猪流行性腹泻病毒荧光定量pcr方法和间接elisa方法的建立与初步应用

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目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯m1弓I言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1PEDV的形态学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．1PEDV的生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．2PEDV的分子生物学研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．1基因组结构特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2．2结构蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2．3非结构蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．2．4N蛋白的特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3PEDV的基因分型和流行特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．4猪流行性腹泻病毒的流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．5猪流行性腹泻病毒的临床症状和病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．5．1临床症状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．5．2病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．6猪流行性腹泻病毒致病机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．81．7猪流行性腹泻病毒的增殖培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91．8猪流行性腹泻病毒的诊断方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91．8．1根据临床症状和病理剖检变化初步诊断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．8．2人工感染试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．8．3免疫电镜法(IEM)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91．8．4原位杂交技术(ISI-I)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。91．8．5免疫荧光法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．8．6血清中和试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．8．7胶体金抗体检测技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．8．8RT-PCR法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．8．9反转录环介导等温PCR法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10 1．8．10荧光定量PCR法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。111．8．10ELISA法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1l1．9PEDV的疫苗预防和治疗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1l1．9．1疫苗预防⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l1．9．2治疗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131．10本研究的目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。142．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．1．1毒株和病料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．142．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．1．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。142．1．4试验中配制的试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．1PEDV荧光定量PCR方法的建立的材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．182．2．2PEDV的N蛋白基因原核表达的材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．2．3PEDVN蛋白间接ELISA方法建立和初步应用的材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯．293结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。323．1PEDV荧光定量PCR方法的建立的结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．1．1荧光引物的PCR检测。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．1．2标准品的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．1．3PCR反应条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．1．4标准曲线的绘制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．333．1．5灵敏性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．1．6特异性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．1．7重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．353．1．8临床病料的检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．353．2PEDV的N蛋白基因原核表达的结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．2．1PEDVN基因PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363．2．2重组质粒pET30a．PEDVN的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36 3．2．3重组质粒的初步表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．2．4诱导表达条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．2．5蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．393．2．5Western．blot验证表达蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．3PEDVN蛋白间接ELISA方法建立和初步应用的结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．403．3．1间接ELISA方法的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯403．3．2临床血清的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．444讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯．474．1荧光定量PCR方法的建立和应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。474．2PEDVN蛋白的原核表达和条件优化的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474．3PEDVN蛋白间接ELISA的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．485结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。50参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51鸳I[谢⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．58硕士期间发表文章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．58 山东农业大学硕士毕业论文中文摘要猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，各种年龄阶段的猪可能感染，但仔猪最易感。该病最初发现时发病率高，死亡率较低，但是近年来PEDV引起山东的仔猪腹泻爆发，病死率达100％。为了有效防治该病，本研究建立了检测PEDV的荧光定量PCR诊断方法和检测PEDV抗体的间接ELISA检测方法。本研究共分为三个部分：1PEDV荧光定量PCR的建立根据PEDV的M基因序列，本研究合成了针对该序列的Taqman探针和引物，建立了检测PEDV的绝对荧光定量PCR方法，绘制了标准曲线方程为Y兰．2．146X+22．769，各个参数为Slope=．2．146，扩增效率：E=10-l侑率．1=10．1／-2．146．1=192．433％，相关系数：R2=O．994。试验证明该方法特异性强、重复性好、灵敏度高、最低可检测到10copies／uL。应用建立的荧光定量PCR对来自山东省的40份临床呈腹泻症状的病料进行了检测，检测出30份PEDV阳性，检出率为75％，说明PEDV引起山东省大部分猪场的仔猪腹泻的原因之一。2PEDVN基因的原核表达本试验设计引物，以PEDV山东流行株DZl2．3为模板，扩增了全长的N基因，并连接到pET-30a载体上，构建了重组表达质粒，导入表达菌E．coliBL21(DE3)，通过对表达时间，诱导剂的使用量，温度等条件的摸索，使构建的pET30a-PEDVN质粒在BL21中大量稳定的表达，并且最佳的表达条件确定为lmM／mL的IPTG，37℃，220r／rain，表达6h时表达量最大。经过Ni．Agarose柱纯化获得纯度较高的目的蛋白，Westernblot检测表明，表达的重组N蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性反应，不与其他常见猪病阳性血清发生反应，说明该蛋白具有一定的反应原性。3PEDV间接ELISA方法的建立和应用本研究使用纯化的原核表达N蛋白为包被抗原建立了检测猪体内PEDV抗体的间接ELISA方法。优化条件为N蛋白最佳包被量为750ng／孑'L，最佳包被条件为使用碳酸盐缓冲液(0．05mol／L，pH9．6)、4"C包被12h，被检猪血清最佳稀释度为1：100，抗体最佳反应时间为37℃，1h，显色液的最佳终止时间为室温15min，阳性的Cut-off值为0．465。以建立的间接ELISA方法对采自山东省的320份PEDV疫苗免疫猪血清进行抗体检测，结果表明总的抗体阳性率为62．81％，母猪抗体阳性率为72．2％，仔猪抗体阳性率T 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用为46．1％，表明疫苗免疫的抗体阳性率不高；检测德州2个未免疫PEDV疫苗的猪场120份血清，统计结果显示，总的感染抗体阳性率为36．7％，母猪的感染抗体阳性率为42．9％，育肥猪感染抗体阳性率为28．