对TaqDNA聚合酶和PlatinumTaqDNA聚合酶的活性分析.doc

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1、对TaqDNA聚合酶和Platinum?TaqDNA聚合酶的活性分析在37℃进行5个小时。一步得到高灵敏度Platinum?QuantitativeRT-PCRThermoScript?One-Step系统提供的步骤可以高灵敏度地检测起始物质。仅需在反应混合物中加入总RNA或poly(A)＋，基因特异性逆转录和扩增引物及荧光探针，然后就可以开始实验了。您可以精确定量到最低10个目的RNA分子或从1pg总RNA（图18）。除了高特异性外，一步法步骤减少了反应变量，降低了污染可能性，适合高通量应用。图18一步法RT-PCRβ-actinmRNA的定

2、量。使用Platinum?QuantitativeRT-PCRThermoScript?One-Step系统扩增六份不同量的Hela总RNA，然后在ABIPRISM?7700上，使用6-FAM标记的TaqMan?探针检测。使用了TAMRA做为报告信号（Rn）均一化的被动参考。超越竞争对手总而言之，领先的逆转录和PCR技术同一步法整合在一起会尽您所需，产量、特异性和灵敏度，得到高水平的qRT-PCR。图19将使用Platinum?QuantitativeRT-PCRThermoScript?One-Step系统与使用竞争者系统得到的结果做了比较。

3、Platinum?系统表现出更低的Ct（阈循环）和更高的产量，使其对于检测低拷贝的mRNA转录本更敏感。图19使用Platinum?QuantitativeRT-PCRThermoScript?One-Step系统获得高产量使用Platinum?QuantitativeRT-PCRThermoScript?One-Step系统（蓝点）或竞争对手P的QuantitativeOne-StepRT-PCR系统（红点），按生产厂商的建议，对145bp的β-actin片段进行qRT-PCR分析。起始RNA从5μg到50fg按10倍递增变化。使用TAMRA

4、做为被动参考收集均一化的相对荧光（Rn）。图版A：线性量扩增图。图版B：标准曲线图。获得一步法的成功第五章增加PCR特异性引物设计细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：*典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序

5、列杂交慢，从而降低了产量。*选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。*设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。*避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。*避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。*避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。*避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值

6、时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。引物退火温度引物的另一个重

7、要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。设定Tm有几种公式。表5列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使

8、用近邻分析法。表5.估算Tm的公式根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可