pfudna聚合酶常见问题

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1、PfuDNA衆启潑…••常见问题1、PfuDNA聚合酶的精确度如何？因为具有3'“5‘外切酶(校对)活性，PfuDNA聚合酶是现今所描述过的所有热稳定酶屮精确度最高的一种。普洛麦格公司的PfuDNA聚合酶的出错率大约是1X10-6/每碱基对，而TaqDNA聚合酶的出错率大约是1X10-^1每碱基对。普洛麦格公司推荐将PfuDNA聚合酶使用在那些需要高精确度的PCR应用中，包括克隆、基因表达和突变分析。2、PfuDNA聚合酶产牛平未端PCR片断吗？因为天然的校对活性，PfuDNA聚合酶产生的PCR片断是

2、平未端的。收集到的有关PfuDNA聚合酶的数据表明90%的PCR产物是平未端的。这种特性极大地提高了平未端连接的效率。3、PfuDNA聚合酶产生的PCR产物怎样才能被克隆到普洛麦格的「载体上？平未端DNA片断在经过修饰后，也就是在dATP存在的情况下，使平未端片段与TaqDNA聚合酶共同保温，就能促进其被克隆进「载体。普洛麦格公司的pGEM®・T和pGEM®-Teasy技术手册(TM042)中有讲述尾端加A的操作程序。4、PfuDNA聚合酶的PCR反应条件与常规PCR反应条件有什么不同？为了减少由3'

3、・5‘外切酶活性引起的引物降解，普洛麦格强烈推荐在冰浴上添加所有试剂并且在温度达到60-65°C时加入PfuDNA聚合酶以便进行热启动或者在冰浴上添加试剂后放在预热到95°C的PCR仪上。PfuDNA聚合酶比TaqDNA聚合酶的延仲反应速率低。因此我们推荐的扩增延仲反应时间为每kb需2分钟，而PfuDNA聚合酶仅需要1分钟。普洛麦格公司为PfuDNA聚合酶提供10X反应缓冲液，其屮包括20mMMgSO4o此酶在MgSCU屮活性最佳，而最佳的镁浓度是2mMo5、PfuDNA聚合酶怎样影响PCR引物设计?

4、由于校对活性而具有的高精确度可引起引物从3'端被降解。在设计引物时这个降解速率应考虑进去。最初的15个5’碱基应该具有几乎不被降解的能力。这样,用于PfuDNA聚合酶反应的良好的引物长度应是20・30碱基。另一个防止引物被降解的办法是在合成引物中引进一个磷酸化(phosphorothioate・coupled)的碱基。6、PfuDNA聚合酶怎样与其它热稳定酶相比？PfuDNA聚合酶和其它儿种常用的DNA聚合酶的性质列在表1中，某一个酶在某个特定的应用中也许比其它的酶更有用。当选用酶时，请参考表2和表3

5、。表7：普洛麦格几种热稳定酶的性质TaqDNA聚合酶TflDNA聚合酶PfuDNA聚合酶TliDNA聚合酶Taq珠®热启动聚合酶微生物来源嗜热水生菌ThermusflavusPyrococcusFuriosisThermococcuslitoralisThermusaquaticusPCR最佳条件:1分钟1分钟2分钟2分钟1分钟延伸时间/kb70-75°C70-75°C70-75°C70-75°C70-75°C延伸温度镁1-4mM1-4mM2-4mM2-4mM1-4mMPH@25°C7.0-7.57.

6、0-7.58.0-9.07.0-7.57.0-7.5dNTP40-200uM40-200uM40-200uM40-200uM40-200uM引物0.1-1.0uM0.1-1.0uM0.1-1.0uM0.1-1.0uM0.1-1.0uM外切酶活性有有无无有3-3外切酶活性无无有有无PCR产物未端3"・A3'・A平平3"・A现有包装100u5()0ulOOuIOOOulOOu500u50u100珠2500u提供的浓度5u/ul5u/ul2-3u/ul3u/ul1.25u/珠表2普洛麦格公司热稳定酶的功能比

7、较TaqDNATflDNAPfuDNATliDNATaq珠讪热启动聚合酶产量***********

8、准确度*/精度********［特异性*******•准确度指在一个错误的碱基被合成前已合成的碱基数目•特异性在PCR中指排除错误引物配对，引物二聚体，或其它在低温下可发生的反应的能力表3：PCR应用的比较PCR反应厂例子—产物■常规PCR检测、PFLPTaqDNA聚合酶、TflDNA聚合酶精度PCR—

9、克隆、基因表达、突变分析PfuDNA聚合酶高特异性PCR室温准备多重PCRTaq珠T"热启动聚合酶其

10、它：操作需要Vent®TliDNA聚合酶RT-PCR使用普洛麦格TflDNA聚合酶进入RT-PCR系统