《当归属药用植物及药材的dna条形码鉴别研究——兼论dna条形码在中药材鉴定中的原则》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
中国中医科学院硕士学位论文当归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究--兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则姓名：张彬申请学位级别：硕士专业：中药学指导教师：黄璐琦；曹军20120526 "-3归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则摘要中药鉴定是中医药研究的重大课题，其宗旨是为了解决中药材“真伪优劣”的问题，而传统的中药鉴定方法如性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别等由于存在主观性强、稳定性和重复性差等方面的缺陷。DNA条形码作为可用于中药分子鉴定的新技术，可以迅速、准确鉴定物种，待测样品只需经过DNA提取、PCR扩增、电泳检测、基因测序和数据库比对，便可确定物种，能方便地将混品、伪品和正品进行区分，因而DNA条形码技术得到中药鉴定工作者越来越广泛的关注。而目前关于DNA条形码应用于中药鉴定的研究存在两方面的局限性：1)均未阐明作为研究对象的药材基原与混伪品或非药用的近缘种的物种间是否进化完全，即互为单系，这是药材分子鉴定的前提，在此基础上进行药用植物和药材的分子鉴别才有客观全面的分子尺度。2)多采用原植物新鲜叶片为研究对象，而不是实际应用中的饮片和药材，DNA条形码技术能否克服药材材料的特殊性和DNA经炮制加工后降解和断裂等问题，还值得尝试和验证。本研究选取药用资源极其丰富的当归属(AngelicaL．)植物及药典记载药材白芷、当归和独活为研究对象，基于分子系统学理论，利用DNA条形码技术，选取叶绿体trnH-psbA、matK、rbcL片段和核基因ITS，进行DNA提取、PCR扩增和测序，基于K2P模型采用邻接法(NJ)建立系统进化树，以期达到以下研究目的：①筛选出当归属植物DNA条形码研究最合适的片段；②评价DNA条形码对当归属(药用)植物鉴别能力；③探讨DNA条形码对药材市场上当归和独活饮片混用及掺伪问题的解决能力；④研究白芷药材加工炮制过程对成功进行分子鉴别的影响；⑤阐明DNA条形码对白芷4个商品品种(川、杭、祁、禹)进行产地鉴别的可能性；⑥初步探讨中药白芷的栽培起源问题。得到结果如下：1．筛选出ITS为当归属植物DNA条形码研究最合适的片段。共得到当归属25种(含4个亚种)原植物的384条序列，其中ITS96条，trnH-psbA96条，mark96条，而以96条。所选4个片段的DNA提取、PCR扩 中国中医科学院二OO九级硕士研究生学位论文增和测序的成功率均为100％，可见在通用性上无差别，但在物种鉴定上，ITS明显优于其余三个片段。四个片段的种间遗传距离均大于种内遗传距离，且从大到小依次为ITS>trnH-psbA>matK>rbcL。其中，ITS序列种问遗传距离为种内遗传距离的50倍之多，种间／种内遗传距离界限明显，可以很好地用于物种间鉴定。在所构建的以支持率≥50％为闽值作为成功鉴别物种界限的NJ中，ITS能从25种当归属原植物中成功鉴别出19种(76％)，而其余三个片段对当归属25种植物的鉴别能力分别为trnH-psbA8种(32％)、matK11种(44％)、rbcL5种(20％)。因此，本研究推荐ITS为当归属植物DNA条形码的标准片段。2．DNA条形码对当归属16种药用植物能够进行有效鉴别。本实验的25种原植物中，有19种可做药用。在基于当归属研究最适宜的条形码片段ITS序列建立的NJ树中，19种药用植物中除了疏叶当归(么．1ax／foliata)、紫花前胡(彳．decursiva)和骨缘当归(4．cartilaginomarginatavar．foliata)无法分开外，其余16种药用植物均能很好地和其他各种区分开，当归属药典记载药材白芷、独活和当归分别位于NJ树的上中下三部分，各自进化为单系，可作为可靠的鉴别依据进行药材质量控制和真伪鉴定。3．DNA条形码能成功应用于当归和独活饮片鉴别。基于上述原植物ITS序列建立的NJ树中当归和独活原植物均为单系(支持率100％)，因此可以进行分子鉴定。选取全国10个地区的当归饮片共59个样品，独活饮片共58个样品参与实验，得到92条ITS序列，trnH-psbA103条序列，marK89条序列，rbcL103条序列，PCR成功率／N序成功率为ITS(92．3％／85．2％)、trnH-psbA(96．6％／91．2％)、marK(88．9％／85．6％)、rbcL(92．3％／95．4％)。4个片段在当归和独活饮片中均能以较高成功率进行PCR扩增和测序，DNA条形码在当归和独活饮片鉴别中具有技术上的可行性。采用NJ法将25种原植物与当归、独活饮片的ITS序列一起构建系统进化树。结果表明，在当归饮片中，来自9个地区(北京、河津、成都、长沙、淄2 当归属药周植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则博、武汉、滨州、周口、七台河)的全部当归饮片和来自德州的GDZ一1都与当归原植物(彳．sinensis)聚为一支，均为当归正品；而来自德州的样品GDZ．2、GDZ．4、GDZ．5、GDZ．7、GDZ．8虽与当归原植物聚为一大支，但又独自聚为-d,支，其与当归原植物相差约40个碱基，在Genbank上进行BLAST，与欧当归(Leristicumofficimale)序列完全一致，推测其为欧当归(市售当归饮片常见伪品之一)。在独活饮片中，来自8个地区(北京、河津、成都、长沙、淄博、武汉、周口、七台河)的全部独活饮片和来自滨州的HBZ一1均与独活原植物重齿毛当归(Abiserrata)序列聚为一支，为独活正品；来自滨州的样品HBZ一4、HBZ一6和德州的HDZ一4、HDZ一6、HDZ一8与上述当归伪品欧当归序列完全一致，聚为一支，推测这些样品也为欧当归(欧当归在市场上也作独活饮片的伪品)。为进一步验证DNA条形码鉴定的准确性，又对上述分子鉴定为欧当归的样品进行显微鉴定，发现其与正品当归和独活显微结构有较大差异，经查阅文献，与欧当归显微结构相似，显微鉴定结果与DNA条形码分子鉴定的结果一致。4．DNA条形码对白芷不同加工程度药材分子鉴定的探讨本研究同样选取来自上述10个地区的白芷饮片共60个样品，以及白芷药材4个品种的传统产区遂宁、合肥、安国、禹州的生药材(“个子货”)共14个样品。得到白芷饮片ITS序列7条、trnH-psbA序列15条、rbcL序列29条和matK序列10条，PCR成功率／N序成功率分别为：ITS(46．7％／25．0％)、trnH-psbA(40．0％／62．5％)、rbcL(51．7％／93．5％)、matK(30．0％／55．