0％，表明猪场中存在PEDV野毒的普遍感染；通过对某猪场免疫PEDV疫苗后抗体跟踪监测显示，7d后抗体开始上升，28d左右达到最高，35d后出现下降，整体抗体水平不高，表明PEDV疫苗免疫保护时间较短，保护效果不佳。关键词：猪流行性腹泻病毒；荧光定量PCR；N蛋白；原核表达；间接ELISAⅡ 山东农业大学硕士毕业论文ABSTRACTPorcineepidemicdiarrhea(PED)isahighlycontagiousintestinaldiseaseofpigscausedbyporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)．ThemamcharacteristicofPEDVWasvomiting，diarrheaandlossofappetiteinavarietyofagepigs，especiallypi西ets．Butinrecentyears，theoutbreakofdiarrheawhichWascausedbyPEDVWashappenedinShandongProvince，andhigllmortalityWasappearedinthisoutbreak．Inordertoeffectivelycontrolthedisease，ThisstudyestablishedaqPCRmethodtodetectPEDVandindirectELISAmethodtodetectantibodiesofPEDV．Thestudyisdividedintothreeparts：1．TheestablishmentofaqPCRforPEDVAccordingPEDVMgenesequenceofDZl2—3，thestudysynthesizedTaqmanprobeandprimersequences，thenIestablishanabsolutequantitativePCRmethodfordetectionofPEDV．ThestandardcurveequationWasY=-2．146X+22．769．TheSlope，amplificationefficiencyandthecorrelationcoefficientwererespectively．2．146，E_10．17辩事-1=10-1／·2．146-1=192．433％and《_o．994．Thestudyshowthatthemethodhadgoodspecificityandreproducibility,hi曲sensitivity,mininluIndetectablecouldbe10copies／pL．．FortyclinicalsymptomsofdiarrheadiseasematerialsfromShandongweretestedbythefluorescentPCRforPEDV．ItWasshowedthat30materialswerepositiveandthedetectionrateWas75％．2．TheprokaryoticexpressionfortheNgeneofPEDVShandongepidemicstrainDZl2-3Wasusedasatemplateinthisstudy,andthecompletesequenceofNgeneWasamplifiedthroughdesigningspecificprimers．TherecombinantplasmidWasbuiltbyconnectingtheNgenewithpET-30a,andimportedintotheE．coliBL219(DE3)．Throughtheexplorationoftheexpressionoftime，theamountofinducer，thetemperatureandotherconditions，SOthatconstructedplasmidpET30a-PEDVNhadalargenumberofexpressionstablyinBL21，anddeterminationoftheoptimalconditionsarethelmM／mLexpressionofIPTG，37℃，220r／minandthatmaximumamountofexpressiontimeWas6h．．ThenthehighpurityproteinWasobtainedafterpassingtheNi-Agarosecolumn．TestedbyWesternblot,ffWasshowedthattherecombinantproteinhadagoodspecificreaction、杭tllthepositiveserumofPEDV,whilenothadareactionwithpositivem 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用serumofotherdiseases．Therefore，thisproteinhadagoodreactogenicity．3．TheestablishmentandapplicationforPEDVofindirectELISAmethodThisstudyestablishedtheindirectELISAmethodbasedonthepurifiedNproteinforPEDVantibodyTheoptimalamountofNproteincoatingWas750ngperhole，Optimalcoatingconditionsweretheuseofcarbonatebuffer(O．05mol／L，pH9．6)andpacketingof4℃，12h；thesubjectpigserumdilutionWas1：100；thebestantibodyoptimumreactiontimeis37℃，lh，thebestcolorliquidterminationtime15minatroomtemperature，positiveCut-offvalueof0．465．The320porcineserumsbyPEDVvaccineweretestedPEDVantibodybytheassayofindirectELISA，anditshowedthatthetotalantibodypositiverateWas62．81％，theantibodypositiverateofsowWas72．2％andthepositiverateofpigletWas46．1％．ItShowedantibodyvaccineprotectionrateisnothigh．Detected120unvaccinatedPEDVvaccineserafromtwofarmsinDezhou，statisticsshowedthatthetotalinfectionrateof36．7％theantibodypositiverateofSOWWas42．9％，thepositiverateofpigletWas28．O％．tTheresultsshowedthatporcinefarmshadgenerallyPEDVwildvirusinfection，ThroughdisplayoftrackingandmonitoringofapigfarmafterimmunizationofPEDVvaccineantibody,antibodiesbegantoriseafter7d，reachedthehighestafter28days，declineappearedafter35d，TheresultsshowedthatthePEDVvaccinehadshorterprotectionandpoorprotection．Keywords：porcineepidemicdiarrheavirus，qPCR，Ngene，prokaryoticexpression，indirectEI．ISAIV 山东农业大学硕士毕业论文1引言猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病(Pensaerteta1．，；1978Satoeta1．，2011)。猪流行性腹泻每年的11月至次年的3月的寒冷季节多发，夏d发病较少。本病可感染不同日龄、品种以及不同性别的猪，尤其是哺乳仔猪的发病最为严重，一周龄以内的仔猪感染PEDV后，开始腹泻，脱水，然后死亡，病死率高达90％以上。该病给养猪业造成严重的经济损失。1971年，猪流行性腹泻首次在英国报道，主要是引起育肥猪和仔猪的猪急性腹泻，当时被人们称为“流行性病毒腹泻”，1977年首次报道可侵害哺乳仔猪相类似的传染性胃肠炎的急性腹泻，排除传染性胃肠炎和其他已知的致腹泻的病原后，将该病命名为“2代EVD"，以便区别于70年代早期发现的1型腹泻。随后被人们分离到引起该疾病的病毒，将其命名为“CV777”(Bridgeneta1．，1993；Carvajaleta1．，1995；Pritchardeta1．，1999；Rodaketa1．，2005)。将分离的病毒进行动物接种试验，发现其对仔猪和育肥猪均有致病性，于是将引起腹泻的该种病毒命名为“猪流行性腹泻(PED)"并且沿用至今(Baeeta1．，2003；殷震等，1985)。我国从1976年开始报道有PED发生(蔡宝样，2001)。在1991年国际病毒分类委员会(ICTV)第五次报告中将PEDV列为冠状病毒属的可能成员，并在1995年第六次报告，将其列为冠状病毒属的正式成员(Murhy,1995)。1．1猪流行性腹泻病毒的病原学特点PEDV属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，与PEDV同属的病毒还有、鸡传染性支气管炎病毒(mV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(眦V)、犬冠状病毒(CCV)、火鸡蓝冠病病毒(TCDV)等。1．1PEDV的形态学猪流行性腹泻病毒(PEDV)与冠状病毒科冠状病毒属其他成员一样，具有同样的形态结构(Chaseyeta1．，1978)。位于病毒内部的结构是核衣壳蛋白(N)，N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒的核衣壳，病毒的表面主要包括纤突糖蛋白(S)、膜蛋白(M)、小膜蛋白(E)(图1-1)。在粪便病料中所分离的病毒粒子是多形态的，电镜下观察大致呈球形，其平均直径(包括纤突蛋白)约130rim，范围为95"--190nm。但是在形态上很难与猪传染性胃肠炎病毒(TGIⅣ)相区别(Hofmanneta1．，1989；Pensaert1 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用eta1．，1978；殷震等，1985)。图1-1PEDV病毒粒子形态s：纤突蛋白；M：膜蛋白；N：核衣壳蛋I刍；E：sM蛋白Fig．1-1TheschematicdiagramofthePEDVS：spikeprotein；M：membraneprotein；N：nucleocapsidprotein；E：small1．1．1PEDV的生物学特性1．1．1．1理化特性PEDV对氯仿和乙醇比较敏感，蔗糖的密度为1．18／ml(Deboucketa1．，1982)。不凝集家猪、兔、鼠、犬、马、雏鸡、绵羊、山羊、母牛和人等红细胞。适应细胞培养后的PEDV经60。C或以上处理30min就会失去感染力，但在50。C条件下会相对稳定。病毒在40C，pH为5．0--．9．0或者37℃，pH为6．5～7．5时相对稳定，经超声波处理后或者反复冻融后，病毒感染力基本不受影响。5．碘．2．脱氧尿苷不能抑制病毒复制，这表明病毒核酸是RNA。PEDV的很多特征和冠状病毒科的其它病毒相似。用免疫荧光技术、病毒中和实验都可证明PEDV在抗原上和猪的其它冠状病毒(如TGEV)没有相同的抗原，该病毒只有一种血清型，无血凝性。目前，已经在核酸水平证实，病毒是在胞浆内膜上出芽而完成装配过程(Deboucketa1．，1981；Hofmanneta1．，1989)。1．1．1．2培养特性其它冠状病毒相比，PEDV的细胞培养比较困难，从发现PEDV开始，很多研究人员都尝试用不同方法将PEDV去适应细胞，都没有取得成功，所以这在一定程度上制约PEDV研究的进程(孙东波等，2006)。在1982年，我国学者宣华等曾经用胎猪的肠组织原代单层细胞培养物成功地分离出了PEDV，并且将其适应了猴肾传代细胞，但后续的研究并没有报道。直到1988年，Hofrnann等人首次在加入胰酶的培养基情况下在Vero细胞上成功培养了PEDV，并且认为胰酶对PEDV纤突糖蛋白的切割作用2 山东农业大学硕士毕业论文增强了PEDV病毒对Vcro细胞的感染力，此方法在后续的PEDV分离、细胞的培养和疫苗的研究中被研究人员广泛应用(Hofmanneta1．，1989；Kweoneta1．，1999；马思奇等，1995)。此后，各国的研究者对PEDV细胞培养进行了深入地研究，相继在仔猪、膀胱的原代细胞和KSEK6、MAl04、ESK、CPK的传代细胞系上成功地培养了PEDV(Kusanagieta1．，1992)。细胞上对PEDV的成功培养，解决了对PEDV研究的瓶颈问题，为PEDV理化特性、相关分子生物学及疫苗的研究奠定了物质基础，对今后研究具有重要意义，使PEDV的研究进入了一个新的阶段。1．2PEDV的分子生物学研究1．2．