乙肝病毒相关性肝癌患者血清中差异表达mirnas的筛选及其功能意义

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：圭至笪日苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信

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3、及其在乙肝病毒相关性肝癌发生发展中的作用。方法：1．选择在肝癌组织和癌旁组织中存在差异表达的miRNAs(miR-96、miR-18a、miR．10b、miR125a和miR．378)，用real-timeImPCR方法对小样本(15例HBV相关性肝癌患者和15例健康志愿者血清)检测其表达水平，以寻找在血清中可能存在差异表达的miRNAs。2．基于第一步筛选的结果，选择在HBV相关性肝癌患者血清中存在上调表达的miR-18a，用real．timeRT-PCR方法对大样本(86例HBV相关性肝癌患者和45例健康志愿者)血清检测其表达水平，并分析其作为HBV相关性

4、肝癌诊断标记的价值和与HBV相关性慢性肝病(肝炎及肝硬化)鉴别诊断的价值。3．采用慢病毒技术构建miR-378过表达慢病毒。4．在肝癌细胞HepG2和稳定表达HBV的肝癌细胞HepG2．2．15，用慢病毒介导上调在肝癌患者血清中下调表达的miR．378，采用MTT和克隆形成实验研究其在肝癌发生发展中的作用。5．生物信息学方法预测miR-378的靶基因，荧光素酶报告实验验证靶基因，并用western．blot方法在细胞水平研究上调miR-378表达对其靶基因表达的影响，分析miR-378在肝癌中作用的机制。结果：1．在15例HBV相关性肝癌患者和15例健康志愿者

5、血清中检测5个miRNAs的表达水平，与健康对照比，miR．18a在肝癌患者血清中显著上调表达(p=0．003，Mann—Whitney检测，下同)，而miR-378显著下调表达(p=0．044)。miR-96、miR．10b和miR-125a在肝癌患者和健康对照间表达差异无显著性(p均>0．05)。2．选择血清中表现上调表达的miR-18a，进一步用大样本(86例HBV相关性肝癌患者和45例健康志愿者)验证其血清中miR．18a的表达水平，获得与第一步实验相似的结果，且差异具有统计意义(P<0．0001)。综合分析所有样本(101例HBV相关性肝癌患者和60

6、例健康志愿者)的血清中miR-18a表达水平，受试者工作特征中文摘要乙肝病毒相关性肝癌患者盘清中差异表达miRNAs的筛选及其功能意义曲线(RoC曲线)显示，以miR-18a表达水平区分肝癌与正常人的曲线下面积为0．881，95％可信区间(cI)为0．829—0．933。以1．765为截断值，灵敏度为86．1％，特异度为75．0％。与30例HBV相关性慢性肝病(慢性肝炎和肝硬化)作血清miR-18a水平比较，肝癌患者血清miR-18a水平显著上调，差异具有统计意义(p<0．0001)，曲线下面积为0．775(95％CI：O．681—0．869)，以1．796为

7、截断值，区分肝癌与慢性肝病的灵敏度为77．2％，特异度为70．0％。3．成功构建miR-378的慢病毒表达载体，测序证实所插入基因序列正确。荧光显微镜检测证实PGCSIL．miRl378能在293T细胞中表达。4．用miR-378慢病毒载体感染肝癌细胞HepG2．2．15和HepG2，并测定细胞增殖活性和克隆形成能力。结果显示，与空载体组比较，miR-378慢病毒载体感染组肝癌细胞的增殖活性降低和克隆形成减少，差异有统计学意义(p<0．05)。5．用生物信息学方法预测Medl9和IGFlR为miR-378的靶基因，荧光素酶报告实验结果显示，与对照(NC)组比，

8、miR-378与Medl93’．UTR