优化设计的内切葡聚糖酶基因ends在毕赤巴斯德酵母中的表达研究

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1、SichuanAgriculturalUniversityDISSERTATIoNSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementforMASTERDEGREEExpressionofOptimizedDesignedEndogIucanaseEndsJ^●●■●beneinptctttapastortsByJun．HuaLiaoDirectedbyProf．ChenHuiYa’anichuanMay2010论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢

2、的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。⋯轹旁铲州喇日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。⋯名：旁吁洳砒淋日新虢荫易泐年易月力胡摘要纤维素酶是一种

3、复合酶，根据各酶功能不同，可分为三类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和B．葡萄糖苷酶。纤维素酶是糖苷水解酶的一种，它可以将纤维素物质水解成单糖，进而发酵产生乙醇，从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。此外，纤维素酶在纺织、食品、饲料和制药行业等领域均具有广泛的应用。纤维素酶在实际应用中取得的成效与预期的目标相距甚远，主要是因为纤维素酶活性不高，因此提高纤维素酶的产量，降低生产成本成为当务之急。随着对纤维素酶研究的不断深入，生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展，获得适合工业化生产的高比活力的纤维素酶已指日可待。为提高纤维素酶的产量，本论文根据毕赤酵母的偏爱

4、密码子，在不改变内切葡聚糖酶氨基酸序列的前提下，利用分子生物学软件DNAstars、Rensselaer．WadsworthBioinformaticsCenter(BiC)(www．bioinfo．rpi．edu)生物学信息中心在线RNA折叠软件Mfold程序对内切葡聚糖酶基因的碱基含量、mRNA自由能△G、二级结构等生物学信息进行分析，将低频密码子替换为高频密码子，获得优化设计的基因。本课题组从成功克隆的枯草芽孢杆菌C．36内切葡聚糖酶基因End(Genbank登录号：DQ782954)出发，对去掉信号肽的砌德因进行生物学分析。分析表明该基因全长1413bp，编码470

5、个氨基酸成熟肽。其中(G+C)％含量为44．70％，密码子第三位(G+C)％碱基含量为44．40％；加上巴斯德毕赤酵母0【因子信号肽后(G+C)％为44．00％，密码子第三位(G+Cm碱基含量为42．00％。对勘湛因mRNA分析表明，折叠后最小自由能△G一555．40kcal／mol。根据巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性，去除内切葡聚糖酶基因中酵母表达低频密码子，替换为高频密码子，获得能在毕赤酵母中高效表达的内切葡聚糖酶优化基因砌幽，长度为1413bp。改造后基因Ends与End的同源率为87．90％，(G+C)％为45．00％，密码子第三位(G+C)％碱基含量为50．50％。加

6、上巴斯德毕赤酵母仅因子信号肽后(G+C)％为44．30％，密码子第三位(G+C)％碱基含量为47．10％。对E聆凼基因mRNA分析表明，折叠后最小自由能△G一548．90kcal／mol。优化设计的End基因克隆及测序后，构建了优化内切葡聚糖酶的表达载体pPIC9K-Ends，获得含重组质粒pPIC9K．Ends的大肠杆菌DH5a。用含氨苄青霉素的液体培养基过夜培养阳性大肠杆菌DH5a，收集菌体，提取并纯化回收质粒pPIC9K．砌凼。质粒pPlC9K-Ends经SalI线性化后，电转化酵母GS15，经MM和MD平板筛选后，同时采用酵母总DNA的PCR鉴定和酶活测定的方法，筛

7、选出阳性转化子，实现Ends基因在酵母中的分泌表达。工程菌pPIC9k-Ends．19在优化培养后，酶活达1034．7U，比未改造的阳性菌株(EpastorisGSll5pPIC．End)提高了1．2倍，经G418抗性筛选，确定pPlC9k．Ends．19为单拷贝转化子。SDS．PAGE分析显示Ends基因与勘磋因产物的分子量都为79．82KD。经研究表明，优化后的基因勘凼与未优化的基因雠毕赤巴斯德酵母中表达产物酶学性质一致。关键词：内切葡聚糖酶毕赤酵母优化设计基因表达酶活力ⅡAbstractCellulasein