鸭瘟病毒us10基因克隆、表达及抗体制备

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1、万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导9币指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：赫铋矽fy年6月7y日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交

2、论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。口本论文不保密。(请在以上口内划“4”)研究生签名：莉滚银导师签名：证嵛太。本论文保密，在一年解密后适用本授权。知Ⅳ年铆f肾；月／2日6旯}泌万方数据四川农业大学硕士论文中文摘凄㈣嘲舢舢啪啪㈥I—J0121268本论文对鸭瘟病毒(Duckplaguevirus，DPV)CHv株USIO基因(Gerd3ank登录号：EUl950

3、84)进行了分子特性分析、原核表达、多克隆抗体制备、亚细胞定位、转录时相分析，主要研究结果如下：1DPVUSIO基因的分子特性分析DPVUSl0基因片段全长969bp，可编码322个氨基酸。蛋白质保守结构域分析表明该蛋白与Gene66家族的基因66(Ⅱb)蛋白有相同的保守结构域。亚细胞定位分析表明该蛋白主要定位于细胞质中。翻译后修饰分析表明该蛋白具有5对二硫键和35个可能的磷酸化位点。该蛋白不含有信号肽和跨膜区。氨基酸系绩I进化树分析表明USl0蛋白与马立克病毒属亲缘关系最近。USl0基因密码子偏爱

4、陛较均一，且不含有2个以上连续稀有密码子串。2DPVUS10基因原核表达及其多克隆抗体制备根据CHv株USl0基因的核苷酸序列，运用On907．0软件设计了一对引物对全基因进行PCR扩增，扩增片段大小为988bp，将PCR产物送大连TaKaRa公司进行T克隆，成功构建了克隆质粒pMDl8．T／USl0，之后通过酶切、连接等步骤构建了表达质粒pET32a(+)／USl0，将此表达质粒转化入表达菌BL21进行重组蛋白诱导表达，结果发现表达产物主要以包涵体形式存在。表达蛋白的鉴定采用Westernblot

5、方法，以兔抗DPV血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，证明了表达蛋白确与兔抗DPV血清具有反应原性0通过镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化，免疫兔子制备多克隆抗体，琼脂扩散试验测定效价达到1：8。3DPV体外感染DEF后USl0蛋白的亚细胞定位分析间接免疫荧光法检测DPVUSl0蛋白在DEF细胞中的分布定位，结果表明USIO蛋白主要定位于细胞质中，且在病毒感染后12h检测到特异性绿色荧光，荧光强度在一定范围内随着时间的推移先增强后减弱。4DPV体外感染DEF后USl0基因的转录时相分析采用S

6、YBRGreenI荧光定量PCR法实时检测DPV体外感染宿主细胞DEF后不同时间点USl0基因RNA转录情况，结果表明RNA在感染后8h可被检测到，72h达到高峰，之后转录量开始下降。药物抑制实验表明当加入工作浓度的更昔洛韦和放线菌酮后，USl0基因的转录受到明显的抑制，证夥}甘StO基因具备晚期基因特征。关键词：USIO基因；原核表达；多抗制备；亚细胞定位；转录时相万方数据四川农业大学硕士论文ABSTRACTCloning，expressionandpolyclonalantibodyprepar

7、ationofDPVUSIOgene·L甜Maoyin(PreventiveVeterinaryMedicine)DirectedbyProf．WANGMJngshuandProf．CHENGAnchunThroughtheoreticalresearchandscientificexperiments，westudiedonmolecularpropertiesanalysis，prokaryoticexpression,polyclonalantibodypreparation,intracel

8、lularlocalization,wanseriptiondynamicanalysisofDPVUS10gene(GenBankaccessionnumber：EU195084)．Themainresultsareasfollows：1．MolecularanalysisofDPVUSIOgeneanditsencodingproteinThewholegenelengthoftheduckplaguevirusstrainCHvUS10genewas969bp，