prrsv+gp5基因亚克隆、原核表达及elisa抗体检测方法建立论文

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河北农业大学硕士学位论文PRRSVGP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立姓名：李建辉申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：范京惠20120606 摘要lIIIlIIIIIlUlIIItMIIIIIIIIqIltlIlIll}Y2143117猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus。PRRSV)引起的～种高度接触性传染病，该病可导致母猪的繁殖障碍以及仔猪严重的呼吸道疾病和高死亡率。建立快捷的诊断方法，采取相应的控制措施，是预防该病的有效手段之一。本研究以dGP5重组蛋自为包被抗原，建立一种快速简便的血清学方法。根据GenBank中已发表的PRRSVGP5全基因序列，设计合成了一对特异性引物，从六份疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的瘸猪肺脏中，扩增GP5蛋自完整的基因片段，将其克隆至pMDl8．T载体进行测序、PCR及酶切鉴定。鉴定结果表明，GP5基因片段大小为600bp，且与其它毒株的同源性为99％。GP5蛋白在表达系统中难以表达，所以本研究去掉了氨基端疏水性较强信号肽序列。根据pMDl8．T克隆载体以及pGEX一6p。1表达载体的特点，用Primer5．0软件设计另一对特异性引物，从重组载体pMDl8一T-GP5中扩增出缺失了N端30个氮基酸残基的dGP5的编码序列dORF5，克隆至原核表达载体pGEX．6p—l，构建原核重组质粒pGEX-6p．dGP5，转化至E．coliBL21感受态细胞中。经lmmol／LIPTG诱导后，SDS．PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的蛋白，与预期的融合蛋白分子量基本一致，以包含体形式表达。又经Western-blotting鉴定，该蛋崮与猪的PRRSV阳性血清具有良好的反应原性。可见，分子质量40l(u的摄自即为目的蛋白。将纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，制备血清。虽然病毒中和试验显示该抗体并没有中和活性，该血清却能够与重组蛋酝产生特异性反应。利用纯化的融合蛋白作为包被抗原，通过优化工作条件，建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法，该方法的最适反应条件为，抗原最佳包被浓度为1．251-tg／mL，封闭液为含5％犊牛血清的PBST，封闭时间是37℃封闭2h，4℃过夜。血清最佳稀释度为1：80，待检皿清37℃作用1h，酶标抗体1：400稀释，37℃作用1h，底物显色15min终止反应。与IDEXX公司ELISA试剂盒相比，特异性为87．0％，敏感性为90。3％，符合率88％。丽且该方法还具有价格低廉、简便、快速等优势。该方法与PEDV、CSFV、PRV、TGEV阳性血清不发生交叉反应。批内和批间重复性试验结果显示，变异系数均值都小于10％，表明本方法具有较好的特异性和重复性。本研究为免疫猪群的PRRSV抗体检测及其流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。关键词：PRRSV；GP5基因；克隆；原核表达；融合强自 ProkaryoticExpression，SubcloningofGP5GeneofPRRSVandAnIndirectELISAfortheDetectionofViralAntibodieswiththeExpressionProduceAuthor：LiJianhuiSupervisor：Prof．FanJinghuiMajor：PreventiveVeterinaryMedicineAbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)isahighlycontagiousandinfectionsdisease，andhascausedthereproductivefailureinSOWS，seriousrespiratoryillnessinthenursery-agepigsandhiglamortalityrates．Toacertainextent，itcouldpreventthisdieasetoestablishquickdiagnosticmethodandtakeappropriatecontrolmeasures。AnindirectELISAassaywasconstructedwithfusionproteinascoatingantigen．Inthisstudy,apairofspecificprimerWaSdesignedandsynthesizedaccordingtothesequenceofGP5proteincompletegeneofPRRSVpublishedinGenBank．ThenafragmentofGP5genewasamplifiedfromRNAofthelungmaterialsofsixswines．ThespecificGP5geneobtainedbyRT-PCRwasclonedintopMD18一Tvector．AndthentherecombinantplasmidwastransformedintocompetentcellsofEscherichiacoliDH5a．TherecombinantplasmidwasindentifiedbyPCRandrestrictionendonucleaseanalysis．TheresultsshowedthatthegenefragmentofGP5atlengthof600bpwasamplifiedandclonedintothevectorpMD18一fThehomologyis99％．