6％)；得到白芷生药材ITS序列12条，trnH-psbA序列1l条、rbcL序列12条和marK序列12条，PCR成功率／测序成功率分别为ITS(100％／85．7％)、trnH-psbA(85．7％／91．7％)、rbcL(92．9％／92．3％)、matK(100％／85．7％)，可以看出白芷药材4个片段PCR成功率显著高于白芷饮片，两者测序成功率除rbcL相差不大外，其余三个片段白芷药材均高于白芷饮片，可能是白芷饮片经加工炮制后，淀粉多而粉性大，提取的DNA质量差、杂质多的缘故。因此，某些药材的加工过程对成功进行分子鉴别是有影响的，针对特殊材料况如何改进方法、提高3 中国中医科学院二OO九级硕士研究生学位论文该技术应用的通用性，建立起DNA条形码用于药材分子鉴定的标准化体系，将是药材分子鉴定技术又一个质的飞跃。5．DNA条形码应用于白芷的产地鉴别能力有限为了对白芷四个商品品种进行产地鉴别，在白芷药材4个品种的传统产区遂宁(川白芷)、合肥(杭白芷)、安国(祁白芷)、禹州(禹白芷)各选取2．4个白芷药材根(“个子货”)，得到ITS序列12条，trnH-psbA11条，matK12条，rbcL12条。将所得四个片段的序列分别比对后发现，各片段4个产地的白芷药材序列完全一致，无法鉴别开来，表明DNA条形码对白芷产地鉴别是无效的。药材产地鉴别的实质是生物学种下居群水平的遗传分化问题，可以依据群体遗传学和分子谱系地理学的理论，选用相对于物种水平具有更快进化速率的DNA片段，分析其遗传分化程度，来寻找作为药材产地鉴别的分子地理标识。6．DNA条形码对白芷栽培起源的研究选取白芷药材4个品种共14个个体，得到川白芷ITS序列2条、杭白芷和禹白芷各3条、祁白芷4条，将所得共12条ITS序列与当归属原植物ITS序列共同构建NJ树，得到4个品种均与兴安白芷(4．dahurica)亲缘关系最近，与之前一些学者认为的白芷栽培起源于台湾白芷(么．dahuricavar．formosana)的观点不一致。因此，对白芷的栽培起源问题需要进一步进行分子谱系地理学的深入研究。基于上述实验结果，本研究结论如下：(④ITS是对当归属(药用)植物分子鉴别最适合的片段；②利用当归属DNA条形码研究最适合的片段ITS可以准确鉴别当归与独活饮片的混伪品。③有些药材的加工炮制过程对成功进行分子鉴定是有影响的(如本研究中自芷生药材到饮片的加工过程使分子鉴定的成功率显著下降)。@DNA条形码对白芷产地鉴别是无效的。⑤本研究白芷4个品种均与兴安白芷亲缘关系最近，与之前学者认为的白芷栽培起源于台湾白芷的观点不一致，需要进一步进行分子谱系地理学的深入研究。本研究的创新性为：首次建立了DNA条形码用于药材鉴定的科学方法和指导原则，即DNA条形码用于药材鉴定的“两步法”：一、基于分子系统学理论，4 当归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则利用所需鉴别药材所在的属最适合的DNA条形码片段构建系统进化树，确定所要鉴别药材原植物物种在整个属中系统位置的单系性。二、在物种分子界限得以明确之后，再利用DNA条形码对药材进行鉴定，对于存疑药材，可以根据其位于该属植物中的系统进化地位，对其混淆和替代现象提供科学的阐释和鉴定依据。关键词：DNA条形码；分子系统学；当归属；药用植物；药材鉴别 中国中医科学院二OO九级硕士研究生学位论文6 当归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则AbstractTheidentificationofherbsisamajorissueinTraditionalChineseMedical(TCM)research，thepurposeofwhichistoidentifythegenuineandhigh—qualityofherbs，eliminatethefalseandretainthetruth．Thetraditionalmethodsforherbsidentificationincludecharacteridentification，microscopicidentification，physicalandchemicalidentificationhavetheshortcomingsinobjectivity，stabilityandrepeatability．DNAbarcodingisthelatesttechnologyinthemolecularidentificationmethodsusedinChinesemedicinemolecularidentification，canidentifythespeciesrapidlyandaccurately，thesamplescanbeeasilyidentifiedjustbyDNAextraction，PCRamplification，electrophoresisdetection，genesequencinganddata-basealignment，thusreceivedmoreandmoreattention．TherearetwolimitationsoftherecentresearchesthatuseDNAbarcodestoidentifytheherbs，1)thepreviousstudiesonthetechnologyofDNAbarcodingfortheidentificationofherbsignoreanimportantissue，thatisthepremiseofbarcode-basedidentificationofherbsisthespeciesoftheherbsandtheiradulterantshaveDNAdifferences．thatistobemonophy’leticwitheachother．Thisisthepremiseofherbidentification，onlybasedonthis，cangivethemolecularidentificationofmedicinalplantsandherbsaobjectiveandcomprehensivemolecularscale．2)thepreviousDNAbarcodingstudiesoftenusefreshleavescollectedfromtheoriginalplantsastheresearchmaterials，hence，theDNAofherb-piecesmaybedegradedandfracturedafterparticularityprocessing，theaimforDNAbarcodingiswhetherDNAbarcodetechnologycanovercometheproblemandachievethepurposeoftheauthenticityChineseherbs，eliminatethefalseandretainthetruthornot，whichisalsoworthtotryandverify．