1基因组结构特点PEDV的基因组是单股正链的RNA，具有感染性，基因组全长28033nt(PEDVCV777株)，其基因组具有侵染性，可导入真核细胞，能引起感染。基因组5’端有一非翻译区(5’UTR)位于基因的上游，长296nt；5'UTR内含长为65nt"-98nt的前导序列(L)以及一个AUG起始密码子、同时拥有Kozak序列(GI彤CAUGC)和编码12个氨基酸的开放阅读框架(ORF)。目前，除人的冠状病毒229E(HCov-229E)以外，已知其它冠状病毒成员都具有Kozak序列，但序列之间有所差异(ToblerelaL。1993)。基因组3’端为非翻译区(3’UTR)，长度为334nt，末端连接Poly(A)序列，3'UTR内含由8个碱基(GGAAGAGC)组成的保守序列，起始于poly(A)上游73tat处，所有的冠状病毒成员都具有这个序列，只是在基因组中位置有所不同(Duarteetal．，1993)。剩余PEDV基因组序列包括6个开放阅读框，从5’～3’端依次是编码复制酶多聚蛋白基因、纤突蛋白(S)基因、ORF3蛋白基因、小膜蛋白(E)基因、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)的基因(图1．2)。编码复制酶多聚蛋白的基因(基因1)占全基因组2／3，长20346nt，它包括ORFla(12354nt)和ORFlb(8037nt)两个开放阅读框，二者之间具有46nt的重叠序列，重叠序列内具有滑动序列(删丸锚。C)以及假结结构，它们能促使核糖体进行移码阅读(framesmiting)以便保证基因1正确地翻译。编码病毒结构蛋白的基因为S基因、M基因、E基因和N基因分别，长度分别是4152nt、681nt、231nt和1326nt。ORF3基因的长度为675nt，它编码病毒非结构蛋白。每两个相邻的基因之间含有间隔序列(intervalsequence，IS)，间隔序列在病毒的基因组复制以及翻译的过程中发挥着非常重要的作用(Bridgeneta1．，1998；Kocherhanseta1．，2001；Utigereta1．，1995；刘邓，2009)。 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用T1ula图1-2PEDV基因结构图(Brian，92005)Fig．1-2GenomestructureofPEDV1．2．2结构蛋白1．2．2．1S蛋白S蛋白是PEDV中最大的结构蛋白，它是位于病毒粒子的表面的纤突糖蛋白，由S基因编码产生，它的作用是在病毒粒子与细胞的表面受体相结合后通过与胞膜融合侵入宿主的细胞并在感染宿主的体内介导中以及抗体的产生的过程中发挥重要的生物学作用。S蛋白由1383个氨基酸组成，分子量为180"--'220kDa，共有四部分组成，从N端到C端依次分为：大的胞外结构域、转膜结构域以及短的羧基末端的细胞质结构域。其中大的胞外结构域含有能与宿主细胞表面的大分子结合的受体结合域，以及能促使机体产生中和抗体的抗原表位；末端由疏水性氨基酸为主要组成的胞内尾区，对整个S蛋白起固定的作用(Duarteeta1．，1994)。S蛋白的溶解度为pH4．0的低渗非离子溶液时最大。预测S蛋白潜在的糖基化位点约为27～29个(Bridgeneta1．，1993)，这些糖基化位点大多数具有生物学意义(蔡宝样，2001)。在病毒粒子成熟后PEDV的S蛋白不能被细胞蛋白酶所切割，而牛冠状病毒(BCoV)和鼠肝炎病毒(MHv)的S蛋白是能被切割成S1和S2两个亚基的，这样增强了病毒的细胞感染力和融合力。PEDV的S蛋白不能被切割，感染能力和融合能力低于其他冠状病毒，从而在体外分离时比较困难，通过PEDV的S蛋白和其他冠状病毒的同源性比较，可以将S蛋白分为S1区(1"-'735aa)和S2区(736"-,1383aa)两个区(Junweieta1．，2006)。通过对PEDV与其他冠状病毒的S蛋白序列比对，发现S2区在基因序列上的保守性略高于于S1区。研究表明Sl区的功能为负责识别并结合特异性受体的，由于不同的冠状病毒侵染宿主细胞的类型是不同的，因此S1区具有一定多样性；而S2区的功能为负责细胞膜和病毒膜的融合，功能的单一性是不同的冠状病毒的S2区比较保守的原因。研究表明PEDV和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的S蛋白同源性较低，二者没有血清学交叉反应，但根据TGEV的S4 山东农业大学硕士毕业论文蛋白的中和表位推导出来的PEDVS蛋白的中和表位，并且由此制备的抗血清有效地抑制了PEDV在Vero细胞上蚀斑的形成，在线性位置上，这可以说明两种病毒的中和表位在S蛋白上的存在有可能相似之处(Kangeta1．，2007；Kangeta1．，2005)。通过原核表达系统，对S1蛋白区进行表达，并且对其表达的蛋白进行免疫原性的相关研究，结果显示PEDVS蛋白的S1蛋白的D区(第696"789位氨基酸)重组蛋白得到的多克隆血清能中和在VeroE6细胞上培养出的PEDV(Suneta1．，2008)。目前，PEDVS蛋白的中和表位区已经被构建了一系列的表达载体，表达载体进行了表达，同时对PEDV转基因疫苗进行了尝试地研究，并且取得一定的研究进展，为开发PEDV新型的疫苗提供了理论和物质基础(Baeeta1．，2003；Kangeta1．，2005；Kangeta1．，2005；Oszvaldeta1．，2007)。1．2．2．2E蛋白E蛋白又被称为sM蛋白．它由76个氨基酸所组成，分子量约为8．8KD，位于病毒囊膜上的小包膜蛋白，对病毒的出芽和组装是必不可少的。目前，研究者把PEDV的M和E基因导入了甲病毒载体(pSFV)中，成功在BHK21细胞中表达，使进一步探索M蛋白和E蛋白在抗病毒中的作用具备了一定的试验基础(余丽芸等，2005)。1．2．2．3M蛋白M蛋白是分子量为27KD---32KD的膜糖蛋白，它由226个氨基酸组成，主要协同病毒粒子的组装和出芽过程。M蛋白在感染细胞时位于细胞高尔基体中，不能转运到细胞膜，由中间的a螺旋区、暴露在病毒囊膜外的糖基化N末端区以及病毒囊膜内大的C末端区3个结构域组成。在补体存在的时候，抗M蛋白囊膜外抗原表位的单克隆抗体能中和病毒的感染性。另外，M蛋白能介导0【．干扰素(a．IFN)在机体内产生，所以M蛋白能够作为PEDV基因工程疫苗的候选抗原(Gaoeta1．，2013；Utigereta1．，1995)。有研究显示在体外原核表达试验时，M蛋白对大肠杆菌的生长起到抑制作用，有的研究者推测这可能与M蛋白的在病毒粒子中具有出芽功能有关，可能该蛋白破坏了大肠杆菌的细胞膜的结构，从而抑制大肠杆菌的繁殖；或者是对大肠杆菌的基因转录进行了直接干扰，致使其发生凋亡(高慎阳等，2007)。1．2．2．4N蛋白N蛋白是磷蛋白，由441个氨基酸所组成，分子量为55kDa---58kDa，在细胞质中能与病毒的基因组RNA相结合并缠绕在一起形成螺旋状的核衣壳(Kubotaeta1．，1999)。PEDV完整N蛋白的等电点是10．5，但C端的等电点很低，因为其C端的50个氨基酸5 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用残基通常是呈中性的或带负电，为3．4。N蛋白含有6～7个潜在的磷酸化位点。pH9．0低渗非离子溶剂中，N蛋白溶解度最大。3个相对保守结构域及其中间的是RNA结合域共同组成N蛋白，其中此RNA结合域能与病毒RNA的前导序列相结合(Leeeta1．，2003；孙东波等，2006)。1．2．3非结构蛋白1．2．3．1复制酶多聚蛋白复制酶多聚蛋白是一种多功能的非结构蛋白，预测有13个蛋白酶切位点(Kocherhanseta1．，2001)。ORFla编码的蛋白由3个转膜域(TM)构成，主要作用为编码蛋白水解酶；ORFlb由螺旋酶域(Hel)、保守序列域(C)以及锌指蛋白域(Z，金属结合域)三个蛋白结构域组成，ORFlb可以编码RNA聚合酶(RdRp)(Brianeta1．，2005)。N蛋白在病毒感染的早期发挥重要作用(Kocherhanseta1．，2001)。1．2．3．2ORF3蛋白ORF3蛋白的分子量为25．3KD，是一种非结构蛋白。研究表明，ORF3与病毒毒力密切相关(Duarteeta1．，1994)。PEDV的DRl3强、弱毒株的ORF3序列进行了比对分析，发现致弱的DRl3在ORF3中，存在17个氨基酸的缺失，暂时为强、弱毒的鉴别诊断方法的建立提供了一定的依据(Parketa1．，2007)。最新的研究证明，ORF3可以构建病毒的离子通道，这位该病毒在细胞上的增殖奠定了重要的基础(Wangeta1．，2012)。1．2．4N蛋白的特点N蛋白是PEDV中所占比例最大的结构蛋白，在感染的细胞中大量表达，在PEDV早期感染的猪体内就能检测出抗N蛋白的高水平抗体，同时冠状病毒N蛋白保守性很强(Leeeta1．，2003；孙东波等，2006)，因此可以利用N蛋白建立PEDV分子生物学诊断技术，所以N蛋白具有比较好的应用前景(Houeta1．，2007；Leeeta1．，2003；Tobleretal．，1995)。1．3PEDV的基因分型和流行特点虽然研究表明PEDV只有一个血清型，但许多报道和研究文献发现在亚洲流行的毒株相比于欧洲毒株有较大差异。近年来流行的毒株主要功能基因也与以前的毒株亲缘关系较远(Parketa1．，2011)。近年来，我国的科研人员对国内广东、广西、四川、山东、江苏、福建等地发生的腹泻病进行M基因和S基因序列的扩增和比对，发现这些序列与近年来韩国分离毒株 山东农业大学硕士毕业论文以及泰国分离毒株位于同一组，与经典毒株CV777距离较远。1．4猪流行性腹泻病毒的流行病学对PEDV的首次报道是在七十年代初，从1982年到1990年，在比利时、英国、法国、德国、瑞士、保加利亚、荷兰以及中国的台湾地区猪群中检测到了PEDV的抗体(Deboueketa1．，1982；Hofraanneta1．，1989)。首次分离得到了该病毒是在1978年，并且确定该病毒是一种冠状病毒。在七八十年代，猪流行性腹泻病毒频繁地使各个年龄阶段的猪发生严重的水样腹泻，并造成新生仔猪的高病死率。除了北美和澳大利亚，很多的国家和地区都存在PEDV的特异性抗体，并且能分离到该病毒。目前该病已经在世界范围内广泛地流行，尤其是近几年来，多个亚洲国家爆发高致死率的PED，其中包括中国，给养猪业带来巨大的经济损失。该病主要传染源是病猪，病毒主要存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结中，病毒随粪便排出体外，粪便污染的空气、饲料、饮水、用具和交通工具，从而传播该病毒；据报道从母猪的乳汁中也检测到了PEDV病毒(Bridgeneta1．，1998)，自然感染的病例多数是经口腔摄入而被感染，各个年龄段的猪都可以感染发病，但哺乳仔猪的病死率最高，本病主要发生在秋冬季，夏季也有发生，在我国，11月至第二年2月是本病的高发季节。PEDV和TGEV的传播方式差别不大，但与TGEV相比，PEDV在猪场急性暴发，并且较长时间内持续存在，种猪场发病后可能自然地消失，多数呈地方性流行。在拥有断奶仔猪的感染中，PEDV能够通过感染仔猪，因为仔猪断奶而丧失初乳免疫。因此可以推测，PEDV是导致规模化猪场仔猪断奶后发生腹泻的原因之一。猪流行性腹泻病毒的人工感染的潜伏期为24"--48h，但自然发病的潜伏期可能稍微长一些。PEDV在新生的仔猪体内潜伏期为24---36h，在育肥猪体内大约为2d以上(Sueyoshieta1．，1995)。主要经消化道的传播，也有报道呼吸道传播的。哺乳仔猪受害最为严重，一般出现呕吐和严重水样腹泻：新生仔猪感染后会发生严重脱水和死亡，病死率平均为50％；而断奶猪出现持续4"-6d的腹泻，大多数的病猪能够康复，但是生长发育受到影响，生长迟缓，育肥感染后体重减轻；母猪发病后出现精神沉郁、厌食和持续约一周的下痢为主要症状。本病在4"--5周期内可传影响整个猪场，但其传播常有自限性。1．5猪流行性腹泻病毒的I晦床症状和病理变化1．5．1I临床症状 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用PED最明显的症状为严重的水样腹泻，病猪主要的症状为：腹泻、呕吐和脱水，同时出现厌食、精神沉郁、体重减轻。年龄越小的猪，症状表现越重(殷震等，1985)。种猪群感染本病时，发病率和死亡率差异很大，在有的种猪场，所有年龄段的猪均感染发病，发病率会高达100％，此时该病表现与猪传染性胃肠炎(TGE)极为相似，只是传播的速度较慢和哺乳仔猪病死率比较低。1周龄内的仔猪常常腹泻3d"--4d后因脱水严重死亡，病死率平均为50％，但有时会高达80％，日龄较大的仔猪感染约一周后康复。暴发过急性腹泻的猪场，会在断奶后2周～3周后出现持续性腹泻，新引进的猪也可能相继发病。近几年来，在日本和韩国报道均有新生仔猪的急性PED的暴发并且出现高的致死率(Sueyoshieta1．，1995)。在欧洲一些猪场，PED发病率很低。1．5．2病理变化自然感染和实验感染PEDV后，仔猪均出现肉眼可见病变(Ducatelleeta1．，1982；Hwangcta1．，1994；Pospischileta1．，1981；Sueyoshicta1．，1995)。病变区域主要在小肠，肠内充满大量的黄色液体并且膨胀。通过镜检发现，接种病毒24h后，小肠绒毛上的肠细胞出现空泡化并且脱落，这种变化恰好与腹泻发生的时间相互吻合，之后绒毛会迅速变短，酶活性会显著地降低。这些发现在电镜的观察研究中得到证实(Ducatelleeta1．，1982)。这些病理变化和TGEV的病理变化非常相似。在结肠病理变化观察中，未能发现此种症状。