micrornas调控satb2介导的骨髓基质干细胞成骨分化的作用研究

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1、万方数据论文独创性声明本论文毛我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写一过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：姐一论文使用授权声明本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件1．一歹亡许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容；一可以采肾影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：趔导师签名：—纵期：幽万方数据指导小组成员名单马端教授于晓萍

2、副教授虞国君副教授万方数据目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8正文第一部分Satb2对骨髓基质干细胞成骨分化的促进作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l第二部分miRNA在Satb2介导的骨髓基质干细胞成骨分化中的调控作用⋯⋯43第三部分Satb2、Sp7和miR一27a在骨髓基质干细胞成骨分化中的反馈调节作用．．．．．．．．．．．．

3、．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．⋯．．57结论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．58参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯84英文缩略词对照⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯86研究生期间发表的论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯87致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯88万方数据中文摘要骨髓基质干细胞(BMSCs)作为成骨细胞的前体细胞，对于骨的形成和重建具有重要的意义

4、，通过基因治疗的方法增))IBMSCs的成骨潜能成为一个新的研究领域。Satb2是一种特殊富含AT序列结合蛋白家族的核基质蛋白，在BMSCs的分化和颌面部骨的修复重建过程中起重要的作用。作为一个在成骨分化和骨骼塑型中起重要作用的基因，Satb2对BMSCs定向、分化和增殖等行为的调控机制有待研究。本研究拟使用慢病毒转染建立稳定表达Satb2的BMSCs细胞株，通过体内体外实验观察Satb2对成骨分化的促进作用，通过miRNA表达谱分析观察miRNAs在Satb2介导的BMSCs成骨分化过程中的作用，对Satb2促进成骨分化的分子生物学机制进行进一步的研究，为

5、基因治疗和干细胞技术在骨再生领域的广泛应用提供更直接的科学线索。材料和方法：第一部分使用PCR克隆小鼠Satb2基因，构建pTA2一Satb2质粒。将质粒pTA2-Satb2与慢病毒载体重组形成慢病毒载体LV-Satb2，建立稳定表达Satb2的BMSCs细胞株。分别于成骨诱导7d和14d进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色。使用蛋白印迹和实时定量PCR检测成骨因子Runx2、Sp7、Atf4和Bsp的表达。将口．磷酸三钙支架和BMSCs在成骨诱导培养基中联合培养14d后，将共培养物植入小鼠股二头肌内侧。4)N后将植入物取出进行组织学观察和实时定量PCR检测成骨因

6、子表达。第二部分使用Affymetrix⑩GeneChipmiRNA芯片检NISatb2过表达的BMSCs在成骨诱导7d时的miRNA表达情况，将差异变化≥1．5倍作为显著差异，并通过实时定量PCR进行验证。利用生物信息学工具从Sanger数据库中筛选出差异表达的miRNA并对靶基因进行预测，使用G0和I@GG通路分析的方法探讨基因和miRNA的相互作用。选择差异表达的miR．27a进行功能性分析。首先通过慢病毒载体建立miR．27a过表达的BMSCs，为了验证miR．27a对成骨分化的作用，对转染后的BMSCs进行成骨诱导分化，分别于第7d和第14d进行碱

7、性磷酸酶染色和茜素红染色检测miR．27a对成骨分化的影响。使用蛋白印迹检测miR．27a的靶基因(BMP2、BMPRla和Smad9)的表达。万方数据第三部分为了进一步探讨Satb介导的成骨分化过程中miRNA和靶基因的调控作用，使用蛋白印迹和实时定量PCR检；澳lJSatb2过表达的BMSCs在成骨分化过程中Sp7$1miR。27a的表达情况。使用蛋白印迹和实时定量PCR检测miR．27a过表达的BMSCs@Sp7的表达。使用实时定量PCR检钡lJSatb2过表达的BMSCs成骨分化中相关成骨因子的表达情况。使用PCR扩增含miR-27a靶位点的Sp7编

8、码区，构建靶基因psiCHECK-2一Sp7并测序鉴