vegf-b基因靶向sirna治疗原发性肝癌实验研究

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1、河北医科大学硕士学位论文VEGF--B基因靶向siRNA治疗原发性肝癌实验研究姓名：孙建申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：唐瑞峰201203中文摘要VEGF．B基因靶向siRNA治疗原发性肝癌实验研究摘要目的：原发性肝癌(简称肝癌)是临床常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后差。在全球癌症发病率中居第5位，死亡率居第3位。在我国，肝癌发病人数约占全球的55％。目前肝癌首选手术治疗，但手术只适用于10％～30％的早期肝癌患者，且治疗效果欠佳，绝大多数患者在术后2年内复发；而对于晚期肝癌患者，以介入治疗为主的化疗栓塞法亦不能

2、明显改善其预后。近年研究表明，生物治疗，特别是分子靶向治疗在控制肝癌细胞增殖、预防和延缓复发转移及提高患者的生活质量等方面具有独特的优势，并成为研究热点。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一个结构相似的生长因子家族，目前己发现的VEGF家族成员有7个，分别是VEGF—A(即通常所指的VEGF)、VEGF．B、VEGF—C、VEGF—D、VEGF—E、VEGF．F和胎盘生长因子(Placentagrowthfactor,PLGF)。它们都是同源二聚体糖蛋白，具有相似的

3、空间结构。VEGF家族主要作用于血管和淋巴管内皮细胞，通过其特异性的膜受体介导实现其生物学效应，具有促进内皮细胞增殖、增加微血管通透性、诱导血管生成等多种功能，与肿瘤的生长、转移密切相关。大量的实验研究己证实，大部分恶性肿瘤都有VEGF家族成员的表达，而在正常组织中没有或仅有极低水平的表达。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指生物体内由双链RNA(double—strandedRIgA，dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默(post．transcriptionalgenesilencing，PTG

4、S)现象，是一种dsIⅢA分子在mRNA水平上封闭相关基因表达的过程。然而，体外合成的长链dsRNA会产生细胞毒反应，短链RNA(21～23nt)即小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)可避免该情况发生。研究表明，体外合成的siRNA与内源性siRNA一样，能够发挥分解靶mRNA特异性沉默靶基因的功能。随着对肿瘤发生发展机制的研究和生物技术的发展，肿瘤基因治疗、分子靶向治疗已成为肿瘤治疗的重要发展方向，RNAi技术也在人类基因功能研究和药物靶点鉴定等方面备受青睐，并具有潜在临床应用价值。中文摘要

5、本研究应用RNAi技术沉默VEGF．B基因，观察人肝癌细胞HepG2细胞VEGF．B蛋白的表达情况，进一步阐明VEGF．B表达与肝癌生物学特性的关系，以期为VEGF．B成为肝癌临床治疗靶点提供新的理论依据，也为最终阐明肝癌发生、发展的分子机制奠定实验基础。方法：常规培养人肝癌细胞HepG2细胞。以人VEGF．B基因序列(MⅥ003377．3)为靶基因选取3个靶位点，分别构建3个针对靶位点的siRNA质粒表达载体(S1、S2和S3)，同时合成一个阴性对照质粒表达载体(NC)，这些载体均能表达绿色荧光蛋白(greenfluore

6、scenceprotein，GFP)。用脂质体转染法将载体转染入人肝癌细胞HepG2细胞；激光共聚焦显微镜观察转染效率；在转染后48小时，用Westernblot技术检测HepG2细胞VEGF．B蛋白表达情况。结果：Westernblot结果显示HepG2一S1、HepG2．S2、HepG2．S3目的基因蛋白染色条带与HepG2．NC相比减弱。定量分析结果显示HepG2-NC、HepG2-S1、HepG2-S2、HepG2一S3的VEGF-B蛋白表达水平分别为0．547士0．012，0．322士0．030，0．235士0．0

7、08，0．272+0．018。三个实验组细胞VEGF．B蛋白表达水平均显著低于HepG2．NC对照组(P

8、表达。细胞关键词：原发性肝癌；VEGF．B；RNA干扰；Westernblot；HepG22英文摘要一————————————————————————————————————————————————————一ThestudyofsiRNAtargetingVEGF—Btotreatprim