构建登革病毒ns1抗原拓扑图及建立elispot微中和试验快速高通量评价登革病毒抗体中和活性

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1、南方医科大学2009级博士学位论文构建登革病毒NSl抗原拓扑图及建立ELISPOT微中和试验快速高通量评价登革病毒抗体中和活性DrawthetopographyofDENVNSIproteinandestablishaELISPoTmicro．neutralizationtesttoevaluateDENVantibodiesneutralizingactivitypidlyandantiodiesactivityrapidlyandhigh--throughput课题来源：国家杰出青年科学基金(30325031)“重大传染病防治"科技重大专项

2、(2009ZXl0004．306)国家自然科学基金联合基金(U1132002／L02)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员临床检验诊断学刘利东车小燕研究员吴玉章教授江丽芳教授富宁教授陈晓光教授周小棉教授论文评阅人夏宁邵教授陈政良教授安静教授2012年5月3日广州俐⋯1㈣啾构建登革病毒NS1拓扑图及建立ELISPOT微中和试验快速高通量评价登革病毒抗体中和活性博士研究生：刘利东指导教师：车小燕研究员摘要登革病毒(denguevirus，DENV)属于黄病毒科(Flavivirade)黄病毒属(Flavivirus)，主要的传播途

3、径是通过蚊虫叮咬敏感的脊椎动物宿主。DENV根据血清抗原反应分可为四个血清型，分别为DENV-I、DENV-2、DENV-3和DENV-4型。各型病毒感染后均可引起的症状主要有登革热(denguefever，DF)、登革出血热(denguehemorrhagicfever，DHF)和登革休克综合征(dengueshocksyndrome，DSS)。登革病毒的传播在早期较为局限，主要在热带和亚热带地区。但随着世界经济的一体化和各国之间的交流增强，登革病毒的传播范围日益扩大，目前在非洲、美洲、东南亚和西大平洋地区一百多个国家和地区均出现过登革病毒的

4、流行。调查数据显示，全世界每年约有0．5．1亿人感染登革病毒，出现登革出血热症状的严重病例达50万人，2．2．5万人死亡，其中大多为儿童，死亡率为5％。因此，登革病毒的感染已成为全球重要的公共卫生问题，如何有效控制感染是解决这一问题的关键。人体在感染登革病毒后，可以无症状，也可只出现类似感冒症状，可自愈，稍重的是出现DF症状，这些病例主要出现在初次感染的患者，儿童患者多需要住院治疗。有相当部分二次感染的患者可以出现严重的病症DHF／DSS。目前摘要还没有一个特异性的治疗方法，患者只能对症治疗，也缺乏有效的疫苗来防止感染。根据目前的研究结果显示，

5、出现DHF和DSS的主要原因是抗体依赖增强(antibody．dependentinhancment，ADE)效应，而其根源是登革病毒存在四个不同的血清型。研究认为，病人感染其中一型病毒后，免疫系统会产生众多对各种血清型病毒有交叉反应的抗体，这些抗体短期内有一定的交叉保护性作用，但并不具有长期保护性作用。相反的，这些与其他血清型病毒有交叉反应性的非中和抗体或者是一些亚中和浓度抗体可能就是引起DHF／DSS的重要原因。这些抗体与病毒颗粒结构蛋白结合后，不能阻止病毒进入细胞，而其Fc部分会与某些细胞(如单核细胞或树突状细胞)膜上的Fc受体结合，这种

6、结合有助于登革热病毒进入细胞，增强细胞对病毒的摄取及病毒在细胞内的复制，导致感染的增强，从而促使登革的严重疾病的发生。对于防止登革疾病传播的疫苗研发中，如果仅对一型病毒进行抗感染保护，会在病人感染异型病毒时，产生的ADE效应将会影响病人的生命。因此，各种类型的疫苗是否是引起ADE效应是登革防疫研究中一个关键点。登革病毒从首次分离至今，已有六十余年，但对其感染后疾病的防治还存在较大困难。其中的最大障碍是对登革病毒感染后的机体免疫机制不明，研究的针对性不能集中。登革病毒的基因组结构是单股正链RNA分子，长约l1000nt，编码三个结构蛋白，分别为衣

7、壳蛋白(C)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)，七个非结构蛋白(non．structureprotein，NS)，分别为NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。结构蛋白中的E蛋白与病毒感染有关，主要是与靶细胞表面的病毒受体结合，参与病毒与细胞之间的膜融合。在非结构蛋白中，虽然它们并不是成熟病毒颗粒的组成成份，但从目前的研究成果看来，它们在病毒感染与机体的免疫过程中起重要的作用。其中特别受到重视的是NSl蛋白，它是登革病毒中主要的非结构蛋白，通常有三个形式存在，一为分泌型，可以直接由感染的细胞分泌到胞外，可用于登革病毒早期诊断

8、指标。二为胞内型，主要存在于细胞内生物腔膜上，三为膜型，存在于感染细胞膜上，它的功能推测Ⅱ博士学位论文可以通过细胞毒作用，直接参与病毒的清除，另外，也