Inthisstudy，weusetheoriginalplantsofAngelicaandherbsofDanggui，DuhuoandBaizhiasourresearchobjects．BasedonmolecularsystematicandDNAbarcodingtechnology，weselectonenuclearandthreechloroplastDNAregions(ITS，7 中国中医科学院二OO九级硕士研究生学位论文rbcL，matKandtrnH-psbA)todoDNAextraction，PCRamplificationandsequencing，thenbasedontheK2Pmodelusingtheneighborjoining(NJ)toestablishthephylogenetictree，toachievethepurposes，①ToselectthemostsuitableDNAregionforDNAbarcodingresearchofAngelica；②ToevaluatetheabilityofDNAbarcodingtoidentifythemedicinalplantsofAngelica；⑧TodiscusstheaccessibilityofusingDNAbarcodingtoidentifythemisusesituationbetweenDangguiandDuhuo；@MolecularidentificationusedbyDNAbarcodingresearchofBaizhiindifferentdegreesofprocessing；⑤LocalityidentificationofBaizhi(Chuan，Hang，Qi，Yu)；@ResearchonthecultivatedoriginofBaizhi．．Theresultsareasfollows：1．ITSisthemostsuitableDNAregionforDNAbarcodingresearchofAngelicaThereare25speciesoriginalplantsofAngelica(includingfoursubspecies)，aftertheanalysisoftheexperimentalresultsoftheoriginalplant，wegetatotalof384sequences，including96sequencesofITS，96sequencesofmarK,96sequencesofrbcL，and96sequencesoftrnH-psbA．ThesuccessratefortheselectedfourregionsofDNAextraction，PCRamplificationandsequencingwas100％，showingnodifferenceintheversatility，butthespeciesidentification，ITSshowssignificantlybetterthantheotherthreefragments．Allthefourfragmentsofinterspecificgeneticdistancegreaterthantheintraspecificgeneticdistance，andthedecreasingorderisITS>trnH-psbA>matK>rbcL．Especially，ForITS，theinterspecificgeneticdistanceis50timesmorethanintraspecificgeneticdistance，thelimitsofinterspecific／intraspecificgeneticdistanceisobviously，ITSiswellfortheidentificationofspecies．Buildsupport兰50％thresholdasthesuccessfulidentificationofspeciesboundariesNJtree，ITSCansuccessfullyidentify19speciesoriginalplantfrom25species(76％)，whiletheabilitytoidentifytheremainingthreefragmentsaretrnH-psbA8species(32％)，matK1species(44％)，rbcL5species(20％)．8 "-3归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则Therefore，thisstudyrecommendedITSasthestandardregionsoftheDNAbarcodingresearchofAngelicaplants．2．DNAbarcodesareabletoidentify16speciesofmedicinalplantsofAngelicaeffectively25speciesoforiginalplantsareselectedinthisexperiment，and19specieshavemedicinaleffect．BasedontheNJtreeofITSsequences，19speciesofmedicinalplantsexcepttheA．1ax@liata,A．decursivaandA．cartilaginomarginatavar．foliatacannotbeseparated，theremaining16speciesofmedicinalplantscallbewellseparatedfromoneandanother．Thisisanewapproachfortheidentificationofnationalandlocaldrugcanbeusedasareliableidentificationbasedonmedicinequalitycontrolandauthenticityoftheidentification．3．DNAbarcodingcansuccessfullyappliedtotheidentificationofDangguiandDuhuopiecesThepreviousresultsshowthattheoriginalplantsofDangguiandDuhuoarebothmonophyleticintheNJtreeestablishedbyITS，SOwecanusemolecularidentificationtoidentifyDangguiandDuhuopieces．Thereare59samplesofDangguiand58samplesofDuhuoinvolvedinthisstudy．