登革病毒包膜蛋白ⅲ区单抗中和作用与作用机制研究以及登革病毒初次感染患者血清中和抗体反应分析

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文登革病毒包膜蛋白IⅡ区单抗中和作用与作用机制研究以及登革病毒初次感染患者血清中和抗体反应分析CharacterizationofMonoclonalAntibodyagainstDengueVirusEnvelopeProteinDomainⅢandtheNeutralizationPatternofConvalescentSerumfromPatientsPrimaryInfectedwithDengueVirustypeI课题来源：国家自然科学基金联合基金(Ul132002／L02)国家自然科学基金青年科学基金(81108243)学位

2、申请人黄艳芬导师姓名车小燕专业名称临床检验诊断学培养类型学术型培养层次硕士研究生所在学院第二临床医学院2013年5月9日广州硕士学位论文lIIIIHIIIIIIIIIlllllllllillllllJlllllUlY2406377登革病毒包膜蛋I兰tlII区特异性单抗的中和作用与作用机制研究以及登革病毒初次感染患者血清中和抗体反应分析硕士研究生：黄艳芬指导教师：车小燕研究员摘要登革病毒(denguevirus，DENV)属于病毒科(Flavivirade)黄病毒属(Flavivirus)，通过伊蚊等虫媒叮咬进入人体。根据血清抗原性的不同分为四个血清型(DENV-1、DEN

3、V-2、DENV-3、DENv-4)，人类感染其中的任何一型，症状轻者表现为无症状感染或发热，重者可出现严重威胁生命的登革出血热(denguehemorrhagicfever，DHF)或登革休克综合征(dengueshockSyndrome，DSS)。登革热主要流行于热带和亚热带地区，威胁着全世界2／5人口健康，但随着国际交流日益频繁、气候变暖、城市化进程加速等原因，登革病毒的流行范围也随之扩大。WHO数据表明，2000年后平均每年报道的感染人数达1亿，每50万～100万例DHF／DSS中约有2．2万例患者死亡，主要为儿童。登革病毒己成为全球公共健康的威胁。尽管登革病毒的

4、发现已经超过60年，但迄今为止，尚未研发出安全有效的登革疫苗或特异性治疗药物，主要原因在于对DHF／DSS的发病机制了解不足。DENV初次感染后体内能产生对四型病毒均有中和活性的抗体，但这一交叉保护作用仅能持续几个月，随后交叉反应性抗体的中和活性下调。当二次感染异型登革病毒时，这些交叉反应性或亚中和活性抗体能促进病毒进入靶细胞而获得大量复制，这一现象称为抗体依赖的病毒感染增强效应(antibody．dependentenhancement，ADE)，研究表明，ADE是DHF和DSS发生的主要危险因素。摘要登革病毒是一种有包膜的单股正链RNA病毒，呈二十面体结构，病毒体的直

5、径大约为50nm，基因组大小为10．7kb，编码三种结构蛋白(structuralprotein)，分别是衣壳蛋白(capsid，C)、前膜／膜蛋白(premembrane／membrane，prM／M)和包膜蛋白(envelope，E)，以及七种非结构蛋白(nonstructuralprotein，NS)，分别是NSI、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。其中，E蛋白是机能蛋白，它通过自身构象的改变或表面单元的重排，参与病毒与细胞吸附、病毒进入细胞、细胞膜融合以及病毒组装等病毒生命周期的重要过程。E蛋白是暴露于病毒体表面主要成份，因此，宿主针对DEN

6、V产生的中和抗体反应也主要针对这一蛋白。该蛋白在空间上形成3个不同的结构域(envelopeproteindomain，ED)，分别E1)I，EDII和EDIII，EDI位于中央，呈B环状结构，通过构象改变参与病毒进入靶细胞和核衣壳的脱壳；EDII位于侧部，含有在黄病毒属中高度保守的融合环，参与细胞膜融合；EDIII呈免疫球蛋白样折叠，被普遍认为含有与靶细胞受体结合的位点。三者均可在宿主体内诱发抗体反应，但是研究表明，针对EDI的抗体大多数是无中和活性的抗体；识别EDII融合肽免疫显性表位的抗体，在黄病毒属成员间存在广泛的交叉反应，但大多无相对应的交叉中和活性；EDIII

7、诱导产生的抗体中和活性最强，并且绝大部分为登革病毒特异性抗体。四型登革病毒之间E蛋白氨基酸序列同源性高达72％～80％，EDIII不仅存在血清型特异性中和表位，还存在登革病毒亚交叉或交叉反应性中和表位，因此，以EDIII作为登革疫苗研制的靶标可能产生同时针对四型登革病毒的中和抗体，具有广谱抗病毒作用。由于目前尚无获得批准的登革疫苗或抗病毒药物，对登革病毒和其他相关虫媒病毒的保护主要还是通过中和抗体介导。动物实验证明，EDIT[中和抗体不管是被动免疫或是治疗性免疫均能获得很好的保护效果。因此，若能获得具有强中和活性的EDIⅡ抗体