细胞的变化主要发生在小肠细胞的胞浆中，可以发现细胞器大量减少，出现了电子半透明区，然后微绒毛和末端网状结构会消失，有的胞浆会突入肠腔，肠细胞变平、紧密连接会消失，脱落进入肠腔中，可见肠细胞中的病毒是通过内质网膜以出芽方式形成的(Ducatellceta1．，1982；Horvfitheta1．，1981；Pospischilcta1．，1981)。在结肠中，含病毒的肠细胞出现了一些细胞病变，但未见细胞脱落。1．6猪流行性腹泻病毒致病机理猪流行性腹泻病毒除了在呼吸道不能复制外，其发病机理与传染性胃肠炎相似。病毒经口鼻感染后进入小肠，主要在小肠绒毛上皮细胞内增殖，首先造成细胞器的损伤，继而出现细胞的功能肿胀、营养物质吸收不良，随着疾病的发展，上皮细胞的损伤开始加重，小肠绒毛出现萎缩，引起营养物质的吸收不良，继而引起渗出性腹泻，最后脱水死亡有研究表明，病毒进入机体后，直接侵害小肠，并不在扁桃体和其他部位大量增殖，所以此病主要侵害部位为小肠(Debouckcta1．，1980；Deboucketa1．，1981；Junweieta1．，R 山东农业大学硕士毕业论文2006)。1．7猪流行性腹泻病毒的增殖培养自从PEDV发生以来，各国的研究学者都在尝试对病毒进行体外分离，但仍然没有发现一种很有效的方法分离该病毒。1988年，Hoffraan等称通过在VERO细胞中加入胰酶，而获得了细胞分离毒。但是此种方法在细胞连续传数代后细胞毒毒力减弱甚至会丢失。PEDV在体外的分离培养仍然是研究该毒株和该病疫苗的一大瓶颈。1．8猪流行性腹泻病毒的诊断方法1．8．1根据临床症状和病理剖检变化初步诊断本病多发于7日龄以内的仔猪，而且病死率很高，感染仔猪主要表现为水样腹泻和呕吐，剖检病死猪，主要的病变是小肠内充满了黄色液体，肠壁变薄，肠壁上有出血点。可根据症状和初步的剖检变化初步诊断。1．8．2人工感染试验可以将病料悬液进行过滤，江绿野通过口腔攻毒入SPF仔猪或者隔离几日的仔猪，攻毒24---一48h可以观察攻毒仔猪的临床症状及病理变化，进行人工感染试验，是鉴定病毒和分离纯化病原的一个重要方法，但此方法耗时较长，而且代价比较高(Guscettieta1．，1998；Knucheleta1．，1992；Leeeta1．，2000)，目前一般使用其他方便简单的方法。1．8．3免疫电镜法(mM)免疫电镜(Immunoelectronmicroscopy)技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。所以mM法既可用已知的PEDV阳性血清来检测未知PEDV抗原，又可以用已知的PEDV抗原来检测未知PED抗体。此种方法可以区分PEDV和同冠状病毒科的其他病毒，方法是将含有抗原和抗体的溶液或血清10000r／rain离心，将两种溶液等量混合，37℃30分钟，然后转移到4"C感18h，然后将样品在31，000r／rain下，4"C离心60分钟，将沉淀物悬浮在少量的蒸馏水中后铺在铜网上，用2％磷钨酸负染色，在电子显微镜下观察，但此种方法比较精确，但步骤繁琐且需要电子显微镜，所以使用不能普及。1．8．4原位杂交技术(ISH)韩国的研究者Kim等用非放射性洋地黄毒苷标记的探针和人工感染仔猪PEDVN基因的互补碱基配对，通过透射电子显微镜在仔猪小肠的上皮细胞的细胞质中观察到黑色的胞质，从而完成猪流行性腹湾病毒的检测和定位。此方法对于福尔马林固定的组织样品，能得到效果更好的检测，检测的阳性率为91％(71／79)(Kimeta1．，)。9 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用1．8．5免疫荧光法该方法具有较高的准确性和特异性，不会和TGEV、PORV等发生交叉反应。具体步骤为：采取的猪的小肠黏膜涂片，用丙酮固定，并加入荧光抗体染色，经充分洗涤，加盖检验后进行干燥，1—2h的结果。1．8．6血清中和试验1994年，林志雄用已经能在PKl5细胞的PEDV-G1毒株建立了微量中和试验，分别对接种过pro油佐剂灭活疫苗猪场，未发生过PED的养猪场、发生过PED的猪场的血清进行试验，证明此种方法具有检测结果可靠、准确，且不能被TGEV、HCV、PORV、PRV阳性血清中和的良好特异性(林志雄等，1994)。1．8．7胶体金抗体检测技术张利勃将葡萄球菌蛋白A(SPA)，以指示媒体，以PEDVM蛋白抗原和抗SPA包自制的抗血清包被在硝酸纤维素膜(NCM)用作测试线和控制线，从而制备检测猪流行性腹泻病毒血清抗体的快速诊断测试条。参考ELISA法和诊断试纸的结果，两者的符合率为在96％。说明该检测技术高效，经济、方便，适合基层防疫检疫人员检测PED(张利勃等，2011)。1．8．8RT-PCR法RT-PCR的方法是实验室和诊断中心最常用的检测PEDV的方法之一。早期Ishikawa、Kubota分别根据PEDV的S基因和N基因序列设计了引物用此方法检测细胞毒和粪便毒，8h之内即可获得结果，方法简单，特异性和灵敏性较高。双重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻的方法首先被韩国建立，可以同时检测猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎，灵敏度高达10TCID50／mE(Kimeta1．，2002)。Kim等人把原位杂交，免疫组织化学和RT-PCR检测结果相比，该结果表明，最好的方法是RT-PCR法，它的重复性最好，但检测福尔马林固定的样品，原位杂交和免疫组织化学导向的方法将是更好的(Kimeta1．，2002)。但是因为RT-PCR法需要的PCR仪的设备，比较特殊，所以尽管PCR法具有较好的特异性和敏感性，但目前该方法只用于实验室诊断，而不能用于养殖场的临床诊断(Ishikawaeta1．，1997)。1．8．9反转录环介导等温PCR法Pen等根据PEDV的N基因设计了6对引物，并且建立了反转录环介导等温扩增技术(RT-I，AⅧ)，该方法最佳反应条件为630C反应50rain。经过与其他方法比较，该法比常规的RT-PCR和ELISA方法相对更为灵敏。该方法具有较好的特异性可以区分PORV、TGEV、PRV、PI汛SV(Peneta1．．2006)。10 山东农业大学硕士毕业论文1．8．10荧光定量PCR法Kim、Song等建立了TGEV和PEDV二重荧光定量RT-PCR方法。使用该方法可以检测到9x101copies／L的病毒，组间和组内的变异系数(cV)分别低于3．43％和3．33％。检测人工感染TGEV和PEDV的仔猪病料，RNA的病毒拷贝量在102和105之间。该方法能够有效地测定病毒的含量，可以为养殖场中感染猪的病毒载量进行检测，为有效防控PEDV提供帮助(Kimeta1．，2002；Songeta1．，2006)。1．8．10ELISA!法ELISA法目前在实验室诊断中得到广泛应用，该方法不仅能够检测血清中的PEDV抗体，还可从粪便和肠道内容物中直接检查PEDV抗原。双抗体夹心ELISA法首先被用于直接检测PEDV抗原，朱维正建立了此方法，与电镜检测相比较，该方法的阴阳性符合率能达到97．37％(朱维正等，1988)。斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)是一种操作简便，灵敏性较高的方法，Roddk发现竞争阻断ELISA方法灵敏度更高，他制备的PEDVM蛋白的单克隆抗体通过建立3种ELISA方法然后检测细胞中的病毒，比较发现竞争ELISA可以检测到102‘5个空斑所形成单位的PEDV病毒粒子。用该方法检测38个曾经受PEDV感染的猪场，80份粪便样品，进行检测。结果发现6个猪场15份类便样品(15％)为阳性(Rodaketa1．，2005)。1990年，Hoffmann等将猪流行性腹泻病毒的培养细胞使用蔗糖密度梯度超速方法离心病毒颗粒，纯化作为包被抗原建立ELISA法。这种方法检测1024份猪血清的，发现这种方法间接免疫荧光法比具有较高的特异性和敏感性(Hofmanneta1．，1989)。1．9PEDV的疫苗预防和治疗1．9．1疫苗预防1．9．1．1组织灭活苗PEDV组织灭活苗首次在中国研制并且使用，此疫苗是以沪毒为研制的，先将分离毒给仔猪灌服，发病后将仔猪剖杀，取小肠和肠道内容物研磨并(肠道内容物应该包括小肠)且制成乳剂，用甲醛将病毒灭活，然后将氢氧化铝作为佐剂，从而制成组织灭活苗，每头母猪在妊娠的时候，注射剂量为3mL的组织灭活苗使母猪被动获得免疫，接种疫苗14d后检测显示能够产生较好的免疫力，免疫母猪后的产仔猪的免疫保护率为97％，跟踪检测显示保护时间可达6个月(王明等，1993)。这类疫苗可以达到较好的免疫效果，但是所制备的疫苗质量不一，免疫效果也不同。1．9．1．2细胞灭活苗 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用有文献报道钱永清等研制成功了PED细胞灭活苗，他在Vero细胞上分离得到PEDV，并进行传代培养进行适应后，甲醛灭活，加入佐剂，在实验室条件下，免疫母猪7d后进行检测显示产生抗体，免疫15d后猪体内产生较高水平的抗体，试验结果显示疫苗保护率达90％以上，猪场试验结果显示猪体总体保护率能达到95％以上的(钱永清等，1999)。细胞灭活苗具有安全、保存时间长的优点，但由于其制备比较困难，且时间长，不利于用于紧急预防。灭活疫苗的免疫方式通常为肌肉注射，但PEDV主要感染小肠黏膜，因此该免疫方式不能有效的激发机体的产生黏膜免疫。1．9．1．3细胞弱毒苗有研究表明，由猪流行性腹泻病毒强毒适应株，如CV777适应Vero细胞系在83代后稳定后接种猪肾原代细胞，适应后，将104"--124细胞适应毒做成五批疫苗，在怀孕后期给母猪进行口服免疫，可预防猪流行性腹泻病毒感染，结果显示疫苗保护是95．92％，而106至139细胞适应毒做成的8批疫苗，可以达到96．2％的保护率(佟有恩等，1998)。Kweon使用分离的野生毒株(命名为KPEDV)适应于Veto细胞传代至93代，再接种怀孕母猪后进行ELISA法检测，结果显示疫苗显著改善的母猪免疫应答水平和初生仔猪抵抗感染的能力(Kweoneta1．，1999)。韩国利用DRl3株细胞传代致弱后(Songeta1．，2007)，采用口服和肌肉注射两种方式进行免疫，然后统计仔猪的感染率，结果显示口服疫苗的仔猪发病率(13％)远低于肌肉注射免疫的仔猪(60％)，检测仔猪抗PEDV的SlgA含量显示口服组远高于肌肉注射组。研究表明，细胞弱毒苗的免疫途径一般会使用口服免疫，通过免疫即将妊娠的母猪，使母猪产生母源抗体，从而使仔猪被动获得一定的免疫保护力；有时直接给仔猪口服疫苗，进行主动免疫，从而达到预防PEDV感染的目的(佟有恩等，1999)。但是疫苗株存在毒力返强和散毒的危险，而且细胞分离病毒较为困难，所以细胞弱毒株还未得到普遍应用。1．9．1．4转基因疫苗转基因植物疫苗受到越来越广泛的关注，具有成本低廉、生产简便、安全实用、低温运输和无需冷藏并且能诱导产生黏膜免疫的优点。转基因的植物疫苗是把机体的免疫机理和植物的基因工程结合起来，在植物体内导入外源基因，从而获得能使机体产生特异性免疫的新一代疫苗。比如将PEDVS基因转入到烟草中，然后提取转基因烟草蛋白给小鼠注射，通过血清蚀斑减数和中和测定证明转基因烟草蛋白具有免疫原性，小鼠直接服用这种转基因植物能够产生黏膜免疫和全身免疫(Baeeta1．，2003)。1．9．1．5乳酸杆菌疫苗12 山东农业大学硕士毕业论文乳酸杆菌是动物体内的肠道益生茵，具有控制肠道感染、降低血清胆固醇、增加食物的营养价值、并且可以诱导机体内产生非特异性多种生理功能。但是与酵母菌、大肠杆菌相比，乳酸菌的分子遗传学的研究起步比较晚。近年来，乳酸菌分子生物学及作用机制的研究取得了重大发现，背景也获得深刻的认识。近年来乳酸杆菌的表达系统也获得了很好研究，从而使乳酸杆菌疫苗的研制成为热点。葛俊伟将重组PEDV能表达的抗原位点的N部分基因的体导入乳酸杆菌中，并且口服该乳酸菌，显示重组蛋白的表达能够刺激局部产生的肠免疫应答，而且诱导特异性免疫应答，从而奠定了口服疫苗的基础。1．9．2治疗本病应用抗生素治疗基本无效，猪干扰素可以降低猪体重的损失。本病尚无特效药物和疗法。小猪发病后应进行紧急免疫，治疗发病小猪可以灌服葡萄糖甘氨酸等电解质。对于分娩14d以内的母猪进行隔离。1．10本研究的目的和意义自2011年冬季以来，山东省部分地区出现了仔猪严重腹泻，并且死亡率较高。2014年3月，在美国也发生严重腹泻病毒。在89个农场的大型调查中，1000头母猪爆发PEDV，可导致2501头仔猪不能成功断奶。PEDV由过去温和地引起腹泻，导致现在严重的仔猪腹泻并且死亡。诊断方法和抗体检测方法成为防治PEDV的关键。PEDV很难被分离，所以全病毒包被的ELISA试剂盒非常昂贵，国内有报道通过M蛋白和部分S蛋白建立了间接ELISA方法，但并未有相应的成品试剂盒广泛使用。本试验表达了完整的N蛋白，并且建立的间接ELISA方法，优化条件后同样达到了检测PEDV抗体水准。并且通过建立的ELISA方法对免疫猪群抗体、未免疫猪群抗体的检测和某灭活疫苗免疫后抗体的追踪检测，对防治PEDV的防治有一定的指导意义。 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用2材料与方法2．1材料2．1．1毒株和病料2012年1月至2013年12月，山东省动物疫病预防与控制中心经检测为PEDV阳性的病料。本实验室检测并获得其基因序列的毒株的病料。其中PEDVDZl2-3株为山东动物疫病预防与控制中心保存，并且由赵梦姣N基因测序成功，GenBank登录号：JX406136。2．1．2主要试剂M．