Weget92ITSsequences，103trnH-psbAsequences，89matKsequencesand103rbcLsequences．ThePCRefficiency／sequencingefficiencyisITS(92．3％／85．2％)，trnH-psbA(96．6％／91．2％)，marK(88．9％／85．6％)，rbcL(92．3％／95．4％)．FourregionsintheDangguiandDuhuopiecesshowahigherefficiencyofPCRamplificationandsequencingtechnicalfeasibilityofDNAbarcodesintheidentificationofDangguiandDuhuopieces．UsingtheITSsequencesof25speciesofAngelicaoriginalplantsandDangguiandDuhuopiecestogethertoestablishtheNJtree，theresultsshowthat，intheDangguipieces，thesamplesfromDezhou(DZ)GDZ-2、GDZ一4、GDZ-5、GDZ-7、GDZ-8arethealternativeusesofLeristicumofficimale，andtheothersamplescomefrom9differentregionsarethesamewiththeorginalplantofA．sinensis，whichwecandefineitasgenuine．InDuohuopieces，thesamplesfromBinzhou(HBZ一4、9 中国中医科学院二OO九级硕士研究生学位论文HBZ一6)andDezhou(HDZ一4、HDZ一6、HDZ-8)，areallLeristicumofficimaletoo．WehavedonetraditionalcharacteristicidentificationbetweenthesubstitutionsandthefaketodeterminethefeasibilityandreliabilityofDNAbarcoding．4．TheinvestigationofidentificationofBaizhiindifferentprogressingmethodswhenusingDNAbarcoding．Inthisstudy，weselect60samplesfrom10differentregionsand14samplesfrom4traditonalproductionareas，includingSuining，Hefei，Anguo，Yuzhou．Wehavegot7ITSsequences，15trnH-psbAsequences，29rbcLsequencesand10matKsequences，thePCRefficiency／sequencingefficiencyis，ITS(46．7％／25．0％)，trnH-psbA(40．0％／62．5％)，rbcL(51．7％／93．5％)，matK(30．0％／55．6％)，andwecanconcludethat4regionsofthePCRefficiencyinBaizhicruddrugsishigherthaninBaizhipieces．ThesequencingefficiencyinBaizhicurddrugsisalsohigherexceptrbcL．ThereasonsisthatthereismorestarchyinBaizhipiecesafterpurificationandweshouldestablishanewmethodtoidentificationofherbsusingastandardsystemtomakeabreakthroughinherbsidentification．5．TheabilityofDNAbarcodingthatappliedtolocalityidentificationofBaizhiisinadequateForlocalityidentificationof4commercialspeciesofBaizhi，WecollectChuan(Hang)，Qi(Yu)Baizhifromtheircountryoforgin，eachplacecollect2-4samplesofthefleshroot(cruddrug)，drynaturallybeforetheexperiment．Weget12sequencesofITS，11sequencesoftrnH-psbA，12sequencesofmatK,12sequencesofrbcL．Afterthefourregionsobtainedsequencesarecompared，wefindthateachofthefourDNAregionshavethesamesequence，theycarlnotbeidentifiedfromeachother．Theessenceoflocalityidentificationisthegeneticdifferentiationproblemofpopulaions．Itcanbebasedonthetheoryofpopulationgeneticsandmolecularphylogeography，whichshouldchoosetheDNAregionswithrelativefasterrateofevolutionthaninspecieslevel，SOthattoanalyzethedegreeofgeneticdifferentiationandfindthemolecularidentificationofmedicinaloriginofgeographicalindications．10 当归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则6．ReaserchonthecultivatedorginofBaizhi．ForthequestionofBaizhicultivatedorigin，weuse14samplesfromthe4commercialspeciesofBaizhi，andget2ITSsequencesofChuanBaizhi，3ITSsequencesofHangBaizhiandYuBaizhi，4ITSsequencesofQiBaizhi，weuseallthe12sequencesofITStogetherwiththeITSsequencesoftheoriginalplantsofAngelicatoestablishtheNJtree，theresultsshowthatthe4speciesofBaizhihavetheclosestrelationshipwithXingAnBaizhi(A．