基于定向核酸酶技术的马铃薯基因组编辑体系的建立及应用

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1、电子科技大学UNIVERSITYOFELECTRONICSCIENCEANDTECHNOLOGYOFCHINA硕士学位论文MASTERTHESIS（电子科技大学图标）论文题目基于定向核酸酶技术的马铃薯基因组编辑体系的建立及应用学科专业生物化学与分子生物学学号201121090117作者姓名郭家会指导教师张勇副教授分类号密级注1UDC学位论文基于定向核酸酶技术的马铃薯基因组编辑体系的建立及应用（题名和副题名）郭家会（作者姓名）指导教师张勇副教授电子科技大学成都（姓名、职称、单位名称）申请学位级别硕士专业学位类别生物化学与分子生物学提交论文日期2014.04论文答辩日期2014.05.

2、27学位授予单位和日期电子科技大学2014年06月29日答辩委员会主席评阅人注1：注明《国际十进分类法UDC》的类号。ESTABLISHMENTOFTALENFORPOTATOTARGETEDGENOMEMUTATIONANDITSAPPLICATIONINSTARCHMODIFICATIONAMasterThesisSubmittedtoUniversityofElectronicScienceandTechnologyofChinaMajor:BiochemistryandmolecularbiologyAuthor:GuoJiahuiAdvisor:ZhangYongScho

3、ol:Schooloflifescienceandtechnology独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得电子科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。作者签名：日期：年月日论文使用授权本学位论文作者完全了解电子科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权电子科技大学可

4、以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后应遵守此规定）作者签名：导师签名：日期：年月日摘要摘要马铃薯（Solanumtuberosum）是四大粮食作物之一，同时又是植物分子遗传学研究的重要模式植物之一。马铃薯淀粉在造纸业、食品加工、胶黏剂生产以及饲料加工等工业上应用独具优势，是一种重要的工业淀粉原材料。淀粉因为其结构差异分为直链淀粉（amylase）和支链淀粉(amylopectin)2种，两者的含量比例是淀粉粒结构和特性的决定因素，影响着淀粉的质量、功能和应用领域。马铃薯淀粉体中的淀粉合成代

5、谢途径涉及多种酶的参与，其中GBSS(granuleboundstarchsynthase)，SS(starchsynthase)和SBE(starchbranchingenzyme)是马铃薯淀粉合成的关键酶。关键酶的活性对马铃薯直链淀粉与支链淀粉比例、淀粉链长及结构有极大的影响。至今针对马铃薯GBSS、SS和SBE基因进行的性状改良已经取得了一定的进展，通过翻译表达技术和RNAi技术已经成功获得低直链淀粉、高支链淀粉的马铃薯新材料。但由于RNAi技术本身的局限性，目标基因突变体材料普遍存在稳定性差、目标基因转录活性难以实现完全“敲除”（knockout）、RNAi表达单元需永久整

6、合等问题，实际研究及应用中迫切需要一种能特异性针对目标基因彻底实现去功能化，并能获得稳定的马铃薯种质新材料的新方法，以更好满足马铃薯基础及应用研究的需要。近年来，以ZFN(zincfingernuclease)和TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)为代表的基因定向遗传修饰新技术成为基因组工程研究及应用领域最具潜力的新工具。本研究以TALEN技术体系在马铃薯中的建立为出发点，针对马铃薯基因组结构特性和TALEN组装原理，建立了高效率，高活性，高特异性，高稳定性的的马铃薯TALEN技术体系，优化了马铃薯复杂基因组TALEN

7、设计，构建，表达，检测和筛选的最佳方案。在此基础上，针对马铃薯淀粉合成的关键酶，特别是直链淀粉合成酶，如GBSS，构建了特异性TALEN表达载体，通过烟草原生质体筛选出了瞬时高效表达载体，并进行马铃薯的遗传转化以期筛选出定向突变株系，实现目标基因在马铃薯基因组中的定向敲除，为研究马铃薯淀粉合成等相关机理提供理论依据及实验证据。关键词：马铃薯，淀粉，基因组定向修饰，GBSS，TALENIABSTRACTABSTRACTPotatoisoneofthefourmajorf