MLV、RibonucleaseInhibitor、Taq酶、dNTPmixture、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、IPTG、HindⅢ限制性内切酶均购自大连TaKaRa公司；DNAMarkerDL2000、DNAMarkerDLl5000、BluePlusIIProteinMarker、Triozol试剂购自北京全式金生物技术有限公司；胰蛋白胨(Tryptone)及酵母抽提物(YeastExtract)购自Oxiod公司；Ni-NTAResin、CloneEZ重组克隆试剂盒购自南京金斯瑞生物科技公司；HRP标记羊抗鸭IgG购自美国KPL；琼脂糖凝胶回收试剂盒、增强型HRP．DAB底物显色试剂盒、Bradford蛋白质定量试剂盒购自北京d根生物科技公司(TL蝌GEN)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、硝酸纤维素(NC)膜、DIGHi曲PrimeDNALabelingandDetectionStarterKit试剂盒购自德国Roche公司；质粒小提试剂盒购自Omega公司。试验所有引物均由上海生物工程有限公司合成。NaCI、Na2HP04·12H20、NaH2P04、NaC03、NaHC03、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tween-20、无水乙醇、异丙醇、氯仿、双氧水等均为分析纯，购自d津凯通。四丁基硼氢化铵(TBABH)、二甲基乙酰胺(DMA)、TrisBase、Tris．HCl、Glycine、十二烷基硫酸钠(SDS)、咪唑、尿素、脱脂奶粉购自北京索莱宝生物技术有限公司。2．1．3主要仪器Sigma2K微量台式冷冻离心机(Sigma公司，德国)，GelDocXR紫外凝胶成像系统(BIO．RAD伯乐公司，美国)，，PCR仪(Eppendorf,德国)，MLS．3020高压锅(SANYO公司，日本)，DYe8型稳压稳流电泳仪(琪特分析仪器有限公司，上海)，YP600电子d平(上海d平仪器厂)，电泳系统(Bio．Rad公司，美国)，HYQ．2110涡旋混匀器(精骐有限公司，美国)，02．2电热干燥箱(上海市上海县第五金厂)，DW-40L188海尔超低温保存箱(青岛海尔)，PW-960自动洗板机(深圳)，移液器(吉尔森公司，法国)，14 山东农业大学硕士毕业论文H19219pH计(HANNA公司，美国)，7300荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)，2IMS．25全自动雪花制冰机(常熟市雪科电器有限公司)，DK-8D电热恒温水槽(上海都康仪器设备有限公司)，电热恒温培养箱(山东潍坊医药集团股份有限公司医疗器械厂)，MODEL680酶标仪(伯乐公司，美国)。超声破碎仪(宁波新芝)2．1．4试验中配制的试剂2．1．4．1琼脂糖凝胶电泳试剂EB贮存液(10mg／mL)：10mgEB溶于lmL水中，于棕色瓶中4"C保存。50xTAE：称量TfisBase2429，Na2EDTA·2H2037．2g，向烧杯中加入800mL去离子水，充分搅拌混匀。加入57．1mL的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容到1L后，室温保存。1％琼脂糖凝胶(含EB)：在200mL三角瓶中，将1g琼脂糖加入100mLlxTAEbuffer中，微波炉加热2min溶化完全即可。2．1．4．2原核表达试剂IPTG(24mg／mL)贮存溶液：称量1．2gIPTG置于50mL容量瓶中，加入40mL灭菌水混匀溶解后定容至50mL；用0．22gm滤膜的无菌滤器过滤除菌，小管分装后于．20℃保存。2xYT培养基：胰蛋白胨16g；酵母浸出物10g；NaCl5g，完全溶于1L去离子水中，用1MNaOH调pH值至7．2，高压灭菌20rain，保存于4。C。Amp+／LB液体培养基：在液体LB培养基灭菌后，待温度降至50℃以下时，按照5止血儿加入氨卞青霉素贮存液，使其终浓度达到50gg／mL，4。C保存备用。Amp+／LB固体培养基：按照配方配制液体LB培养基，按1．5％(W／V)加入琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min，待温度降至45"C左右时，按照5止，／mL加入氨苄青霉素贮存液，使其终浓度达到50pg／mL。然后无菌操作倒入灭菌的玻璃培养皿中，冷却，4。C保存备用。Kan+／LB液体培养基：在液体LB培养基灭菌后，待温度降至50"C以下时，按照5此，／n也加入硫酸卡那霉素贮存液，使其终浓度达到50肛g／mL，4℃保存备用。Kan+／固体LB培养基：按照配方配制液体LB培养基，按1．5％(WⅣ)加入琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20rnin，待温度降至45"C左右时，按照5pM【nL加入硫酸卡那霉素贮存液，使其终浓度达到50肛g／mL。然后无菌操作倒入灭菌的玻璃培养皿中，冷却，4"C保存备用。15 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用ChI+／LB固体培养基：按照LB配方配制液体培养基，按1．5％(W／V)加入琼脂粉，高压灭菌20rain，待温度降至45"C左右时，按照1：1000(V／V)加入氯霉素贮存液，使其终浓度达到50pg／mL，然后无菌操作倒入灭菌的玻璃培养皿中，冷却，4℃保存备用。2．1．4．3聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂2xSDS上样缓冲液：1mol／LTris·HCl(pH6．8)4mL；二巯基乙醇4mL；10％SDS16mL；1％溴酚蓝8mL；甘油8mL，最后定容至40mL。30％丙烯酰胺贮存液：丙烯酰胺29g；双甲叉丙烯酰胺1g；加双蒸水至100mL，溶解后过滤，棕色瓶中4"C保存。10mLl2％分离胶：超纯水3．3mL；30％丙烯酰胺贮液4．0mL；1．5mol／LTris·HCl(pH8．8)2．5mL；10％SDSl00pL；10％APS(过硫酸胺)100pL；4pL加TEMED后，立即混匀加入制胶槽。2．5mL4％浓缩胶：超纯水2．1mL；30％Acr／Bic0．5mL；1．0mol／LTris·HCl(pH6．8)O．38mL；10％SDS30“L；10％APS("z-t硫酸胺)30“L；TEMED，加3pLTEMED后，立即混匀加入制胶槽。5xTds-甘氨酸缓冲液：Tris15．1g；甘氨酸94．0g；SDS5．0g；加水定容至1000mL染色液：考马斯亮蓝染色液450mL；冰醋酸100mL；考马斯亮蓝粉末2．5g；加水定容至1000mL，室温保存。脱色液：甲醇500mL：冰醋酸100mL；加水定容至1000mL。2．1．4．4Ni．NTAResin纯化蛋白试剂超声破菌缓冲液(20mMTris·CI：0．5MNaCl；1mMEDTA；1mg／rnL溶菌酶)：Tris·C10．3152g；NaCl7．31g；EDTA0．07309：溶菌酶250mg溶于250mL灭菌去离子水中。BufferB(100mMNaH2P04；10mM'Iris·C1；8Murea)：称NaH2P04·2H201．5601g；Tris·C10．1576g；尿素48．08g放入250mL试剂瓶中，加入80mL四蒸水，用1MNaOH调pH至8．0，然后定容至100mL。BufferC(100mMNaH2P04；10mMTris·Cl；10mMImidazole：8Murea)：称NaH2P04·2H201．56019：Tris·C10．1576g；咪唑0．058g；尿素48．08g放入250mL试剂瓶中，加入80mL四蒸水，用1MNaOH调pH至8．0，然后定容至100mL。16 山东农业大学硕士毕业论文BufferE(100mMNaH2P04；10mMTris·C1；250mMImidazole；8Murea)：称NaH2P04。2H201．5601g；Tris·Cl0．1576g；咪唑1．702g；尿素48．08g，加入250mL试剂瓶中，再加80mL四蒸水，用1MNaoH调pH至8．0，然后定容至100mL。6MGu·HCl、0．2M乙酸：称GuHCl28．659g，用1mL移液器吸取575此冰乙酸，放入100mL试剂瓶中，用四蒸水定容至50mL。100mMNiS04：称NiS04．61-1200．2629g加入到250mL试剂瓶中，加四蒸水定容至100mL。2％SDS：称2gSDS放入100mL试剂瓶，加四蒸水定容至100mL。100mMEDTA(pH8．O)：称EDTA2．9225g，放入250mL试剂瓶中，加入70mL四蒸水，用1MNaOH调至8．0，用四蒸水定容至100mL。2．1．4．5WesternBlot主要试剂转移缓冲液(电转液)：甘氨酸14．4g；Tris-Base3．03g；甲醇200mL；加ddH20定容至1000mL；10xTds缓冲盐(TBS)：24．2gTris-base，80gNaCl，调pH至7．6，定容至1L；洗脱液(TBST)：O．1％Tween-20的1xTBS溶液(V／V)，1mLTween-20加入到1L的1xTBS中；WB封闭液：脱脂奶粉2．5g溶于100mL的lxTBS中；WB显色液：DAB底物显色试剂盒(TL～NGEN)。2．1．4．6间接ELISA方法主要试剂包被缓冲液：1×碳酸盐缓冲液(100mL，pH．=9．6)：Na2C030．2756g，NaHC030．6216g，溶解定容至100mL水，测量pH在9．5~9．7之间(若超出此范围则不可使用)。4"C可保存一周。洗涤液：0．05％PBST(500mL，PH=7．2-q：0．1)：NaCl4．25g，NaI-12P04·2H20O．178g，Na2HP04·12H201．386g，溶解定容至500mL，测量pH在7．1-7．3(若超出此范围则不能使用)，常温可保存一月，在于每1LPBS加入O．5mLTween．20，充分混匀，4"C可保存一周。封闭液：5％drymilk／PBS’T(100m1)：将5g脱脂奶粉溶解于100mLPBST中，短期保存于4"C，长期保存于．20℃。稀释液：5％drymilk／PBS’T(100mL)：配方同上。TMB显色液：BufferA(1L)：称量66．5063g柠檬酸钾，溶解于800mL四蒸水并 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用用浓盐酸调节pH至4．0，加入314此H202，定容至1L，4"C保存；BufferB(30111L)：称量0．2956g四甲基联苯胺(TMB)，0．0633g四丁基硼氢化铵(TBABH)溶于30mL二甲基乙酰胺(DMA)，4"C避光保存。使用时，将BufferA和BufferB以39：1的比例混合，需现配现用。终止液，3MH2S04：将浓H2S04以1：5的比例慢慢加入水中，混匀备用。2．1．4．7其它主要常用试剂1％oDEPC水：将DEPC原液按1：1000比例加入去离子水中，避光混匀，高压灭菌20min，．20℃保存备用。0．1MCaCl2溶液：1．1099g无水CaCl2，溶解于90mL去离子水中，定容于100mL，用0．22lan虑膜过滤除菌，分成10mL每份，．20"(2冻存。100mg／mL氨苄青霉素(加np+)贮存液：称量5g氨苄青霉素粉末置于50mL容量瓶中，加入40mLddH20，充分混合溶解后，定容至50mL，用O．22lam无菌滤器过滤除菌，1．5mlEP管分装，．20℃冻存备用。10mg／mL硫酸卡那霉素(勋n+)贮存液：称量O．5gKan+置于50mL容量瓶中，加入40mLddH20，充分混合溶解后，定容至50mL，用O．22pm无菌滤器过滤除菌，1．5mL离心管分装，．20℃冻存备用。50mg／mL氯霉素(Chl+)贮存液：称量1．0gChl+溶于20mLddH20，用0．22gm无菌滤器过滤除菌，1．5mL离心管分装，．20℃冻存备用。LB液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g，完全溶于1L去离子水中，调pH值至7．0，分装，121℃高压灭菌20rain，冷却后4℃保存备用。2．2方法2．2．1PEDV荧光定量PCR方法的建立的材料与方法2．2．1．1引物和探针的设计参照GenBank已发表的PEDV序列JQ282909的M基因序列进行分析比对，找到保守序列部分，利用Primer5．0分别设计PEDV引物和探针，引物继而探针由上海生工生物工程有限公司合成，引物和探针序列见表2．1。 山东农业大学硕士毕业论文表2-1试验中所用到的引物和探针Table2-1Theprimersandprobeusedinthisstudy2．2．1．2处理样品仪器准备：塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次(EP管)2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡I％oDEPC过夜，再烤干)3、匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，再高压(不需要泡DEPC)4、取组织用的剪刀用时在火上烤一下。组织处理：将小肠和肠内容物的收集置于研磨器中，添加在pH7．2的PBS，8000r／rain离心5min制备组织匀浆，将上清液置于．80。C冷冻机的备用。血样将被收集在1．