dahurica)．theconclusionisinconsistent而ththethinkoftheoriginalplantofBaizhiisTaiwanBaizhi似．dahurica1，at"formosana)．Therefore，thequestionofBaizhicultivatedoriginneedfurtherdiscussionwiththenewtheoriesandmethods．Theconclusionofourexperimentsareasfollowing，①ITSistheappropriatesequenceindistinguishingtherightfromwronginAngelicawhenusingDNAbarcoding，@DNAbarcodingisthemostsuitablemethodtoseparateDangguiandDuhuowhenusingITS．③ThisstudyfindthatwhenweuseDNAbarcodingtoidentifyherbs，thefreshplantcannotcompletelyreplacethecruddrugsandpiecetoverifytheabilityofDNAbarcodingtosolvepracticalproblems，thatisbecausesomeherbsafterconcoctedprocessingwillaffecttheefficiencyoftheexperiment．Theinnovationinthisstudyisthat，wefirstestablishthescientificmethodandguidingprinciplesofDNAbarcodingfortheidentificationofherbs，thatisthe“two．stepmethod”fortheidentificationofmedicinalmaterials．Thefirststepis，weshouldfirstlydistinguishtheappropriateDNAbarcodingsequencestoestablishthephylogenetictreebasedOilthetraditionalmolecularsystematic，todeterminetheidentificationoftheoriginalmedicinalplantoftheherbsthatwewanttoidentifyintheentiresystemlocationisamonophyletic．Thesecondstepis，afterthespeciesboundariestobeclear，wecanuseDNAbarcodingtomakeaccurateidentificationoftheherbs．Fortheherbsthatindoubt，accordingtOtheevolutionofthepositioninthesystemoftheorginalplantsofthegenus，toprovideascientificexplanationandidentificationcredentialsoftheirconfusionandsubstitution．11 中国中医科学院二OO九级硕士研究生学位论文Keywords：DNAbarcodes；Molecularsystematics；Angelica；Medicinalplant；Identificationofherbs12 当归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则第一章前言1．1中药材分子鉴定理论基础及研究进展中医药是中国传统文化的瑰宝，而自古以来对中药材鉴定都是中药研究的重要课题，从《神农本草经》的“神农尝百革，一日遇七十毒”开始，中药鉴定从最初凭借口尝、眼观的经验鉴定，到后来借助简单仪器和试剂的经典鉴别，学术界对于中药鉴定的方法一直进行着孜孜不倦的探索和改进。随着现代科技的进步，加之中药材使用背景和来源复杂，混用、替代、以假充真现象愈加频繁，对中药准确鉴定提出了严峻挑战，也对中药鉴定方法的改进提出了更为迫切的要求。药材使用的混乱在很大程度上制约了中医药的安全有效性，阻碍了中医药向现代化、标准化和国际化发展的进程。因此为了健全我国中医药应用体系，寻找更为准确有效的药材品质检控方法、加强对中药材原料和产品质量的监控，显得十分必要。目前，中药材鉴定的传统手段主要有性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别、生物鉴别和基源鉴定等，这些传统形态学鉴定方法存在的4个缺陷：①表型可塑性和遗传可变性，容易导致不正确的鉴定；②形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元；③形态学鉴定受生物性别和发育阶段的限制；④虽然现代交互式鉴定系统是一个很大的进步，但它要求很高的专业技术，一旦操作不正确容易导致错误的鉴定，而化学方法虽有助于植物分类，但多不能用于物种鉴别‘卜21。总而言之，传统鉴定特征在生物学上均为物种的遗传表现型，不仅会受到遗传因素的影响，而且与生物体的生长环境、发育阶段、人类活动如人工栽培和引种驯化、加工炮制等方面都有密切关系，变异性和可塑性很大。因而，以上传统中药鉴定方法难免存在主观性强、稳定性和重复性差等方面的缺陷，限制了其应用和发展。近年来，随着科技的不断进步，以分子生物学和居群遗传学为基础的分子系统学取得了长足的发展，有越来越多的学者尝试将其应用于现代中药材鉴定工作。分子系统学(molecularsystcmatics)是用分子生物学的技术和方法来研究生{3 中国中医科学院二OO九级硕士研究生学位论文物多样性，以及它们之问演化关系的科学。分子系统学的研究首先是通过现代分子生物学技术，获得物种特定遗传标记的大量数据，然后把这些数据进行相关的数学分析而对研究结果进行解释和说明【3】；分子系统学主要包括两大领域，即系统发生学(Phylogenetics)和种群／群体遗传学(Populationgenetics)。系统发生学主要研究物种多样性和种间系统发生(phylogeny)。系统发生是指一群有机体发生或进化的历史。系统发生树(phylogenetictree)就是描述这一群有机体发生或进化顺序的拓扑结构。根据系统发生树的具体表达形式，可分为物种(或种群)树(speciesorpopulationtree)与基因树(genetree)。对生物学家来说，重要的是知道某些物种或种群其分歧的历史及在每一次分歧后趋异时间，当这些历史事件以系统发生树的形式表现时，此时的系统发生树称为物NO(或种群)树。对任何一类生物，要想知道确切的物种(或种群)树是非常困难的，但我们可以检测这类生物所包含的一些基因的进化关系来推断物种(或种群)树川。