狂犬病病毒磷蛋白重组人5型腺病毒的构建及生物学特性的初步研究

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1、分类号：S852.65单位代码：10193密级：公开学号：2012630硕士学位论文狂犬病病毒磷蛋白重组人5型腺病毒的构建及生物学特性的初步研究ConstructionofRecombinantHuman5AdenovirusExpressingRabiesVirusPhosphoproteinandTheirPreliminaryBiologicalCharacterizations作者姓名：靳红亮学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：分子病毒学指导教师：扈荣良研究员所在学院：动物科学技术学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是

2、本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本

3、论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要狂犬病病毒（rabiesvirus，RABV）属于单负病毒目（Mononegavir

4、als）弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）成员，感染机体后引起一种以脑脊髓炎为主要临床症状的致死率极高的神经性疾病（狂犬病）。该病毒感染包括人类在内的大多数哺乳动物，一旦出现临床神经症状，致死率达100%。随着分子生物学技术的发展，对RABV致病机理的深入研究发现，构成该病毒基因组的结构蛋白成分在病毒感染、复制过程中发挥着极为重要的作用，其中RABV磷蛋白（phosphoprotein，P）可与宿主细胞一些蛋白成分相互作用形成复合物，揭示了P蛋白可在宿主与病毒相互作用过程中发挥多种功能。例如能够阻止干扰素调节因子3（in

5、terferonregulatoryfator，IRF3）的激活，从而阻止干扰素α/β的表达，进而逃逸宿主细胞的固有免疫。我们前期实验已经在细胞水平上证实了RABV强毒株BD06株和弱毒株SRV9株P蛋白对RIG-I依赖的干扰素通路均有一定的抑制作用，而P蛋白在体内对RIG-I依赖的干扰素通路是否有抑制作用，需要将P蛋白基因导入体内进行研究。对P蛋白功能的研究需基于该蛋白的独立表达，以避免RABV其他结构蛋白表达对其功能的影响。P蛋白的独立表达需要一种有效的真核表达载体介导。腺病毒载体作为一种常用的真核表达载体，其基因组大小适中，具有一定的外源基因承载能力，可

6、介导外源基因高效表达，制备高滴度病毒容易，表达的重组靶蛋白接近天然蛋白的生物学功能，且具有良好的生物活性，因此是阐明蛋白功能的有力工具。基于以上考虑，本研究拟选用复制缺陷型人5型腺病毒表达系统，分别构建RABV强毒株（BD06株）与弱毒株（SRV9株）P蛋白的重组人5型腺病毒，为进一步比较强弱毒株P蛋白对机体固有免疫的影响。我们分别将狂犬病病毒强毒株（BD06株）与弱毒株（SRV9株）完整的P蛋白基因编码区克隆入腺病毒表达系统穿梭质粒，获得重组穿梭质粒pacAd5-BD06-P和pacAd5-SRV9-P。重组穿梭质粒和骨架质粒被限制性内切酶PacI线性化后，

7、共转染HEK293AD细胞，经同源重组并包装出携带RABV-P基因的重组腺病毒rAd5-BD06-P和rAd5-SRV9-P。待病毒增殖稳定后，从病毒培养液上清中PCR扩增得到894bp大小的目的条带，证明目的基因P蛋白已重组到腺病毒基因组中；取重组病毒培养物经2%磷钨酸负染，于透射电镜下可观察到腺病毒粒子的典型特征。利用P蛋白基因全长扩增引物对重组腺病毒感染的HEK293AD细胞进行RT-PCR扩增均得到了894bp大小的目的条带，证实P蛋白基因可被腺病毒介导I在HEK293AD细胞的转录；以FITC标记的抗P蛋白单克隆抗体对2株重组腺病毒感染的复制型细胞系

8、和非复制型细胞系进行直接免疫荧光检测，