5ml离心管中，在4"C冰箱中，静置4--10h，3000r／rain的离心6min取上清液，取上清液置于．20℃冰箱保存备用2．2．1．3病毒RNA的提取本试验中提取RNA采用了AxyPrcp公司的体液病毒DNA／RNA小量试剂盒进行的提取，提取的说明书进行，具体操作过程如下：(1)取2．1．2．1中处理的样品上清2001xL，转入1．5mL离心管中；(2)加入200I．tLBufferv-L，缓慢反复振荡6．7次，混合均匀，室温静置5min；(3)加75此BufferV-N，缓慢反复振荡混合均匀，4℃，12，000r／rain，5min，离心；(4)取上清到新的2mL离心管中，并且加入3001xL异丙醇(已配成含有1％的冰乙酸)，上下缓慢倒置6"--8次，混合均匀；(5)准备好制备管放在2ml离心管中，取步骤4中的混合液移入置备管中，6000r／rain离心lmim(6)丢弃滤液，将置备管放回到2mL离心管中，加5001xLBufferW1A，室温静置lmin。12．000r／rain离心lmim19 猪流行性腹泻病毒N蛋自的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用(7)弃滤液，将置备管放回到2mL离心管中，加入800rtLBufferW2，12，000r／min离心lmim(8)将置备管放回回2mL离心管中，12，000r／rnin离心2mira(9)将置备管放于新的1．5mL离心管(试剂盒内提供)中，在置备管膜中央加40"-"60}tLBufferTE(nuclease．free)，室温静置lmin后12，000r／rain离心lmin，洗脱RNA。备注：BufferVL：细胞裂解液，室温密闭贮存。BufferVN：中和液。室温密闭贮存。BufferWIA：洗涤液。使用前，根据瓶上指定的体积加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存，可用无水乙醇或95％乙醇。BufferW2：去盐液。使用前，根据瓶上指定的体积加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存，可用无水乙醇或95％乙醇。BufferTE：洗脱液。10mM"Iris．HCl，O．1mMEDTA，pH7．5。室温密闭贮存2．2．1．4目的片段扩增(1)RNA的反转录，试验中采用Takara公司的PrimeSe妒II1stStrandeDNASynthesisKit对提取的RNA进行反转录成eDNA。反转录体系总体积为20}tL，包括1¨gTotalRNA、41．tLReactionbuffer、1pLOlig(dT)18,2“LMIX、0．51xL反转录酶、0．5I_tLRNA酶抑制剂，加水至20I．tL。反转录反应条件：42"C60mira85"C5min；迅速冷却后，4"C保存。(2)PCR扩增：以反转录成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为：ddH2014．3此、10xBuffer(M92+)2．5I_tL、dNTPs2．01．tL(2．5mmoI／0L)、PrimerMPJ-F1．0“L、PrimerMPJ·R1．0此、DNATempLete2此、Taqenzyme0．2I-tL。PCR扩增条件为：94"C5mira94"C1rain，55℃30s，72℃30s，共32个循环；最后72℃延伸lOmin。4"12保存。2．2．1．5目的片段的回收PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，如果检测为阳性，将目的片段进行胶回收，按照TaKaRa胶回收试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下：(1)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA回收率，当胶块超过300mg时，则使用多个Column进行回收。(2)切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。(3)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=l“1进行计算。 山东农业大学硕士毕业论文向胶块中加入3个凝胶体积量的胶块融化液BufferGM；本试验中采用的是1％的凝胶浓度，所以加入3倍凝胶体积的Buffer。(4)匀混合后75℃加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45。C力n热)。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约6～10分钟)。均匀混合后75℃加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45。C力I热)。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约6～10分钟)。注：胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。(5)当凝胶完全溶化后，观察融胶液的颜色，如果融胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块融化液中加入101aL3M醋酸钠溶液(pH5．2)。均匀混合至溶液恢复黄色。(6)向上述胶块融化液中加入DR-IBuffer量的1／2体积量的DR-IIBuffer，均匀混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。(7)将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。(8)将上述7的溶液转移至SpinColumn中，12，000r／min离心1分钟，弃滤液，弃滤液。注：如将滤液再加入SpinColumn中离心一次，可以提高DNA的回收率。(9)将500m的RinseA加入SpinColumn中，12，000r／min离心30秒钟，弃滤液。(10)将700斗的RinseB加入SpinColumn中，12，000r／rain离心30秒钟，弃滤液。注：请确认RinseB中已经加入了指定体积的100％乙醇。重复操作步骤(10)。(11)将SpinColumn安置于新的1．5血的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25山的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。注：把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。(12)12．000r／rain离心lmin洗脱DNA。2．2．1．6目的片段与克隆载体的连接将胶回收的产物进行凝胶电泳检测，如回收成功，将获得的目的基因与pMDl8．T载体进行连接，连接总体系为10IXL：胶回收产物5．0此；SolutionI4．5此；pMDl8-T载体O．5此。将上述反应液置于16。C连接3h后，4。C连接过夜。2．2．1．7连接产物的转化将上述连接产物转化到Topl0感受态细胞中，操作步骤如下：(1)取50止冰上融化的感受态细胞，加入上述连接产物1．5此，轻轻地混匀，冰浴30rain。21 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用(2)精确地42"C热激30S，之后快速将其移到冰浴2rain，该过程不要摇动。(3)向离心管中加入500此灭菌LB培养基，混匀后置于37。C摇床，200r／rain培养1h，复苏细菌。(4)吸取250gL菌液涂布到含Amp的LB琼脂培养基上，将平板置于37"C温箱至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养2．2．1．8质粒的提取使用质粒提取试剂盒(TransGen公司)提取培养物菌体中的质粒，具体步骤如下：(1)在超净台中挑取单个菌落接种于4mL含100pg／mLAmp的LB培养基中，37"C，250r／min过夜培养；(2)平衡柱子：取700此BufferGPS平衡缓冲液加入HibindDNA结合柱，12000r／min离心2rain，倒弃收集管废液，把柱子重新放回收集管。(3)取3mL菌液分两次加入离心管，室温12000r／rnin离心1rain，弃去上清。(4)加入250儿SolutionI重悬菌体。(5)加入250此SolutionII上下颠倒，直至液体澄清，约2rain。(6)加入350此预冷的SolutionⅢ，迅速轻柔地颠倒数次，直至沉淀不再产生，室温12000r／min离心10rnin。．(7)将上清液全部转移到结合柱中，室温12000r／rain离心1rain。(8)倒掉收集管废液，将结合柱加入500此BufferHB室温12000r／rain离心1rain．(9)倒掉收集管废液，将结合柱放回并加入700此DNAWashBuffer12000r／rnin离心2min，洗涤柱子。(10)将结合柱放回收集管12000r／rain离心2rain，干燥柱子。(11)将干燥的结合柱放入新的灭菌离心管中，在其中央加入30此ElutionBuffer12000r／rain离心2rnin洗脱质粒。2．2．1．9质粒的PCR鉴定将以上小剂量制备的重组质粒，pMDl8T-PEDVN稀释50倍后分别作为模板，质粒的PCR鉴定反应体系如下：ddH2017．3pL，10×buffer2．5I-tL，dNTPs2．0VL，上游引物1此，下游引物1此，质粒DNA1止，TaqDNA聚合酶0．2U，总体积259L。PCR反应条件为：94"C预变性5min,随后进行94"C60s，53℃60s，72℃30s，共循环32次，扩增循环结束后72"C延伸10min，同时设立无模板的阴性对照。反应结束后，取5此PCR产物用1．O％琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR鉴定为阳性，送上海生工公司测序。22 山东农业大学硕士毕业论文2．2．1．10标准品的制备对阳性质粒进行稀释，使用紫外分光光度仪器测A260和A280，并且测A260／A280比值(纯净的DNAA260／A280比值应为1．8．2．O)。DNA原液浓度=A260x稀释倍数x50(ng／l-tL)。质粒浓度换算公式(copies／I_t1)=(tool数M)}6．02x1023=[质量(g)／分子1]／ul*6．02x1023=【质量(rig)x10‘9／分子量】M·6．02x1023=浓度(ng^】L)×6．02x1014／分子量。2．2．1．11荧光定量PCR方法优化(1)荧光PCR方法的优化对循环数、退火温度、探针浓度进行摸索以获得最佳的反应条件。(2)标准曲线的建立经过测定OD260m和公式计算，提取质粒的大约浓度为9．8x109copies／lxL。稀释质粒标准品至104、103、102、101、1copies／-tL，经荧光定量PCR仪检测，得到相应的动力学曲线，并计算出相应的标准曲线。(3)灵敏性试验将已知拷贝数的的质粒(含目的基因)做10倍梯度稀释，稀释至1个copy，检测仪器不能检测到的数目，以此得到荧光定量PCR所能检出的最小拷贝数(4)特异性试验以CSFV、TGEV、PRRSV和PEDV的阳性病料的核酸和水为模板，应用制定的荧光定量PCR方法进行特异性试验。(5)重复性试验将标准品质粒10倍稀释到10～105copies／uL，5个梯度，每个梯度重复3次，进行荧光PCR检测。通过所得的ct值计算该方法的变异系数。2．2．1．2荧光PCR方法的初步应用、、(1)检测本实验室保存的12份PEDV阳性病料(该病料的PEi)V的M基因已经测序成功)，分别使用RT-PCR的方法和荧光PCR的方法进行检测。对比检测的检出的符合率。(2)本实验室接受的40份仔猪腹泻症状的病料，分别使用本试验建立的荧光定量PCR方法和某公司PEDv-TGEV二RV三联荧光RT-PCR试剂盒检测，对比检出符合率。 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用2．2．2PEDV的N蛋白基因原核表达的材料与方法2．2．2．1N基因表达引物的设计参考GenBank中已发表的PEDV的N蛋白基因的序列和本实验室测序得到的12株病毒的N基因设计合成了一对特异性引物(表2．2)，预计扩出全长N基因1326bp，并分别在上下游引物5’端加入了BamHI和XhoI特异性酶切位点，引物由上海生工公司合成。表2．2N基因引物Table2-2TheprimersofNgeneinthisstudy2．2．2．2RNA提取及RT-PCR扩增以山东流行株DZ12．3为模板，扩增N基因。将DZl2．3株的小肠及其肠内容物置于研钵中充分剪碎后研磨，加入pH7．2的PBS制成组织匀浆，8000r／min离心5min，取上清200lxL，用Trizol对样品进行RNA提取，提取步骤按2．2．1．3进行。基因扩增：用宝生物一步法RT．PCR反应试剂盒进行扩增，体系总体积为50此：PrimeScript1StepEnzymeMix21xL；2xlStepBuffer259L；PEDVN-F(20uM)llxL；PEDVN．R(20uM)lgL；RNA2皿；RNaseFreedH20171xL。一步法RT．PCR反应具体程序为：50℃30min，94℃5min，1个循环；94℃30s，53℃30s，72℃90s，32个循环；72℃延伸10rnin。