群体遗传学是根据遗传学原理，采用数学、统计或其他方法研究生物群体的遗传结构及其变化规律以及种群演化规律的一门学科，主要研究种内进化。此处所说的群体被称作孟德尔群体。孟德尔群体是一个繁育单位、交配单位，在这样的群体内所有单倍型构成一个共同的基因库。所有个体都分享这个共同的基因库，彼此间可进行基因的自由交流。从这个意义上来说，孟德尔群体内的个体必须是同一物种的个体，只有这样才能组成共同的基因库，并通过相互交配交流基因。生物学家曾对物种概念进行过许多探讨，而且对于“物种”一词提出过多种不同的定义，但是，没有哪一种定义能够适应于一切场合。一般说来，所谓“物种”指的是：基本特征特性相似并能在被此问相互交配产生可育后代的个体群。迄今为止，生物学界尚未能得出物种的严格而且普遍适用的定义。而定义“物种”之所以如此困难的原因在于：物种不是个固定的静止的单位，而是进化过程的一个动态实体【5J。传统的物种形成学说认为生殖隔离是形成新物种的必备条件，然而越来越多的证据表明近缘种间可能会存在广泛的共享DNA多态性，造成这种现象的原因主要有两种：(1)近缘种对祖先单倍型的保留，即物种形成事件时谱系分选(1ineagesorting)的不完全；(2)物种分化之后由于第二次接触，物种间产生了频繁的基因交换，即种间渐渗№J。而谱系分选是群体遗传学中溯祖理论中的一个概念。14 当归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则溯祖理论的基本概念在于第一代个体间，有可能因子代数目减少，基因库中某单倍型随机漂失【『7|，随着世代数的增加，居群内单倍型随机漂失的现象逐渐积累，最后只有一种单倍型保留下来，而呈现所有个体均来自同一祖先的结果。根据溯祖理论，最初居群所存在的单倍型多态性，在随机发生的遗传漂变下，原始的单倍型多态性逐渐消失，居群内仅存单一单倍型而形成单系群，此单系群的基因会因突变的积累而有遗传变异，产生现存居群的基因多态性。因遗传漂变为随机事件，居群间在无基因交流的情况下，隔离的时间愈久，单倍型差异愈大而分歧愈远，此即为谱系分选(1ineagesorting)，在整个谱系分选历程中，受到多重因子如有效居群大小改变、物种世代长度、物种迁移历史等的影响，直接影响居群间单倍型的分布。显示在亲缘关系树上的形式是：居群间单倍型在开始时为多系群(polyphyly)，随时间历程的推进，由多系群逐渐转变为并系群(paraphyly)，以至最终两居群各自形成单系群(reciprocalmonophyly)的完全谱系分选的结果【引。不管是物种乔定还是反映物种动态历史的谱系分选过程，都需要有合适的分子标记以显示群体遗传进化过程中的基因流。基因流即一些个体从一个群体迁移到另一个群体就会把某基因带到新的群体，从而产生基因流动【9J。基因流是影响群体内部和群体之间遗传变异程度的重要因素【l引。有研究显示，无论物种过去的动态历史是怎样的，基因流较快的分子标记总是更易于界定物种，而基因流较慢的分子标记可能更适于研究物种的动态历史，如不完全的谱系筛选或渐渗【11|。由于中药分子鉴定的目的也是是依据药材DNA的差异以期完成对药材物种及更低分类级别的鉴定，因此利用分子系统学方法和理论对于实现现代中药鉴定有其巨大的优势和意义：@DNA分子是遗传信息的直接载体，含有丰富的遗传信息资源，在同种或同一品种生物类别中具有高度的遗传稳定性，而且还不易受生物体生长的外界环境条件、发育阶段，以及药材经加工炮制后外观和性状改变等因素的影响，具有更高的准确性和可靠性。②由于不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。⑧分子系统学研究表明，DNA分子上有编码与物种存活密切相关的基因编码区和编码与物种存活不十分密切的非编码区。基因组DNA的不同区域在生物进化过程中所受到的选择压力不同，编码区受到的压力大，表现出高度的保守性；非编码区所受压力小，变异性较大。DNA分子不同区域承受的选择压力不同，使得15 中国中医科学N--OO九级硕士研究生学位论文其不同区域有不同程度的遗传多样性，选择适当的DNA分子标记在属、种、亚种、居群或个体水平上进行准确地鉴定，即中药材DNA分子遗传标记鉴定的基石出[12。131。④理清物种的系统进化背景，判断其经过长期而复杂的进化历史后，是否形成物种界限明晰的单系群是药材分子鉴定的前提。显而易见，存在共有基因型的物种间无法利用分子遗传差异进行鉴别，而只有经过完全谱系分选的物种才能利用DNA差异和其他物种鉴别开。因此利用分子系统学中DNA分子特征作为遗传标记进行中药近缘种、易混淆品种以及经加工炮制过的样品的鉴别，为中药材正本清源和品质评价开辟了新途径，提供了新的思路与方法。目前常用的分子系统学遗传标记如限制性片段长度多态一|生(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复区间0SSR)等，是对中药传统鉴别方法的补充和改进，但在通用性、准确性和便捷性上仍有待提高[14-17]。而近几年新兴的以DNA测序为基础的DNA条形码(DNABarcoding)技术使中药分子鉴定取得了新的突破，得到了越来越广泛的关注。1．2DNA条形码技术的研究进展1．2．1植物DNA条形码产生的背景经典生物分类学是以大量的分类学、形态学和遗传学资料为基础对物种进行分类和鉴定的方法学，它需要依靠分类工作者经过长期生物方面的学习和研究而积累出来的丰富的形态鉴定经验，不仅复杂繁琐、费时费力且鉴别性状不稳定，易受外界因素影响。地球上有数亿种生物，也亟需一种更加高效准确的生物物种鉴定体系，才能满足人类社会不断发展进步的要求。DNA条形码是近年来国际上利用分子生物学技术和分子系统学理论研究物种分类的最新技术，于2003年由加拿大动物学家Hebert首次提出，DNA条形码旨在找到一个短而标准的DNA片段，以它为工具对物种进行快速、准确的识别和鉴定，并广泛用于系统学研究和隐秘物种的发现uJ。用DNA条形码对生物进行物种鉴定具有很多优点．概括起来有：①不受个体形态特征限制。采用一小块或一小片材料识别1个物种，即使样本受损也不会影响识别结果。②不受个体16 当归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则发育阶段影响。有些物种在不同发育时期有明显差异，不容易识别，但其DNA条形码不会发生变化。③对于分类学中难以区分的类群，采用DNA条形码可以抛开形态相似的假象，从基因水平上提供一种分类依据。④核苷酸序列组成的数据库可以被视为数字化的数据库，提供明确的信息，不仅弥补了形态描述的不足，而且可以加快已知物种的识别速度，同时便于新物种的发现，将会使分类学科的发展更加快速和深入。⑤鉴定过程无限制，1个标准DNA条形码数据库的建立．可使各种物种的辨认成为可能，如濒危物种或常见种、土著物种或入侵种等，也使更多的无分类学专业知识的人能够准确地辨认出某个物种【l81。在动物界，CDI(线粒体细胞色素C氧化酶亚基I)序列已绎广泛用于动物物种的鉴定和识别，取得了较好的效果【2,19-20】。