体外培养原代皮质神经元糖氧剥夺复糖复氧模型筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂的研究

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1、南方医科大学201I级博士学位论文体外培养原代皮质神经元糖氧剥夺／复糖复氧模型筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂的研究ScreeningSynergisticNeuroprotectiveAge．swithHypothermiaonPrimaryCerebrocorticalNeuronsExposedtoOxygenGlucoseDeprivationandReoxygenation课题来源：国家自然科学基金(81271521)广东省科技计划(2012A030400011)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层。次所在学院答

2、辩委员会主席答辩委员会委员高筱雅潘速跃神经病学全日制博士研究生第一临床学院陆正奇教授张为西教授李中教授高庆春教授周亮副教授2014年5月1日广州博士学位论文体外培养原代皮质神经元糖氧剥夺／复糖复氧模型筛选与亚低温有联合作用的神经保护剂博士研究生：高筱雅指导教师：潘速跃摘要研究背景中国脑血管病年均发病率为193．779／10万，死亡率81．441／10万不等，已经成为中国第一位的死因和致残原因。缺血性脑血管病——脑梗死占脑血管病的大多数，其中大面积脑梗死的死亡率可高达80％，且绝大部分导致严重残疾。脑血管病的高发病率、高致死率、高

3、致残率，给社会和家庭带来沉重的负担。如何降低大面积脑梗死的致残率和致死率是目前研究的热点和难点。脑缺血后神经细胞的损害是一系列缺血级联效应的后果，包括线粒体功能紊乱、细胞内钙超载、高钠和低K十、ROS和NO生成增加、兴奋性氨基酸毒性、炎性因子及粘附分子释放增加、微血管阻塞、血脑屏障破坏、Caspase蛋白家族的级联激活等。在梗死后几分钟到几天，不同的病理过程在时间上互相重叠并起到推波助澜的作用。脑梗死病变区按缺血的程度可分为缺血核心区和缺血半暗带区。核心区内细胞因完全缺血、过度激活的兴奋性神经递质／受体的毒性等致使细胞在几分钟内

4、死亡。缺血半暗带区的细胞因缺血后周边侧枝循环的再灌注，还有存活的可能。由于再灌注时间窗只有4．5h，许多患者就诊时核心区的细胞己不可逆死亡，因此靶向干预缺血半暗带区是目前实验研究和临床治疗的主要目标。在脑保护治疗中，治疗性低温是目前被临床证明有效的脑保护措施之一。中文摘要亚低温通常指28～35℃，而临床广泛应用的是33．34℃。亚低温在颅脑外伤、心肺复苏后缺血缺氧性脑病和新生儿窒息的治疗中都取得了卓著的成绩。但是，亚低温在脑梗死治疗方面的应用近年才刚刚起步，实验室及临床的证据尚不充足。我们前期的研究表明，亚低温可以缩小MCAO大

5、鼠的梗死灶面积，但是神经功能评分并没有随之改善，因此需要进一步采取措施提高疗效。此外，亚低温治疗也有许多副作用，如寒战，过度镇静抑制呼吸功能，以及长时间亚低温使肺部感染、下肢深静脉血栓等并发症发生率增加等等。因此，有必要联合应用有协同作用的药物，以进一步改善亚低温治疗的效果，改善脑梗死的预后。目前有报道在体外或体内实验中具有神经保护作用的药物很多，从其作用机制来看，包括谷氨酸受体阻滞剂、^r．氨基丁酸受体激动剂、钙离子拮抗剂、自由基清除剂、抗生素和免疫抑制剂、生长因子类、5．羟色胺受体激动剂、膜成分及其稳定剂、脑代谢剂、神经肽类

6、、抗糖尿病药物、激素类、中成药及各种新药等。但是，这些药物在临床转化方面均遇到了障碍。究其原因，除了动物实验设计缺陷、种族差异、药物疗效不够显著、临床应用时机大多晚于实验研究、副作用过大等之外，还因为脑梗死后的损害涉及到多个相互关联、互相重叠的病理机制，而一种药物仅仅作用于缺血级联的一个或某几个环节，作用靶点过于单一，不能对缺血级联产生有效应的结果。基于脑梗死病理机制的复杂性和多样性，联用多种有协同作用的药物或治疗方法有可能取得突破性的效果，如联合非药物性神经保护手段——治疗性低温。在亚低温与神经保护剂联合应用方面国内外均有所涉

7、猎。国内外和我们前期的研究都证实，某些药物如硫酸镁、脑源性神经生长因子等，在与亚低温联用治疗实验动物脑梗死时表现出协同效应。但是，目前国内外尚未有研究对现有的神经保护剂与亚低温联用的疗效进行过系统的筛选。我们根据神经保护剂的作用机制、可获得性、毒性、易用性等特点选取了26种神经保护剂纳入研究。与动物模型和人体实验相比，体外糖氧剥夺／复糖复氧(OGD／R)模型可在体外模拟不同程度的缺血／再灌注状态，实验条件更一Ⅱ博士学位论文致，并能进行高通量的单药或复合药物筛选，耗时耗资少，具有动物模型及人体实验不可比拟的优越性：而神经元细胞是脑

8、组织中的主要细胞，其预后决定了脑组织的总体预后，因此我们首先建立了原代皮质神经元的重度OGD／R模型，然后利用这一模型对26个神经保护剂与亚低温的联合作用进行了筛选。我们选取了细胞活力和凋亡率作为药物筛选的两个主要指标，前者反映活细胞数目的多少，后者反映细胞受损