取5lxLPCR产物用O．8％琼脂糖凝胶电泳进行检测。2．2．2．3重组质粒pMDl8．T-PEDVN的构建(1)经过PCR扩增后，产物经凝胶电泳检测片段大小与预期一致定为疑似阳性，切胶对目的片段进行回收。胶回收步骤按照2．2．1．5所述的进行。(2)回收片段与pMDl8．T载体的连接，将回收的目的基因PCR产物和pMDl8．T载体于4。C水浴中连接过夜。连接体系总体积10此：pMDl8．T1“L，目的基因3此，SolutionI60L。(3)连接产物的转化，按照2．2．1．7中的步骤进行。24 山东农业大学硕士毕业论文(4)重组质粒的和提取PCR鉴定，按照2．2．1．8和2．2．1．9的方法进行。2．2．2．4重组表达质粒pET30a-PEDVN的构建用限制性内切酶BamHI和Xho1分别双酶切质粒pMDl8．T-PEDVN和pET30a，反应体系总体积20此：BamHIO．8此，XhoIO．8此，质粒DNAlogL，10xTBuffer21xL，ddH206．4此。37"C恒温水浴锅中反应2h，用1％琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果，并按照2．2．1．5方法回收目的条带。目的片段与表达载体的连接、转化：将回收纯化约5500bpI拘pET-30a片段和1326bp的N基因片段，用T4连接酶4"C连接3h。按总体积10体系进行连接反应，体系组成为酶切后的pET30a大片段2p,L，DNA6．5p,L，T4DNA连接酶O．5p,L，10xT4Buffer1此．按照2．2．1．7中的方法转化感受态细胞BL21中，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基平板，37℃培养过夜。重组质粒pET30a-PEDVN的提取与鉴定按照方法2．2．2．3对重组质粒进行PCR、酶切及测序鉴定，鉴定正确后，命名重组质粒为pET30a-PEDVN。2．2．2．5N蛋白的初步诱导表达经过鉴定后，将正确的重组质粒转化入E．coliBL21中，挑取单个菌落，接种于到还有卡那霉素的2YT培养基中，经37"C摇床中震荡培养。当A600在O．6～1．0时，加入IPTG至终浓度为1．0mmol／L，继续继续震荡培养6h。以空载体菌和未加IPTG的培养物为对照。2．2．2．6SDS．PAGE验证表达产物表2-3分离胶配方体系Table2-3Then删onsystemofseparationGel组分体积(mL)H2030％Acrylamide1．5MTris-HCl(pH8．8)lO％SDS10％过硫酸铵TEN也DVtM3m5J脱O3420Ol 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用(1)将玻璃板洗涤干净，固定于制胶架上。(2)配胶：先配10％．的分离胶(配方见表2．3)，水封顶，胶凝固倒出水，用吸水纸吸干，再配4％的浓缩胶(配方见表2．4)，插上合适的梳子，室温凝固30min。(注：体系要均匀，勿产生气泡。)表2-4浓缩胶配方体系Table2-4Thereactionsystemofspacergel组分体积(mL)H2030％Acrylamide1．5MTris-HCI(pH8．8)lO％SDSlo％L立硫酸铵TEⅣ匝D1．400．33O．25O．020．02O．002(3)样品的处理：取lmL经过诱导表达的菌液，12000r／rain离心3min，倒掉上清，收集菌体，用pH7．4为PBS洗涤后，用PBS重悬菌体，加入50I．tL的2xSDS上样buffer，水浴煮沸5min，12000r／min离心3min后，取10此上清进行SDS．PAGE电泳。(4)加样：小心拔去梳子，向槽中加入电泳缓冲液，使其没过各加样孔，微量加样器吸取处理好的样品。当加完一个样品后，必须在电极缓冲液中彻底地清洗微量加样器。加标准蛋白Maker作参照。(5)电泳：在浓缩胶调电压80V，待样品完全进入分离胶时，将电压调至120V。约2．5h后，至样品中的溴酚蓝指示剂到底部，停止电泳。(6)考马斯亮蓝染色：电泳结束后，关掉电泳仪，把玻璃板从电泳装置上卸下，轻轻撬开两层玻璃板，用剥胶板把凝胶取下，置于考马斯亮蓝染色液中浸泡，染液必须没过凝胶，在平缓摇动的摇床上，室温染色30rain左右。(7)脱色：脱色：从染色皿中取出后用去离子水洗净凝胶，然后在脱色液中脱色4h，每1h换一次脱色液，脱净颜色后观察拍照。2．2．．2．7N蛋白的表达和表达条件的优化将酶切鉴定正确的重组菌接种到Karl+抗性的LB培养基中过夜培养保存菌种，部分26 山东农业大学硕士毕业论文进行如下操作(其中SDS．PAGE蛋白质电泳按如上步骤操作)：(1)将培养好的菌液按1：100比例分别转种于Kall+抗性的5mL2xYT培养基，在37℃200r／min振摇约4h，同时设阴性对照(空质粒)和空白对照(空菌)，各取2mL离心收集菌体，去离子水重悬，按1：2加上样缓冲液煮沸10min，进行SDS．PAGE蛋白质电泳，分析目的蛋白是否表达。(2)分别将收集的细菌培养液于4"C、4000r／rain离心5rain，收获细胞沉淀，PBS重悬洗涤细胞三次，最后用超声破菌缓冲液重悬，置于超声细胞破碎仪进行细胞破碎，破碎条件：0℃冰浴，工作1s，间隙2s，共20rain，功率为400W。超声完毕，12000r／min离心10rain，分别收集裂解上清及沉淀(用PBS重悬)，加上样缓冲液煮沸10min进行SDS．PAGE蛋白质电泳，分析融合蛋白存在形式。(3)在4支各含5mL培养基的试管中接种表达茵，在OD值约为1时加入IPTG至终浓度依次为1mM(即5p,LIPTG溶液)、0．8mM(4l,tLIPTG溶液)、0．4mM(3止IPTG溶液)、0．2mM(2此IPTG溶液)、O．1mM(1rtLIPTG溶液)37℃200r／rain再培养6h，进行SDS．PAGE蛋白质电泳，分析蛋白表达量，确定IPTG最佳浓度。(4)在4支各含5mL培养基的试管中接种表达菌，37℃条件下分别用140r／min、160r／rnin、180r／rain、200r／min、220r／rain在OD值约为1时加入IPTG终浓度为1mM，再培养6h，进行SDS．PAGE蛋白质电泳，分析蛋白表达量，确定最佳转速。(5)同理(4)，在温度条件分别为22℃、25℃、28℃、30℃、37℃下，220r／min培养6h，进行SDS．PAGE蛋白质电泳，分析蛋白表达量，确定诱导温度。(6)在100mL的三角瓶中加入30mL的培养基，在OD值约为1时加入IPTG终浓度为1mM，37℃220r／rain培养，分别在培养1h、2h、3h、4h、6h各取2mL离心保存，加上样缓冲液煮沸10mill进行SDS-PAGE蛋白质电泳，确定最佳诱导时间。2．2．2．8重组融合蛋白的纯化按照Ni-NTASef'moseKITHis标签蛋白纯化试剂盒操作。(1)柱子的平衡：用BufferB冲洗柱子，直至流出液OD280nm值约为0；(2)上样：将样品液0．45lain滤膜过滤后，过柱两次，控制流速约1mL／min，流出液每管1mL接5管依次标记为B1．B5；(3)洗杂：用两倍体积的BufferC洗柱子，控制速度约1mL／min，直至流出液OD280nm值约为0，流出液每管1mL接5管依次标记为C1．C5；27 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用(4)洗脱目的蛋白：用梯度浓度的咪唑BufferE洗脱目的蛋白，速度约为1mL／min，至流出液OD280nm值约为0，每离心管回收1mL，并分别测定OD280nm值，将OD280nm值大于O．5的依次标记为E1．Em2．2．2．9重组融合蛋白的浓度测定采用上海生工的BRADFORD法蛋白浓度测定试剂盒进行测定，具体步骤如下：(1)取7个离心管，将标准的BSA蛋白标准液依次稀释蛋白终浓度为0、10、20、40、60、80、100、150ug／mL，标记为0．7号管。(2)样品进行适当倍数的稀释。(3)取(1)中所述的O．7号管中各浓度的蛋白溶液和样品稀释液各100uL，加入lmLBradford试剂，迅速混匀。(4)5min后以O号管为空白对照。在分光光度计上测各管溶液的A595，(5)重复依次，计算两次测量值的平均值。(6)根据所得的值在EXCEL上，绘制标准曲线。在标准曲线上找到纯化蛋白稀释液的浓度。样品蛋白浓度(ug／mL)=样品稀释液的蛋白浓度木样品稀释倍数2．2．2．10纯化蛋白的WesternBlot分析WesternBlot方法分析表达产物的具体步骤如下：．(1)SDS．PAGE凝胶电泳：将纯化好的E蛋白样品进行SDS．PAGE电泳，当指示剂到达电泳槽底部时停止电泳，将凝胶取下。(2)转膜：裁剪一张与凝胶块同样大小的PVDF膜，裁剪8张大小稍小于膜的滤纸，将膜和滤纸均用转膜液润湿，按照负极—海绵垫一三层滤纸—PVDF膜—凝胶块—三层滤纸—海绵垫一负极的顺序组装，赶净气泡，加入预冷的电转液，加入冰袋，80V预转30min，120V电转1h。(3)封闭：拆出上述PVDF膜，用TBST洗涤3次，放入封闭液，摇床上37℃温育2h。(4)一抗孵育：弃去封闭液，用TBST洗涤3次，加入用封闭液1：1000稀释好的一抗(PEDV阳性血清)中，于摇床上37℃孵育2h。(5)二抗孵育：弃去一抗反应液，用TBST洗涤3次，将膜移至用TBST1：1000稀释好的二抗(商品化的HRP标记的兔抗猪IgG)中，37℃孵育2h。(6)显色：弃去二抗溶液，用TBST洗涤3次，用TIANGEN的DAB显色试剂盒显色，按说明书配制显色液，在试管中加1mL1XI--IRP反应缓冲液，依次再加入试剂A、 山东农业大学硕士毕业论文试剂B、试剂C各50此混匀，避光显色10rain，将膜转至去离子水中，终止反应，观察拍照2．2．3PEDVN蛋白间接ELISA方法建立和初步应用的材料与方法2．2．3．1间接ELISA操作步骤(1)包被：将蛋白按照浓度(最佳浓度)用1×碳酸盐缓冲液(pH=9．6)稀释，按100gL／well加入到96孔ELISA酶标板中，4。C孵育过夜，次日使用PBST洗涤液洗涤5次，每次3rain，甩干剩余液体。(2)封闭：每孔加入200gL封闭液，室温条件下孵育2h，用上述涤酶标板的方式同样洗板5次。(3)一抗孵育：按最佳比例先每孔加入一定量待检血清再加入一定量稀释液，混匀后，37℃孵育1h，用上述涤酶标板的方式同样洗板5次。(4)二抗孵育：将商品化的HRP标记的二抗按说明书用稀释液稀释好，将每孔加入100此已经稀释好的二抗，37"C孵育1h，用上述方式同样洗涤酶标板。(5)显色：将新配好的显色液以100肛L／well加入到ELISA板中，37℃避光条件下显色15mill。(6)终止反应并读数：每孔加入50止终止液，轻轻振荡，用酶标仪读取OD450nm值。2．2．3．2间接ELISA方法的优化(1)抗原包被浓度及血清稀度的优化纵排12、6、3、1。5、0．75、o．32Sug／孔的抗原包被浓度包被的96孔ELISA酶标板，4。C包被过夜，用PBST洗板后，加封闭液，封闭2h。洗版。纵排将PEDV阳性血清和阴性血清经大肠杆菌裂解液处理后也分别进行倍比稀释(1：25、1：50、1100、1200、1：400)，各加100pL，按上述ELISA方法步骤操作，利用所读OD450rim值计算P／N值，P／N值最大者所对应的的抗原包被浓度及血清稀释度即为最佳。(2)包被液和包被条件的选择分别用蒸馏水(pH6．5)、碳酸盐缓冲液(0．05moFL，pH9．6)、磷酸盐缓冲液(0．01mol／L，pH7．4)、Tris-HCl(50mmol／L，pH8．O)作为包被液，抗原包被浓度为7．5I_,g／mL，阳性、阴性血清作1：100稀释，按说明书将酶标二抗稀释至11000的浓度，进行ELISA检测，以阳性血清OD450值接近1，P／N值最大时为抗原最适包被液。选取最佳包被液后，分别4。C，12h；4"C，24h,37℃，2h,37"C，4h，以阳性血清OD450值接近1，P／N值最大时为抗原最适包被时间和温度。29 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用(3)抗原抗体最佳作用时间的确定按2．2．3．1所述ELISA方法步骤进行ELISA方法检测，在加入阴阳性血清后，分别在37"C条件下孵育30rain、1h、1．5h、2h，按以上所述方法确定被检血清最佳作用时间。P／N值最大时为最佳工作浓度和作用时间．(4)底物显色时间的确定加入底物(TMB)后，室温避光10、15、20、25rain后，加入H2S04终止反应。(5)临界值的确定用初步建立的间接ELISA方法检测80份背景清晰的PEDV阴性血清，为减小误差，重复两次，当OD450>x+3SD时，判定为阳性。(6)特异性试验在同批次条件下对几种常见猪病病原体阳性血清进行检测，设立阴性对照，每个血清做3个重复，求OD450平均值。(7)重复性试验批内试验：用同一批制备的重组抗原包被ELISA板，取3份阳性血清和1份阴性血清，在同一条件下进行ELISA检测，每份样品平行5个孔，计算每份样品的OD450变异系数(CV)。批间试验：用同一批制备的重组抗原包被ELISA板，取3份阳性血清和1份阴性血清，在5次不同的时间进行ELISA测定，计算每份样品的OD450变异系数(CV)。(8)符合率试验对于间接ELISA检测的样品随机挑取70个样品，包括40个阳性样品和30个阴性样品，进行Westernblot符合率的验证。使用本研究建立的间接ELISA方法和某公司生产的猪流行性腹泻病毒抗体(PEDV)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒对采集161份血清进行检测，比对检测结果。