而高等植物的线粒体COI序列进化速率较慢、分辨率低，而无法达到准确鉴定的目的【21|。因此，寻找能用于植物DNA条形码的合适片段成为植物DNA条形码研究的首要重点。1．2．2植物DNA条形码的研究进展1．2．2．1植物DNA条形码候选片段的筛选心ess【21】提出评价基因片段是否合适作为植物DNA条形码的三个标准：一、在种间有明显的遗传变异和分化，同时种内变异足够小；二、序列长度尽可能短，以便于DNA提取和扩增；三、存在保守区域，便于设计通用引物。近些年来，国内外许多学者都对植物中适合作为DNA条形码的基因序列进行了积极的探索和研究。线粒体C01基因在植物中的进化速率远远慢于动物而不适合作为大多数植物的DNA条形码；核基因组通常具有多拷贝的特性，种内变异较大，引物通用性较差，并且扩增时对模板DNA的质量要求较高，不适宜于存在DNA降解的材料；叶绿体基因组相对保守，但包含许多变异区域，而且还具有一些自身的优势，如单亲遗传避免了基因重组、植物个体中均有大量的叶绿体，即使模板DNA高度降解也容易扩增成功。所以，从叶绿体基因组中选择植物DNA条形码是可行的口21。但目前的研究结果表明，用单一片段解决全球植物的分类鉴定问题不太可能，Kress[211提出的多片段组合方法得到了广泛认可。长期以来，关于采用何种17 中国中医科学院二OO九级硕士研究生学位论文片段组合方式作为植物DNA条形码的最佳选择引起了学术界的深入讨论。生命条形码联盟(consortiumforthebarcodeoflife，CBOL)作为全球DNA条形码研究的权威机构，在综合以往研究和工作组所提供数据的分析结果，建议将叶绿体基因rbcL、matK、trnH-psbA和核基因ITS作为陆地植物通用的DNA条形码，提出逐级鉴别的思路，分别适于科级、属级、种级类群的鉴别，并对其通用性、分辨率和适用程度进行世界范围内的探讨口3。25】。现就叶绿体基因rbcL、matK、trnH-psbA和核基因ITS这四个片段作为DNA条形码的优缺点分析如下：@rbcL该片段在GenBank中有大量的序列数据，并且其具有通用、易扩增、易比对的特点而被提议作为条形码片段；但是rbcL的变异主要存在于种以上水平，物种水平上通常变异不够大。此外，rbcL的整体长度较长(至少1300bp)，给整个基因的测序带来了困难。@matK与其他编码区片段相比，matK片段的进化速率较快，但该片段的引物通用性较差，鉴定不同类群时往往需要设计不同的引物，其引物通用性和扩增成功率有待进一步实验检验，适用于种属水平的物种鉴别。@trnH-psbA该片段作为植物DNA条形码最大的优势是进化速率快，但同时也由于插入／缺失过多所引起了较高的突变率和简单的序列重复和重排，在进行序列分析时需要辅以人工校正而给非同属物种间的比对带来较大困难。不过，比对容易与否并不是条形码必需的条件，一旦建立恰当的条形码数据分析方法，插入／缺失还将会增加物种识别所需要的信息。④ITSITS片段在物种水平上变异较大，且已广泛应用于物种分类及系统进化研究，然而扩增成功率是ITS作为条形码应用的一个限制因素主要表现为：(1)其长度变异大，多数物种扩增片段长度超过1100bp，需要使用中间引物才能扩增获得整个基因：(2)存在长的poly．G、poly．C和poly．A，导致测序和序列分析困难(Sasseta1．，2007)；(3)核基因本身存在多拷贝的特性，在种内序列变异较大，进一步降低了该片段作为条形码的应用性[26】。综上所述，由于单基因片段的特点和局限性，通过多片段组合的方法对物种按照科、属、种进行不同分类等级的分步鉴定是实现陆地植物DNA条形码研究可行而有效的途径。18 当归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则1．2．2．2利用不同植物类群验证DNA条形码技术的可行性自陆地通用DNA条形码提出之后，DNA条形码研究的热点逐渐从候选片段的筛选转移到对所选通用片段的验证上来，来自全世界的条形码研究者选用不同的植物类群对候选片段的通用性、可行性及鉴别能力进行多方面的考察，以验证通用DNA条形码的实际解决问题能力[27‘29】。国内有学者在药用生物中筛选DNA条形码中，对753属4800种藻类、真菌和高等植物的6600条ITS2序列进行了分析，发现ITS2在种级水平上的分辨成功率可以达到92．7％，建议ITS2可作为真菌和绿色植物的一种标准DNA条形码‘301。任保青‘311等利用4个DNA片段(ITS、rbcL、matK和trnH-psbA)对桦木科桤木属(Alnus)全世界所有的物种(26种)的131个个体进行取样分析，发现4个片段在种级水平上的分辨能力分别为lO％(rbcL)、31．25％(matK)、63．6％(trnH-psbA)jfl76．9％(ITS)，而将ITS和trnH-psbA结合在一起使用可以分辨全部种类中的88．5％。同时以桤木属为例，讨论了分类学修订对于正确运用DNA条形码技术进行物种鉴定的必要性，以及两者之间所存在的互动关系。DNA条形码研究的最终目的是实现对物种的快速自动鉴定，在经过了候选片段的筛选和原植物类群对候选片段的验证两个研究阶段之后，条形码技术最终的落脚点还是在该技术对解决实际问题的应用上。在中药鉴定领域，DNA条形码以其独特的优势将为中药真伪鉴别和质量检控提供有力的工具。1．2．3植物DNA条形码技术在中药鉴定中的应用现状1．2．3．1DNA条形码技术的优势和在中药鉴定中的应用进展目前基于传统的植物分类学系统的药用植物有许多物种存在着严重的同物异名和误定现象，特别是在一些复合种中。另外由于药用植物应用历史较久、本草记载的植物来源不一、植物分布和药材产地较广、地方习惯用药不同等因素，使得药用植物品种存在着混杂现象，这种混乱现象已经严重影响到药材的使用安全。国内市场所用的中药材有一些来源于同属近缘植物，有些还具有毒性，因此，急需从原植物上甄明药材来源，去伪存真。即使是一些物种明确的药用植物种类19 中国中医科学院二OO九级硕士研究生学位论文也由于引种栽培历史较短，因此保留着许多野生性状，导致栽培的中药材种质混杂，表现为种内变异的多样性，如栽培的人参有大马牙、二马牙、圆芦和长脖等类型。形态特征的不同，产量和质量也有显著差异。种质混乱必然造成中药材质量良莠不齐。澄清混乱品种，明确正品及其混淆品种，这是发展现代化中药亟待解决的问题。利用DNA条形码技术可以迅速、准确鉴定物种，当有样品待检时，无论是新鲜样品、中药材还是饮片，只需经过DNA提取、PCR扩增、电泳检测、基因测序，数据库比对，就可确定是什么物种，可以方便的将混品、伪品和正品进行区分。通过大规模的DNA条形码技术在中药中的应用，建立起中药特异DNA序列数据库后，将能很方便的对中药的DNA序列进行对比鉴定。由于对材料形态无特殊要求，可以利用统一的技术手段对中药生产、流通和销售全过程进行监管，提高中药质量、保证用药安全[321。