鸭瘟里默氏杆菌hsp15基因克隆、表达及抗体制备

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1、万方数据ClassificationNumber：$858．32StudentNumber：$2013146SichuanAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationCloning，ExpressionandAntibodyPreparationofRimerellaAnatipestiferhspl5geneByDengPeiyunDirectedbyProf．WangMingshuPreventiveVeterinaryMedicineSichuan，Ya’an，ChinaMay，2014万方数据论

2、文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：又P讫欲加够年否月／z,El关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、

3、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。酥论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“√”)研究生签名：即耀云导9币签名：ⅥL节丸南幽7够年国f十年善只f2B6具淤万方数据中文摘要鸭疫里默氏杆菌病是鸭、鹅和多种其它禽类的一种接触传染性疾病，该病的发病率和死亡率较高，已成为目前危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一。目前，国内鸭疫里默氏杆菌病流行的血清型以1型鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestife，．，RA)出现频率最高，本研究在

4、测定血清】型RA全基因组序列基础上，通过生物信息学分析获得RA小热休克蛋白基因hspl5，采用pET-32a(+)原核表达载体对该基因进行表达和鉴定，并制备HSPl5重组蛋白多克隆抗体，为该病的进一步深入研究奠定基础。首先，通过对血清1型RA全基因组序列进行初步分析，确定RAhspl5基因完整开放阅读框；其次，通过HSPl5蛋白序列搜索比对、理化特性、亚细胞定位、跨膜区、疏水性、抗原性进行分析。结果表明：RAhspl5基因大小为435bp，密码子有效数(effectivenumberofcodons，Nc)为43．806，RAhspl5基因含有一个连

5、续的2个稀有密码子串；编码蛋白由144个氨基酸组成，该蛋白分子质量为16．77kDa，理论等电点pI为7．15，HSPl5蛋白无信号肽，无跨膜区；疏水性分析表明整个蛋白质疏水性最大值是1．0，最小值是．3．4，45．52、69．77位氨基酸蛋白质疏水性最强；蛋白质抗原表位分析表明该蛋白抗原表位主要集中在18，23．25，28—29，33．42，66，80．84，98．114，119—144位氨基酸；位点预测显示有2个蛋白激酶C磷酸化位点，有4个酪蛋白激酶II磷酸化位点。为了对RAHSPl5蛋白进行深入研究，采用PCR扩增获得RAhspl5基因序列，克

6、隆到T载体，经鉴定后，再双酶切亚克隆到原核表达载体pET-32a，成功构建重组原核表达质粒(pET-32a／hspl5)。将表达质粒转化到大肠杆菌BL21菌株；IPTG诱导进行表达，经SDS．PAGE分析表明重组蛋白分子量为37kDa，与预期蛋白大小相符。对重组表达蛋白进行可溶性和不可溶性分析结果表明表达产物为不可溶性蛋白。同时，对诱导温度、诱导时间及IPTG浓度进行了优化，确定最佳表达条件为0．4mmol／LIPTG，37℃诱导6h。用兔抗RA阳性血清进行免疫印迹检测，结果表明该重组表达蛋白具有较好的免疫原性。对重组表达蛋白进行纯化得到高纯度的重组

7、蛋白，以此为抗原与等量的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混合乳化后免疫家兔制各多克隆抗体，琼脂糖扩散试验表明其效价为l：8。关键词：鸭疫里默氏杆菌；hspl5基因；抗体制备；原核表达万方数据AbstractRJemerellaanatipestiferisacontagiousdisease，ithasahighmorbidityandmortalityinduck，goose，andvariousotherbirdsandithasbecomethemostseriousinfectiousdiseaseofduckindustryoverthewor

8、ld．Atpresent，Riemerellaanatipestifertype1(RA)ispopular