间断多次低温对糖氧剥夺神经元的保护作用

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1、南方医科大学2010级博士学位论文间断多次低温对糖氧剥夺神经元的保护作用Theneuroprotectivemechanismsoftheintermittenthypothermiaonoxygen·glucosedeprivatedneurons课题来源：国家自然科学基金(81271521)广东省自然科学基金(10151051501000053)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院徐隋意潘速跃教授神经病学学术型博士南方医院2013年4月25日广州博士学位论文间断多次低温对糖氧剥夺神经元的保护作用博士研究生：徐隋意指导教师：潘速跃教授摘要神经保护剂的

2、动物实验和人类临床试验结果差异较大。很多神经保护剂在各种动物缺血性模型中被证明有效，但是没有一个在人类III期临床试验有作用。通过回顾性分析人类神经保护剂的随机对照试验(RCT)探讨神经保护剂临床转化失败的原因，我们发现很多因素与之相关：模型选择，麻醉剂选择，生理学指标监测，造模成功标准，栓子性质，再灌注损伤，梗死面积，治疗时间窗，药物渗透性，血药浓度，性别差异，结果评估等。而入院前“家庭药物”超早期治疗和多靶点治疗或许是未来考虑的方向。低温可以通过多靶点抑制缺血后损伤通路发挥神经保护作用。颈动脉内冰盐水灌注(ICSI)是最快速的低温诱导方式。我们在前期工作中发现，

3、在大鼠缺血性卒中模型中低温的治疗时间窗比血管冲洗的作用时间宽。然而持续大量的ICSI来维持局部脑低温会导致病人一些列的副作用。因此我们考虑将这种特殊的治疗方法应用于未来临床时，我们意识到，为了在治疗效果和减少持续ICSI大容量盐水灌注的副作用方面权衡利弊，我们将其改良为间断ICSI。我们近期研究发现，与持续ICSI相比，间断策略可以维持更长时间的低温，对血细胞比容影响更小，可能为一种更有潜力的神经保护手段。虽然前期研究显示间断多次低温对大鼠大脑中动脉梗死(MCAO)模型有治疗效果。间断低温的神经保护机制仍不清楚。因此本实验利用胎鼠皮层神经中文摘要元糖氧剥夺模型来体外

4、模拟缺血性卒中，利用细胞模型高通量的特点比较不同低温模式对神经损害机制的影响，探讨间断多次低温可能的神经保护靶点。为筛选最优的间断低温模式以及未来临床应用提供理论依据。第一章皮层神经元原代培养胎鼠皮层神经元原代培养可以制作多种神经疾病的体外细胞模型。但是胎鼠脑体积较小，解剖难度相对较大，皮层神经元急性分离和培养操作环节复杂，至今尚未有统一的操作路径。因此探讨一种简便，合理，可重复性好的操作方法对于研究细胞模型至关重要。首先脱颈处死SPF级E18SD孕鼠，取出子宫和胎鼠。为了减少神经元代谢，保证其活力，接下来的解剖过程在碎冰上进行。我们将传统的断头后分离解剖顶端皮层改

5、良为经鼻入路双侧对称分离法进行解剖，缩短了胎鼠皮层的解剖时间。然后用体视镜显微剥离皮层脑膜和血管，以减少脑膜细胞和血管细胞等混杂细胞对神经元纯度的干扰。由于这个过程时间较长，显微解剖在含有10％胎牛血清(FBS)和谷氨酰胺的HG．DMEM培养液的培养皿中进行以确保解剖过程中神经元的能量代谢。将剥离干净的胎鼠脑皮层置入含有冰HG．DMEM(不含FBS)的一次性3．5cm灭菌培养皿中，用灭菌的显微解剖剪剪碎至约lmm。考虑到传统的胰酶消化速度不好控制，我们用木瓜酶结合DNA酶I序贯消化。终止消化后，经过巴氏管吹打和细胞筛过滤得到神经元的单细胞悬液，用0．2％锥虫蓝染色以

6、确保细胞团块要少于10％，死细胞数量小于1％。用0．Img／ml左旋多聚赖氨酸预包被过的培养瓶以50000／cm2的密度接种神经元，4d,时后发现大部分细胞已经贴壁。用neurobasal+B27+谷氨酰胺+青链双抗的培养液换液后继续培养。原代培养的神经元通过DAPI染核，B．3．TUBULIN骨架蛋白免疫荧光鉴定。神经元纯度通过阳性细胞计数和流式细胞仪测量均提示大于95％，可以满足进一步实验需要。第二章糖氧剥夺模型制作及低温干预方案缺血性卒中发生时，血液供应减少导致病灶区营养和氧气相应剥夺。这是形成“核心”梗死灶和缺血半暗带的重要原因。而这一过程可以用体外细胞卒I

7、I博士学位论文中模型来进行模拟。核心梗死灶中已经死亡的神经元没有研究价值，而位于缺血半暗带的神经元是我们体外卒中模型研究的重点。越接近核心梗死灶，糖氧剥夺程度越重，而缺血半暗带区糖氧剥夺程度相对较轻。因此我们可以通过精确控制神经元培养液中的“糖”等营养成分来模拟糖剥夺。也可以通过厌氧培养箱来控制神经元培养环境中的“氧”浓度来模拟氧剥夺。相应的，如果缺血性卒中后期，责任血管发生再通或者是侧支循环建立恢复供血，又会面临着缺血再灌注损伤。而在体外细胞模型我们可以通过重新恢复神经元培养液和氧供给来研究这一重要的病理生理过程。本实验在神经元糖氧剥夺模型的基础上实施间断多次