类VEGF．B编码序列，设计合成靶向VEGF．BsiRNA，利用大肠杆菌进行质粒扩增和提取；人肝癌细胞株HepG．2置于DMEM培养基中(含有10％胎牛血清、100U／ml青霉素和100U／ml链霉素)，在37℃、5％C02的无菌培养箱中，视细胞生长状态及培养基颜色换液培养。待细胞培育至呈对数生长，用2．5g／L胰酶消化并将细胞接种于6孔培养板，待细胞铺满率达80％后，按转染试剂说明书用Lipofectamine2000将实验组及

6、对照组质粒分别转染HepG．2细胞，于24"-'48d、时在荧光显微镜下观察转染效率并收取细胞。以Triz01一步法提取细胞总RNA，用RT．PCR技术分析实验组及对照组肝癌细胞VEGF．BmRNA的表达(以B．action作为内参照标准)。结果：1、将重组的靶向VEGF—BsiRNA质粒转入大肠杆菌进行扩增，利用高纯度小量质粒提取试剂盒，可成功提取纯度较高的靶向VEGF．BsiRNA质粒。2、以质粒(含荧光标记)为载体，可将靶I句VEGF．BsiRNA成功转染人肝癌细胞HepG．2，于荧光显微镜下观察，实验组及对照组转染效率均达80％以上。3、将人肝癌细胞

7、株HepG．2转染靶向Ⅵ三GF．BsiRNA后，与对照组相比，各实验组VEGF．B的基因扩增产物电泳条带亮度呈不同程度的减低(以t3．action作为内参照标准)；对照组、实验组1、实验组2、实验组3的VEGF．B的基因扩增产物电泳条带亮度与内对照B．aaion的比值分别为：0．396-+-0．037、0．135±0．019、0．271±0．011、0．222±0．030。各实验组VEGF．BmRNA的表达量显著低于对照组VEGF．BmRNA(P

8、BsiRNA在体外抑制肝癌HepG．2细胞VEGF．