2．2．2．3临床血清的检测(1)免疫猪群抗体的检测：用建立好的间接ELISA方法检测德卅I，济南，潍坊的6个猪场，320份血清，并统计结果。该6个场均免疫猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联灭活苗。(2)未免疫猪群抗体的检测：用建立好的间接ELISA方法检测德州2个未免疫PEDV疫苗的猪场120份血清，并统计分析结果。 ——一山东农业大学硕士毕业论文—————————————————————————————————————二_-=——二—=二=：二_一一．(3)某猪场免疫后疫苗后抗体水平的的监测：对某猪场20头母猪，免疫某PEDV-TGEV二联灭苗后，在7d、14d、21d、28d，进行抗体检测，然后统计分析。 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用3结果与分析3．1PEDV荧光定量PCR方法的建立的结果3．1．1荧光引物的PCR检测。如图3．1，所设计的引物扩充条带单一，并且与预期目标一致。经测序后，序列正确。bpM12200010007505nn250100146bp图3-1PCR电泳结果Fig．3-1TheresultofPCRM，DNAmarker；1-2，thetargetgene3．1．2标准品的制备用紫外分光光度仪器测A260，并且测A260／A280比值(纯净的DNAA260／A280比值应为1．8．2．0)，测得A260为1．34，A280为O．72。A260／A280为1．85，说明所提的质粒浓度较纯，符合试验标准。DNA原液浓度=A260x稀释倍数x50(ng／gL)质粒浓度换算公式(copies／91)=(mol数／gL)水6．02x1023=[质量(g)／分子量】／¨L木6．02×1023=[质量(ng)×10。9／分子量]／¨L木6．02×1023=浓度(ng／uL)×6．02×1014／分子量。本质粒稀释了10倍，所以质粒浓度(copies／gL)为3．95'109(copies／gL)。3．1．3PCR反应条件的优化对荧光定量PCR反应的循环数、退火温度、探针浓度进行摸索，最佳条件见表3．1，3．2。32 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用根据扩增的获得的各梯度的Ct值，利用EXCEL软件，计算并绘制出标准曲线，标准曲线如图3．4。得到的标准方程为Y--2．146X+22．769，各个参数为Slope=-2．146，扩增效率：E=10．1／聋tZ．1=10．1／．2．146．1=192．433％，相关系数：R2=0．994。图3-3根据检测结果计算出的标准曲线Fig．3-3Thestandardcurveestablishedfromtheabove-mentionresult3．1．5灵敏性试验将提取的质粒标准品进行倍比稀释，稀释到10copies／I_tL，用已经建立的荧光PCR方法检测，仍能检测出来。说明此方法灵敏度是普通PCR方法的10,-一100倍。3．1．6特异性试验以CSFV、TGEV、PRRSV和PEDV的阳性病料的核酸和水为模板，应用制定的荧光定量PCR方法进行特异性试验。结果显示只有PEDV阳性病料为阳性(如图3．4)，其他均为阴性，该方法特异性良好。1T∞m'毒∞．∞O'∞Mc1瑚J∞7舅k∞O6∞．∞O2∞MAmplificationPlot一一——一夕7／，／，／，r／夕。∥：2‘e●幢竹Y4霄■∞嚣24l一∞：12，臀X40n_C狮■图3．4特异性检测结果Fig．3-4Specifictestresults34 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用3．2PEDV的N蛋白基因原核表达的结果3．2．1PEDVN基因PCR扩增提取PEDV山东流行株DZl2．3株的病料RNA，采用所设计的PEDVN基因的特异引物进行RT．PCR扩增，扩增产物在1％的琼脂凝胶电泳，得到一条1300bp左右的条带，这与预期的扩增目标一致(1326bp)如图3-5。bp酣1220001OOO7Sn5002501OO132(>bp图3-6PEDVN基因的PCR扩增产物Fig．3-6ProductsofNgenebyPCRM．DL2000Marker；1-2．productsofNgenebyPCR3．2．2重组质粒pET30a．PEDVN的鉴定提取重组质粒pET30a-PEDVN，重组质粒pET-30a-PEDVN经BamHI和XholI双酶切鉴定(见图3．6)。获得5．4kb的载体片段和1．3kb的目的片段，与预期目标一致。酶切成功后送上海生工进行测序，序列正确。kb5．813图3-7重组质粒pET-30a—PEDVN酶切鉴定结果Fig．3-7IdentificationofpET-30a-PEDVNweredigestedbyBamHIandXhoIM．DL5000Marker；1．pET-30a-PEDVN／BamHIandXhoI36岫咖咖咖铷啪瑚摹|瑚瑚岫洲|奏舢姗姗瑚摹|瑚瑚 山东农业大学硕士毕业论文3．2．3重组质粒的初步表达经过鉴定后，将正确的重组质粒转化入E．coliBL21中，挑取单个菌落，接种到含有卡那霉素的2YT培养基中，经37。C摇床中震荡培养。当A600在0．6～1．0时，加入IPTG至终浓度为1．0mmol／L，继续继续震荡培养6h。以空载体菌和未加IPTG的培养物为对照。取lmL培养物，进行SDS．PAGE，如图3．7。图3-8重组体诱导后裂解液SDS．PAGE分析Fig．3-8PurificationofrecombinantproteinM．ProteinMarker；1．ExpressionofNProtein；2．Vectorcontrol；3．BL21control3．2．4诱导表达条件的优化3．2．4．1IPTG浓度的优化图3-9WTG浓度优化Fig．3-9OptimizeoftheIPTGdensityM．ProteinMarker；1．BL21controll；2．Vectorcontrol；3-7．ExpressionofNProteinforIPTGdensityofO．1，O．2，0．4，0．8andlmM／mL在4支各含5mL培养基的试管中接种表达菌，在OD值约为1时加入IPTG至终37h上■3mJ3取"稻钳凹船¨ 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用浓度依次为1mM(即5p．LIPTG溶液)、0．8mM(4“LIPTG溶液)、0．4mM(3IlLIPTG溶液)、0．2mM(2gLIPTG溶液)、0．1mM(1ilLIPTG溶液)37。C200r／min再培养6h，进行SDS．PAGE蛋白质电泳，分析蛋白表达量，结果显示1mM(即5gLIPTG溶液)时，蛋白的表达量最大，如图3-9。3．2．4．2转速的优化在4支各含5mL培养基的试管中接种表达菌，37"C条件下分别用140r／min、160r／min、180r／min、200r／min、220r／min在OD值约为1时加入IPTG终浓度为1mM，再培养6h，进行SDS．PAGE蛋白质电泳，分析蛋白表达量，结果显示，220r／min的转速蛋白表达量最大，如图3．10。图3．10转速的优化Fig．3-10OptimizeoftheinductionspeedM．ProteinMarker；1．BL21controll；2．Vectorcontrol；3-7．ExpressionofNProteinfortheinductionspeedof140，160，180，200and220r，min3．2．4．3温度的优化在4支各含5mL培养基的试管中接种表达菌，温度条件分别为22℃、25℃、28℃、30℃、37℃下，220r／min培养6h，进行SDS．PAGE蛋白质电泳，分析蛋白表达量，结果显示，37℃条件下蛋白表达量最大。3．2．4．4表达时间的优化在100mL的三角瓶中加入30mL的培养基，在OD值约为1时加入IPTG终浓度为1mM，37。C220r／min培养，分别在培养1h、2h、3h、4h、6h各取2mL离心保存， 山东农业大学硕士毕业论文加上样缓冲液煮沸10min进行SDS．PAGE蛋白质电泳，结果显示，6h后，蛋白表达量最高，如图3．11。图3-11表达时间的优化Fig。3-11OptimizeoftheinductiontimeM．ProteinMarker；1．BL21controll；2．Vectorcontrol；3-7．ExpressionofNProteinfortheinductiontimeof1，2，3，4and6h3．2．5蛋白的纯化将大量表达的菌液按上海生工有限公司NiINTASefinoseKITHis标签蛋白纯化试剂盒操作进行目的蛋白纯化，先进行SDS．PAGE，观察蛋白条带单一，大小约为54．6KDa，如图(3．12)，。纯化后的蛋白用生工公司改良的Bradford法试剂盒测定蛋白浓度。经过计算蛋白浓度为1．815mg／mL。MlKDa图3．12纯化蛋白的SDS．PAGE分析Fig．3-12．ProteinMarker；1．purifiedfusionprotein3．2．5Western．blot验证表达蛋白将纯化的蛋白，进行Western．blot，阳性血清处显示在54．6KD处有明显条带，而阴39％上43mJ3虹"繇甜汐舱M 猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用性血清和对照血清(TGE，PRRS，CSFandPRV的阳性血清)均无明显条带(见图3．13)。KDaM123456KDa8058,t6302317图3．13纯化重组蛋白的westernblot分析54．6Fig．3-13PurificationofrecombinantproteinM．Proteinmarker；1．Inducedexpressionprotein；2．Negativeserumcontrol；3-5．ThepositiveserumsofTGE，PRRS，CSFandPRV3．3PEDVN蛋白间接ELISA方法建立和初步应用的结果3．3．1间接ELISA方法的优化3．3．1．1抗原包被浓度及血清稀度的优化表3-4抗原和血清最佳工作浓度的确定(0D450值)Table3-4ELISAfordetectingtheoptimumworkconcentrationofantigenandserum12631．50．751．8091．7881．7321．6551．522O．1770．1320．130．1170．1081．6931．6871．5981．5441．4770．1250．1210．1180．1040．1011．5521．4641．2891．171．0420．119O．1170．114O．1090．0971．3231．2771．1161．1010．859O．1010．0920．0890．0780．0720．8770．7780．6080．54l0．5020．0640．0620．0650．0540．0780．3751．5010．0981．4580．089O．8580．0920．740．068O．3820．067纵排12、6、3、1．5、0．75、0．325u∥孔的抗原包被浓度包被的96孔ELISA酶标板。按ELISA方法步骤操作，纵排将PEDV阳性血清和阴性血清经大肠杆菌裂解液处理后40 山东农业大学硕士毕业论文也分别进行倍比稀释(1：25、1：50、1：100、l：200、1：400)，各加100¨L，利用所读OD450rim值，包被量为750ng／孔，血清稀释100倍时，P／N值最大，如表3-4。3．3．1．2包被液和包被条件的选择分别用蒸馏水(pH6．5)、碳酸盐缓冲液(0．05mol／L，pn9．6)、磷酸盐缓冲液(O．01moUL，pH7．4)、Tds．HCl(50mmol／L，pH8．0)作为包被液进行ELISA检测，结果显示用碳酸盐包被时，阳性血清OD450值接近1，P／N值最大，如表3．5。选取最佳包被液后，分别4"C，12h；4"C，24h：37℃，2h；37℃，4h，结果显示4"C，12h时，阳性血清OD450值接近1，P／N值最大，如表3-6。表3-5包被液的选择Table3-5Optimizationofcoatingbuffer表3石包被条件的选择Table3-6OptimizationofcoatingCondition3．3．1．3抗原抗体最佳作用时间的确定ELISA中加入阴阳性血清后，分别在37"C条件下孵育30rain、1h、1．5h、2h，结果发现孵育1h时，P／N值最大，如表3-7。4l 表3-7血清反应时间Table3-7OptimizationofSerumReactiontimeOD450反应时间阳性血清阴性血清3．3．1．4底物显色时间的确定加入底物(TMB)后，室温避光lO、15、20、25min后，加入H2S04终止反应。结果显示显色15min时P／N值最大，见表3．8。表3遗底物显色时间Table3-8OptimizationofChromogenictime3．3．1．5临界值的确定根据统计学原理，OD450协3S的样品，可以将其判定为阳性。根据80份猪阴性血清的0D450值，计算出80份血清的平均值X=0．33，S=0．045。因此，样品的阴性、阳性的临界值为0．33+3x0．045=0．465。即样品判定标准为，样本OD450ffa．芝o．465时判为阳性；0D450值