登革病毒包膜e蛋白ⅲ区中和抗体的功能及结构分析

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1、南方医科大学2010级博士学位论文登革病毒包膜E蛋白III区中和抗体的功能及结构分析FunctionandStructureAnalysisofNeutralizingantibodiesagainstEnvelopeProteinEDomainIIIofDengueVirus课题来源：NSFC．广东联合基金“登革病毒抗体保护性免疫应答的分子机制”(U1132002)国家自然基金杰出青年基金“传染病学”(30725031)NationalHealthandMedicalResearchCouncil(NHMRClFel

2、lowshipGrant(澳大利亚519709)NHMRCFellowshipGrant511105(澳大利亚511105)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院李洁车小燕研究员临床检验诊断学学术型博士研究生第二临床医学院2013年05月03日广州博士学位论文IIIIIIIIIIIHIlUlIIIIIHIlUlY2405913登革病毒包膜E蛋白III区中和抗体的功能及结构分析博士研究生：李洁指导教师：车小燕研究员摘要登革病毒(DengueVirus，DENV)是一种通过蚊子(以埃及伊蚊和白纹伊蚊为主)传播的

3、病毒，属于黄病毒属的黄病毒科。DENV含有四个血清型：DENVl，DENV2，DENV3及DENV4。各种血清型的DENV之间存在60．70％的同源序列。人类感染了DENV的其中任何～种血清型后将引发从轻度自限性登革热(DengueFeveLDF)到重度甚至死亡的登革出血热(DengueHemorrhagicFever，DHF)及登革休克综合征(DengueShockSyndrome，DSS)。目前，对于登革热的研究已经持续进行了60多年，仍然没有安全有效的疫苗及治疗药物得以认证使用，因而近年来登革热已逐渐成为影响全球

4、热带及亚热带地区的主要公共卫生问题。每年世界上大约有5000万．1亿人感染DENV，其中大约50万人会出现严重的并发症从而引发2．5万人死亡。机体初次感染任一血清型的DENV所诱发的抗体能够中和同一血清型的再次感染，但是当机体再次感染其他三种不同的血清型时，此异型中和抗体会促进Fcy受体阳性细胞内病毒的摄入及复制，引发抗体依赖增强作用(antibody．dependentenhancement，ADE)，从而诱发登革热严重的并发症如DHF／DSS等。ADE作用的存在是登革热疫苗研发的主要障碍。因此，如果能够对抗体诱导中

5、和作用的机制及抗原位点有了全面深入的理解，对于疫苗的研发策略以及临床试验中疫苗效果及安全性的评估有着非常重要的意义。中文摘要DENV是一种有包膜的单股正链RNA病毒，基因组长度大约1lkb，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。三种结构蛋白分别是衣壳蛋E](capsidprotein，C)，膜蛋白(membraneprotein，M)和包膜蛋白(envelopeprotein，E)。7种非结构蛋白分别为NS1．NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5。E蛋白是成熟DENV颗粒表面的主要结构蛋白，作为宿主体液免

6、疫应答的主要抗原靶标，在受体的结合及病毒与细胞膜融合中起着关键性的作用。在病毒进入宿主细胞的过程中，内涵图环境的酸性化触发了病毒表面的E蛋8-聚体发生构象变化成为三聚体，该变化诱发了病毒与宿主细胞膜的融合，最终使得DENV的RNA基因组释放进入细胞质并启动了病毒的感染。目前人们已经通过结晶学(Crystallography)技术对虫媒病毒及蜱传脑炎的E蛋白进行了结构学分析，病毒颗粒表面的E蛋白含有3个结构区：位于中心的I区(EDI)：含有融合环(fusionpeptide，FP)的延展II区(EDII)；以及呈免疫球蛋

7、白样折叠的含有10个p．strands(A．G及AxCxDx)的EDIII。其中EDIII作为一个独立暴露于病毒表面的区域，成为了制备保护性单克隆抗体的重要抗原靶标，相关研究亦表明EDIII含有非常重要的中和抗原表位。在本实验室的前期工作中，我们用杂交瘤技术制备了一组抗DENVl．4EDIII的单抗，用酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)、免疫荧光试验(immunofluorescenceassay，IFA)和蛋白印迹实验(westemblot，WB)对这些单抗的

8、免疫反应性进行了分析，在此基础上，借助已经建立的中和实验方法学enzyme．1inkedimmunospotbasedmicro—neutralizationtest(ELISPOT-ⅢT)对单抗的中和活性进行检测，其中2株具备针对DENVl．4较高交叉中和活性的单抗3E31及2D73被选用进行下一步的功z日1匕l-,和结构学分析