实时荧光pcr技术检测乙型肝炎病毒ymdd变异与乙型肝炎病毒基因型方法的建立及应用

《实时荧光pcr技术检测乙型肝炎病毒ymdd变异与乙型肝炎病毒基因型方法的建立及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、安徽医科大学硕士学位论文前言拉米夫定(Lamivudine，LAM)是目前公认的最有效而安全的抗病毒的核苷类似药物，但长期使用可诱发HBV病毒变异，引起病毒耐药。酪氨酸．甲硫氨酸-天冬氨酸．天冬氨酸(YMDD)功能区变异是HBV拉米夫定耐药的主要原因。YMDD变异的产生机制认为拉米夫定与其他核苷类似药一样在体内必须经细胞内激酶作用，生成磷酸化的LAM才具有活性，三磷酸拉米夫定与脱氧胞嘧啶竞争性的与病毒DNA多聚酶结合，因三磷酸LAM的3’．末端的C原子被S原子取代，而3'-OH是病毒复制过程中DNA链延长的必须，因此3'-OH的丢失导致DNA链合成的终止，从而抑制病毒DNA的

2、成熟。YMDD是HBVDNAP基因C区内的高度保守序列，也是LAM治疗HBV的作用靶点，随着LAM疗程的延长，HBVDNA发生了变异，这种变异多发生在HBVP基因区逆转录酶活性最强部位，即高度保守区的YM204DD模序，其中的M204被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)取代(M204V／M204I，曾称为M552V／M552I)，变为YVDD或YIDD。此外，YMDD变异还与LAM的疗程有关，YMDD变异可发生在LAM连续治疗6个月后，并且随着治疗时间的延长，变异的发生率也逐渐升高【ll，在治疗1年、2年、3年、4年、5年后，YMDD的发生率从一年的16．32％分别上升到38％、5

3、3％、66％和69％[2"41：因此，在LAM的治疗过程中，应定期监测YMDD的变异。目前用于YMDD的检测方法有lPCR测序分析【51根据HBV病毒基因组保守序列设计引物，扩增包括YMDD基序的片段，产物直接进行测序或克隆入载体再进行测序，2PCR．RFLP(限制性片断长度多态性分析)Lai等【6】利用PCR．RFLP检测335例用拉米夫定治疗一年后的乙肝患者，检出YMDD突变为24％。Sunl71设计3对HBVP基因引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增，应用NdeI和NlaHI两种限制性内切酶对PCR产物进行酶切，酶切产物用电泳加以分析。应用此方法检测70例拉米夫定治疗的慢

4、性乙肝患者中3种拉米夫定耐药突变的发生情况。NdeI和NlaIII两种限制性内切酶对PCR产物进行酶切可有效区分HBV野株和YMDD变异株，并确定是YIDD或YVDD变异。3肽核酸(PNA)分析·’。安徽医科大学硕士学位论文Kirishima等18]学者用PNA介导PCR结合RFLP方法检测YMDD突变，比常规方法提前了6个月，因此该方法可以真正实现有效动态监测LAM治疗情况，甚至在LAM治疗前检查其有无突变体的存在。4基因芯片Heo等19J对40例未经拉米夫定治疗的患者进行检测其中3例发生YMDD和YIDD的混合变异，5基质辅助激光解吸离子飞行质谱(MALDI—ToFMS)

5、也被称作限制性片断质量多态性(RFMP)，Hong等[10l用该法对40例接受拉米夫定治疗患者进行检测，能检测出102copies／ml变异株。6连接酶检测反应(1igasedetectionreaction，LDR)XIAO掣11】用该方法分别对质粒和临床血清标本进行检测，从大量的HBV野生株病毒背景中检测少量的YIDD变异株，其结果分别为从108copies／mlYMDD和YIDD的混合质粒检测出102copies／mlYIDD变异株，从107copies／ml的血清标本检测到103copies／ml的YIDD变异株，并将该方法与测序和微点阵的方法相比较，证实该方法有更好

6、的敏感性。7反向斑点杂交(ReverseDotBlot)和线性探针反向杂交法(INNO．LiPA)Ou等【121用反向斑点杂交方法检测了100例标本，其结果和测序法结果的符合率为100％。同时应用该法可同时对不同的突变类型设计探箩针，有利于混和突变的检测。Stuyver等113】用线性探针法将含盖三个编码区(L528M。M552V／I，V／L／M5551，)38探针固定在膜条上，在膜条上形成19条探针线，用此方法检测两患者的治疗前，治疗中，和病毒数反弹时血清样品中的HBV聚合酶区的耐药基序，证明该方法可为临床乙肝病人的拉米夫定的耐药情况提供资料。8分子信标(molecular

7、beacons)Pas等【14l应用分子信标的方法回顾性的分析了一队亚洲孪生姐妹的在治疗九周前和拉米夫定治疗两周期的YMDD变异情况，并和RFLP，InnoLipaHBV．DRassay和直接测序分析相比较，该方法能够用于YMDD变异株和野生株的检测，但其他方法在YMDD的早期诊断更具优势。9通用模板的实时荧光定量PCR(universaltemplateprobe)Wang_等t15l用此方法检测了163例接受拉米夫定治疗的病人血清，其中5l例发生YMDD变异，检测下限为1000copies／ml质粒