近来，针对DNA条形码技术在中药鉴定中应用已有探讨，在中药鉴定方面，针对传统分子遗传标记技术遇到的瓶颈问题，已有学者利用DNA条形码的技术优势，将其成功用于鹿茸、赤芍和威灵仙等中药材及其混伪品的鉴别【33-35]，郭晓蓉等利用DNA条形码三个片段(trnH-psbA、rbcL徊marK)对唇形科药用植物黄芩及其三种混淆品进行了鉴别，提出用r6以+trnH-psbA片段的组合作为鉴别黄芩及其混淆品原植物的条形码片段，由于只有trnH-psbA片段才能在黄芩以根入药的药材中成功扩增，所以推荐trnH-psbA为黄芩药材鉴别的DNA条形码[361。龙春林等也利用DNA条形码的这三个片段对6种清风藤属植物和7种市场混淆品进行鉴定，结果表明DNA条形码可以有效鉴定出民族药用植物小花清风藤及其混伪品，对于保护民族传统医药文化有着重要意义【371。1．2．3．2基于DNA条形码分子系统学进行中药鉴定研究的重要意义中药鉴定的宗旨是为了解决中药材“真伪优劣”的问题，即中药的品种和质量问题。包括两方面的内容：～方面明确正品、伪品，解决品种混乱、替代、仿制等问题，另一方面对多来源中药和道地药材进行比较全面的品质评价研究。肖小河指出“当前DNA分子遗传标记技术在道地药材鉴定相关研究中显示了2个方面的局限性：一是来自技术本身的，如目标基因的真实性与DNA同源性，DNA20 当归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则分子标记结果的重现性和稳定性；二是来自研究对象的，不是所有的道地药材形成都会留下DNA差异‘烙印’【38]”。近年来，被用于中药材鉴别的DNA条形码技术很好的解决了上述的第一种局限性，DNA条形码通过测定基因组上一段标准的、具有足够变异的DNA序列来实现物种鉴定，确保了DNA分子标记结果的真实性、重现性和稳定性。而第二种局限是目前制约药材鉴定的一个严重瓶颈，所鉴定药材是否有DNA差异‘烙印’取决于基原物种间是否存在不完全谱系分选、杂交、基因渗透等而使种间存在多系群和并系群的进化历史，分子系统学是阐明物种进化历史的有力工具，通过对所鉴定药材基原植物及其所在的属的分子系统学研究，建立该属80％以上物种的分子系统树，明确整个属的进化历史和种间遗传分化程度，阐明所鉴定药用植物是否具有单系性，在此基础上才能客观判断相应药材是否有DNA差异‘烙印’，由此才能对相应药材进行DNA分子鉴别的有效性作出科学评价。然而目前这方面的研究是缺乏的。因此，基于DNA条形码分子系统学的药用植物和药材鉴别研究为突破目前药用植物和药材分子鉴别的瓶颈提供了新的思路和方法。1．3当归属植物研究背景伞形科(Umbelliferae)当归属(Angelica．L)是一个温热带属，主要分布于北温带(中国、朝鲜、韩国、日本)和新西兰，全球大约有90种植物【391。当归属植物资源丰富，药用价值巨大，大多具有祛风除湿、补血活血的功效，在我国传统医学界地位十分重要。其常用大宗药材当归、独活和白芷在临床治疗方面更是广为应用，为历代医家常用处方配伍制剂，并一直沿用至今。除此之外，另有多种当归属药用植物在不同的地区曾经发挥着不同的作用，有些被作为正品当归、白芷、独活的代替品，如狭叶当归、雾灵当归、大活等常在东北和华北地区常做独活入药；峨眉当归、金山当归、东当归、青海当归、朝鲜当归等作为当归的代用品使用已久；还有白芷的替代品如拐芹等。当归属植物的主要化学成分为香豆素类化合物，如香柑内酯、花椒毒素、欧前胡内酯、氧化前胡素、白当归素、伞形花内酯、异欧前胡内酯、紫花前胡甙等，此外大多数当归属植物还含有挥发油、21 中国中医科学院二OO九级硕士研究生学位论文萜类化合物和甾醇类化合物。其药理活性主要表现为对心血管系统、平滑肌、抗炎抗菌和镇痛等方面的作用【4们。1．3．1当归属植物的系统分类学背景当归属(Angelica．L)为伞形科(Umbelliferae)、伞形目(Umbemferae)、芹亚科(ApioideaeDrude)、前胡族(PeucedaneaeDrude)、当归亚族(AngelicinaeDrude)的一个重要类群，由瑞典植物学家林奈于1753年在{SpeciesPlantarum}中提出。据{FloraofChina))记载，分布在中国的当归属植物有45种，其中32种为中国特有种，分布于南北各地，其中以四川和东北地区为两个地理分布频度中心[4l】o在学术界，长期以来一直存在着当归属的广、狭义之分，不同的国家和学者持有不同的观点。北美和欧洲学者大多倾向于将当归属(Angelica．L)及其另外5个近缘属即山芹属(OstericumMaxim．)、高山芹属(CoelopeurumTurez．)、柳叶芹属(CzernaeviaTurez．)、古当归属(Archangel[caHoffm．)、山芎属(ConioselinumFisch．exHoffm．1共同作为一个属即广义当归属处理，我国学者如袁昌齐[421、王年鹤【431、潘泽慧【441、秦慧贞H51等则从解剖学、化学、细胞学和孢粉学等角度认为应将彼此分离，作为6个独立的属存在。本研究参照{FloraofChina})编排，采用狭义当归属的观点。而就是狭义当归属也不是一个单起源的类群【46鹕1，它与藁本属、独活属、前胡属亲缘关系很近。如我国特有种阿坝当归又名法落海(Aapaensis)，在《中国高等植物图鉴》中被归属到当归属，并定名为AngelicaapaensisShall&YuanJ【54]，在《中国植物志》上则被归属到独活属，并改名为Heracleumapaense(Shan&YuamShan&T．S．Wang[561，而在最新出版的{FloraofChina))中阿坝当归重又被划分到当归属，并被更名为AngelicaapaensisR．H．Shan&C．Q．Yuan，但同时又特别指出“进一步的研究有可能会将之归属到新的属”[39】。之所以阿坝当归的分类地位一直不能确定，主要是因为阿坝当归的形态与化学特征有些与当归属的相似，有些与独活属的相似，有些特征又介于当归属与独活属之i司[44-45,61-62]，在ITS证据中，ITSl部分拥有当归属的序列特征，ITS2部分拥有独活属的序列特征22 当归属药用植物及药材的DNA条形码鉴别研究——兼论DNA条形码在中药材鉴定中的原则№引。此外，在(FloraofChina))记载的45种植物中，有14种为依据标本很少及存疑的种类，分别为：东川I当归(么．ducloux)、四JII当归(Asetchuenensis)、曲柄当归(么．fargesii)、毛珠当归(Agenuflexa)、城口当归(么．dielsii)、长柄当归(Alongipedicellata)、松潘当归(4．songpanensis)、长序当归(4．10ngipes)、林当归(彳．sylvestris)、带岭当归(Adailingensis)、隆萼当归(4．oncosepala)、羽苞当归(Apinnatiloba)、巴郎山当归(么．balangshanensis)、湖北当归(彳．cincta)。这些种有的依据标本很少无从考证，有的鉴别特征不明确或为过渡种类【39l。因而在<
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