禽呼肠孤病毒s2、s4基因的克隆与序列分析

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1、分类号S852.4学校代码10129UDC619学号072010098禽呼肠孤病毒S2、S4基因的克隆与序列分析CloningandSequenceAnalysisoftheS2,S4GeneofAvianReovirus申请人：何建文学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病学指导教师：关平原教授论文提交日期：二〇一二年十二月摘要参考GenBank中禽呼肠孤病毒176株（ARV176）S2和S4基因分别设计两对引物，对禽呼肠孤病毒内蒙古地区分离株C-98和天津地区分离株T-98分别进行总RNA的提取，以其为模板，应用RT-PCR方法扩增病毒S2和S4基因的cDNA片段，将纯化的S

2、2和S4基因的cDNA片段克隆到pEASY-T1载体，转化DH5α感受态细胞，应用蓝白斑法筛选阳性重组质粒，通过PCR法鉴定重组质粒，然后将PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测定基因序列。测序结果表明：S2基因全长为1324bp，含有一个完整的开放阅读框，位于16bp～1266bp，编码416个氨基酸组成的σA蛋白。S4基因全长为1192bp，含有1个完整的开放性阅读框，位于24bp～1127bp，编码由367个氨基酸组成的σNS蛋白。并已将测得的序列成功登录GenBank，ARVC-98S2基因登录号JN641886；S4基因JN641885）；ARVT-98S2基因登录号JN641887；S4

3、基因JN641884。基因序列及其推导的氨基酸序列同源性分析表明：ARVC-98和ARVT-98分离株的S2基因与参考毒株ARV176、ARV918、ARV919、ARV1733、ARVGX2010、ARVS1133和DRVYJLS2基因的核苷酸同源性最高，在99.2%～99.8%之间；推导的氨基酸的同源性在98.1%～99.8%之间；与参考毒株MRV3、MRV3-jin-1和MRV3-T3DS2基因的核苷酸同源性在2.4%～5.5%之间；推导的氨基酸序列同源性却在29.1%～29.3%之间。ARVC-98和ARVT-98分离株的S4基因与参考毒株ARV176、ARV601SI、ARV919、

4、ARV1733、ARVGX2010、ARVS1133和DRVYJLS4基因的核苷酸同源性较高，在99.0%～99.8%之间，推导的氨基酸的同源性在98.9%～100.0%之间；而与参考毒株MRV3、MRV3-jin-1和MRV3-T3DS4基因的核苷酸同源性都为2.4%；推导的氨基酸序列同源性在3.6%～9.0%之间。遗传进化树分析显示：17株禽源呼肠孤病毒分离株的S2基因可分出3个不同的谱系，S4基因可分出4个不同的谱系，并且ARVC-98和ARVT-98与禽呼肠孤病毒株ARV176、ARVS1133、ARV1733、ARV919、ARVGX2010和DRVYJL的S2基因S4基因始终在遗传

5、进化树的同一个谱系中，且ARVC-98和ARVT-98与禽呼肠孤病毒株ARV176、ARVS1133、ARV1733、ARV919、ARVGX2010和DRVYJL遗传关系最近。证明了各谱系之间和同一个谱系之间的各个毒株的亲缘关系与致病性、毒力强弱和分离地区，分离时间没有相关性。关键词：禽呼肠孤病毒；S2基因；S4基因；RT-PCR；克隆；序列分析CloningandSequenceAnalysisoftheS2、S4GeneOfAvianReovirusAbstractAccordingtotheS2andS4genesequenceofAvianreovirusstrain176(ARV1

6、76)publishedinGenBank,twopairsofprimersweresynthesized.ThetotalRNAofARVisolateT-98andC-98isolatedinTianjinandinnerMongoliawereextracted.TheS2andS4geneofviruswasamplificatedbyRT-PCRandthenclonedintopESAY-T1plasmidandthensequenced.TheresultshowedthattheS2genewas1,324bp,andcontainedoneORF(16-1266bp)whi

7、chcodes416aminoacidswith1251bpandtwonon-codingregions.andtheS4genewas1192bp,andcontainedoneORF(24-1127bp)whichcodes367aminoacidswith1104bpandtwonon-codingregions.ThenucleotidesequencesofS2andS4genesre