rnai抑制牛朊病毒基因表达的相关试验研究

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1、InhibifionofP西oniexpressionbyRNAInterfefenceThesissubmittedtodaoAgriculturalUniversityInFulf'dlmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomySongShaokang(CollegeofAnimalScienceandVerterinaryMedicine)Supervisor：Prof．DongYajuanBaiXuejinQingdao．ChinaJun

2、e，2012学位论文独创性声明IIIIIIIIRillUlIIIIIlY2333091本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复

3、印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：导师签签字日期：年月日签字日日。青岛农业大学硕士论文摘要RNAi抑制牛朊病毒表达的相关试验研究摘要牛海绵状脑病俗称疯牛病，其主要症状是患牛精神状态失常、共济失调、感觉过敏和中枢神经系统灰质空泡化等。疯牛病给世界的畜牧业以及人们的生活带来极大危害，经济损失惨重。疯牛病的病原是朊病毒(PrP8钆它是由

4、机体正常的朊蛋白(PrP。)转化而来，而PrP。是由朊蛋白基因(朋胆)编码而来，有试驰正明PrP。的存在是朊病毒感染的基础。一方面由于机体正常的朊蛋白是固定在细胞膜上竹，提取纯化较为困难，为了进一步在细胞水平上研究牛朊蛋白的生理生化作用和朊蛋白疾病的发病机制，本实验在体外构建了表达PRNP基因的真核表达载体；另一方面由于RNAi能够在细胞中高效特异的降解与其序列同源的mlINA，诱导特定靶基因的沉默，一从而达到实现基因敲除或敲低的目的，因此，我们可以利用RNAi来敲低牛PrP。的量，从而使牛因缺乏转化的

5、底物而可能具有抵抗朊病毒病的能力。采用重叠延伸PCR法(SOE-PCR)全基因合成牛朋胗基因的cDNA，并克隆到真核表达载体pDsRED2-NI中，得到牛PRNP基因真核表达载体，转染牛骨髓问充质干细胞(BMSC)，并用800弘g／mLG418对转染的细胞进行药物筛选。结果显示通过SOE-PCR成功扩增了牛脚胆基因的cDNA，并构建成真核表达载体，得到稳定表达目的蛋白的删SC细胞。利用RNAi技术，根据牛源PRNP基因cDNA设计3段SiRNA序列和1个阴性对照序列，分别将其连接到RNA干扰载体pRNA

6、T-U6．1／Neo上构建成shRNA载体，并将shRNA载体转染牛骨髓间充质千细胞(BMSC)；通过Rea1-timePCR和Westernblotting筛选抑制效果最佳的载体，并用800“g／mLG418对转染最佳载体的细胞进行药物筛选。结果显示成功构建了3个靶向shRNA载体和1个阴性对照shRNA载体；3个靶向shRNA载体在不同时间段均在一定程度上下调了PRNPmRNA的表达，抑制了朊蛋白．PrP。的生成，得到了一个最佳干扰载体sh3；通过药物筛选出了稳定转染sh3载体的细胞单克隆。本研究获

7、得了牛朋舻基因真核表达载体和有效抑制朊蛋白基因表达的sh3载体，筛选出稳定表达脚咿基因和sh3载体的细胞单克隆，上述结果可为抗疯牛病的进一步研究奠定基础。关键词：疯牛病；撇朊蛋白；shRNA；BidSC；SOE—PCR青岛农业大学硕士论文摘要Inhib谳onofPrionexpressionbyRNAInterferenceAbstractBovinespongiformencephalopathycommonlyknown硒madcowdisease，themainsymptomsarethebovi

8、nesufferingfrommentalstatedisorders，ataxia,hyperesthesiaandcentralnervol／ssystemgraymattervacuolizationandsoon．Themadcowdiseasecausesgreatharmtotheworld’sanimalhusbandry勰welltopeople。slives．andbringsheavyeconomic10sses．The