wntβ-catenin信号通路在als转基因鼠发病中作用及其机制的研究

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1、山东大学博士学位论文Wnt/β--catenin信号通路在ALS转基因鼠发病中作用及其机制的研究姓名：陈燕春申请学位级别：博士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：管英俊;刘凯2012-10-15山东大学博士学位论文Wnt／p．catenin信号通路在ALS转基因鼠发病中作用及其机制的研究博士研究生：陈燕春专业：人体解剖与组织胚胎学导师：管英俊教授刘凯教授中文摘要【研究背景】肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是由脊髓、脑干运动神经元进行性变性所致的慢性神经退行性疾病

2、。临床表现为进行性全身肌肉无力、萎缩，最终导致瘫痪甚至死亡。研究发现，家族性ALS病例中，20％的患者与铜锌超氧化物岐化酶l(CuZnsuperoxidedismutase，SODl)基因突变有关，突变的类型超过125种，但病人的症状都相似，推测运动神经元的变性是一种或多种因素共同作用的结果。表达突变人类SODl的转基因小鼠能够再现ALS的症状，而表达相同拷贝的野生型人类SODl的小鼠却没有出现疾病的症状。SODlc'93A转基因小鼠是目前研究ALS发病机制的可靠动物模型。研究发现，ALS发病与生长因子缺乏、线

3、粒体异常、轴突异常、氧化应激、炎症、兴奋性毒性、蛋白折叠等有关，但是选择性运动神经元的退化机制仍不明确，尚无有效地治疗方法。经典Wnt／p．catenin信号通路是由多种蛋白质组成并相互作用的复杂网络，在多种细胞的增殖、分化、运动及形态发生中发挥重要作用。研究发现，Wnt信号通路异常与多种神经退行性疾病相关，如阿尔茨海默病(Alzheimer’SDisease，An)、帕金森病(Parkinson’Sdisease，PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’Sdisease，HD)等。但是，Wnt信号通路在A

4、LS发病过程中的作用尚不清楚。基于上述分析，我们设计了本实验。本实验采用SODlG93A转基因小鼠动物模型、原代培养的SODlc'93A转基因鼠星形胶质细胞模型和SODl突变型神经细胞模型(N2a神经细胞模型)，应用免疫荧光技术、激光共聚焦显微镜技术、RT-PCR、Westernblot、细胞培养等形态学和分子生物学方法，体内与体外实山东大学博士学位论文验相结合，从细胞、蛋白、基因等不同水平综合检测了Wnt／p．catenin信号通路中关键信号分子的表达变化，研究了Wnt／p．catenin信号通路与ALS发病

5、的关系，揭示了Wnt／p．catenin信号通路在ALS脊髓发病中的作用及机制，以期寻找治疗ALS的新靶点，为防治ALS的发生提供新的实验依据。【研究方法】1．选择ALS转基因小鼠60只，随机分为三组，分别于发病早期、中期和晚期不同阶段(95d，108d，122d)处死动物、分离脊髓，部分标本提取总RNA并反转录成cDNA，应用RT-PCR方法检测Wnt／13．catenin信号通路关键信号分子wm配体(包括Wnt3a、Wnt2和Wm7a)、GSK-3p、13-catenin和CyclinD1在ALS转基因鼠脊

6、髓mRNA水平的表达变化。部分标本提取总蛋白或核蛋白，应用Westernblot方法检测关键信号分子蛋白水平的表达变化。部分动物在ALS转基因鼠发病初期(90d)腹腔注射BrdU(50mg／kg体重，每天1次，连续5天)，在最后一次注射BrdU后1、14、28d(即95d，108d，122d)用4％的多聚甲醛行心脏灌注固定，分离出脊髓，制备冰冻切片，应用免疫组织化学染色、免疫荧光双标以及多标染色技术检测关键信号分子在ALS转基因鼠脊髓中的表达规律以及与细胞增殖、分化的相关关系。每组均选择同窝出生的野生型鼠做为对

7、照组。2．取出生第3d的ALS新生鼠，无菌条件下取出脊髓，胰蛋白酶消化，体外培养、纯化原代星形胶质细胞，以培养同窝出生的野生型鼠脊髓星形胶质细胞作为对照组。应用Westernblot和免疫荧光双标染色方法检测ALS鼠和野生型鼠原代培养星形胶质细胞中Wnt／p．catenin信号通路关键信号分子Wnt3a、fl-catenin和CyclinD1的表达变化。3．选取小鼠成神经瘤细胞系N2a，分别转染pEGFP．WT．SODl和pEGFP．G93A．SODl质粒，制备野生型和SODl突变型神经细胞模型。部分细胞于转染

8、后24h和48h提取蛋白，部分细胞用于制备细胞爬片。应用Westemblot和免疫荧光染色方法检测ALS细胞模型中Wnt／p．catenin信号通路关键信号分子Wnt3a、13-eatenin和CyclinD1的表达变化。【结果】1．Wnt／13．catenin信号通路关键信号分子在ALS转基因鼠脊髓中的表达变化2山东大学博士学位论文(1)Wnt3a、Wnt2和Wnt7a配体在ALS转