骨髓间充质干细胞穿过血脑屏障机制的研究

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1、中国医科大学硕士学位论文骨髓间充质干细胞穿过血脑屏障机制的研究姓名：孙伟申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：陈誉华20070401中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实

2、之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：年日期：。蛰剖中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作

3、者签名：亟竖查指导教师签名：2豸勉日期：趔啦蚪·中文论著摘要·目的骨髓问充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一种存在于骨髓中的非造血干细胞，来自中胚层。它除了能分化为骨细胞，软骨细胞【l】，心肌细胞12J等中胚层细胞，还能跨胚层分化为神经元和星形胶质细胞【3】。它移植入脑可以迁移至受损脑区【4】，通过分化为神经细胞嘲，促进神经前体细胞的分化嘲，分泌细胞因子和神经营养因子【刀等多种机制促进脑损伤后功能的恢复嗍。又因其不表达MSCⅡ类分子[91，且有免疫抑制作用，并能够稳定的

4、表达外源性基因【lo】成为治疗脑卒中等累及中枢神经系统疾病的种子细胞。血脑屏障(blood—brainbarrier,BBB)是一道天然的生理屏障，它将中枢神经系统与其它的系统隔离开。组成血脑屏障的内皮细胞是特化的细胞，它们之间形成紧密连接，成为外周细胞入脑的主要障碍。采用侧脑室或脑实质内定位注射MSCs的方法操作技术要求高，并有引起脑水肿及阻塞脑脊液循环系统等弊病，故其临床应用受限。后来人们发现经尾静脉向脑梗死的大鼠注入MSCs，移植细胞可穿过BBB，且有定向迁移至脑损伤的趋势Il“。但是到目前为止

5、，MSCs穿过血脑屏障的机制，尤其是MSCs穿过脑微血管内皮屏障的机制，还很少有人研究。本研究旨在探索MSCs与脑微血管内皮细胞的相互作用，从而为将来体外调控MSCs高效特异穿过血脑屏障入脑发挥其修复神经损伤作用提供试验依据和理论基础。方法IMSCs的分离培养和鉴定1．1在无菌条件下取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓细胞，体外分离，培养和扩增。1．2免疫细胞化学染色法鉴定MSCs表面标志CD45和CD90的表达情况。2免疫荧光染色检测MSCs作用于}玎3MECs单层引起HBMECs的紧密连接蛋白ZO．1

6、的变化。23Phalloidin染色方法检测MSCs作用于HBMECs单层引起HBMECs的F·actin的变化。4MSCs跨内皮迁移试验4．1MSCs穿过血脑屏障体外模型的建立。4．2利用已建立的模型研究PKC，P13K／Akt,Rho／ROCK信号通路对MSCs穿过HBMECs的能力影响。5PhaUoidin染色方法检测PKC，P13K／Akt,Rho／ROCK信号通路对MSCs的F．actin的影响。6细胞黏附试验检测Rho／ROCK通路对MSCs黏附与HBMECs能力的影响。7利用Transw

7、dl检测Rho／ROCK通路对MSCs迁移的影响。8WesternBlo岫【19法检测MSCs与HBMECs作用后引起HBMECs紧密连接蛋白Occludin的变化。9统计学分析结果l大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定1．1分离纯化后的MSCs程梭形，在培养皿中呈现规律的漩涡状排列1．2免疫细胞化学检测结果显示，所分离细胞为CD90阳性，CD45阴性，符合MSCs特征2MSCs作用于HBMECs单层于15分钟即可黏附于HBMECs，并逐渐伸出片足和较长的伪足；MSCs能够引起HBMECs的紧密连接的

8、开放；MSCs能够引起HBMECs细胞骨架蛋白F．actin随着作用时间的延长的解聚建立MSC穿过脑微血管内皮细胞单层的模型，并利用该模型发现了抑制MSCs的Rho／ROCK通路能够促进MSCs穿过HBMECs单层。4抑制MSCs的Rho／ROCK通路能够引起其细胞形态学的改变以及F-actin的解聚。5抑制MSCs的Rho／ROCK通路不影响MSCs与HBMECs的黏附。6抑制MSCs的Rho／ROCK通路能够促进MSCs的迁移。7抑制MSCs的Rho