ThedORF5genesegmentdeletingN—terminalhydrophobicsequencewasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpGEX-·6p·-1andtherecombinantplasmidnamedpGEX--6p··dGP5wastransformedintoE．colicellBL21，aftertheanalysisofgenefragmentwasprovedexactlgTherecombinantplasmidwasinducedbylmmol／LIPTGthenSDS-PAGEindicatesdthattherecombinantfusionproteinwasabout40ku，whichwasthesameastheexpectedresultsandexpressedintheformofinclusionbodies．TheproteindGP5showedastrongimmunologicalreactiontothePRRSV-posifiveserainWestern-blottinganalysis．Thepurifiedrecombinantproteinwasinjectedtomice，andthencollectedserum．ItcouldinducetheserumantibodyagainstPRRSVwhichconfirmedwithWestern-blotting，butviralneutralizationtestshowedthattheserumantibodywasnotneutralizingantibody．AnindirectELISAassayWasconstructedandoptimizedtodetectantibodiesagainstPRRSVwithfusionproteinascoatingantigen．Theoptimalconcentrationofantigenwas1．25Pg／mL，thesealingbufferwasPBSTwith5％fetalbovineserum，andthesealingtimewas37℃for2h，then4℃12h．Theserumsamplewasdilutedby1：80，andincubatedat37℃for1h。Thedilutionofconjugatewas1：400，andreactiontimewasat37℃for1h．TheTMBsubstratewasaddfor15rainbeforeterminatedwithstopping solution．ComparedwithIDEXXcompany,thespecificitywas87．0％，sensitivitywas90·3％．andcoincidenceratewas88％jMoreover,dGP5fusionproteinhadnocross。reactionwith芬。si羲ves镄麓ofother4swinediseases(PEDV,CSFV,PRVandTGEV)．Thedi丘’erencevalueamongwellsinaplateandamongplatesforELISAWasbothlessthan10％．TheresultsshowedthattheindirectELISAassayhasgoodspecificityandrepetition·ThefesuitscouldprovideaquickandeasyserodiagnosisforthediagnosisofPI≈aRSV,thedetectionofantibodiesagainstPRRSVandepidemiologicalinvestigation．KeyWords：PRRSV；GP5gene；clone；prokaryoticexpression；fusionprotein 缩略词表缩略词英文全称中文全称AmpK吣NbpCP嚣CSFVDAB硅DEPCDNA心疆PSDTTEBED，】＆≮ELISAE．coliG趼hHRpp聪kbkuLmgmlnmLmolntODOlUPAGEPBSPCRPEDVAmpiciUinAMVreversetrancriptaseBasepairCytopathogeniceffectClassicalSwineFevervirus3，3'-diaminobenzidineDayDiethypyrocarbonateDeoxyribonucleicacidDeoxyribonucleosidetriphosphateDithiothreitolEthylenebromideEthylenediaminetetraacetaticacidEnzymelinkedimmunosorbentassayEscherichiacoliGlutathioneS．transferaseHourHorseradishperoxidase§一D—thiogalactopyranosideKjlobasepairKilodaltonLiterMilligramMinuteMilliterMolNucleotideOpticaldensityOpenreadingframePolyacrylamidegelelectrophoresisPhos曲ate孰fferedsalinePolymerasechainreactionPorcineepidemicdiarrheavirus氨苄青霉素禽源逆转录酶．碱基对缨服病变猪瘢病毒3，3’．二氨基联苯胺天焦碳酸二乙酯脱氧核糖核酸三磷酸我氧核营二硫苏糖醇溴化乙锭乙二胺匪乙酸酶联免疫吸附试验大肠杆菌谷虢苷默转移酶小时辣根过氧化物酶异瓣基硫代半乳糖营千碱基对千道尔顿舞毫克分钟毫秀摩尔核替酸光密度开放阅读框聚瓣烯酰胺凝胶电泳骥酸盐缓冲液聚合酶链式反应猪流行性腹泻病毒 PEGPRRSVPRVr／rainRNAI玎IU’．PCRSSDSsNTTCIDs0TEMEDTGEVTris“g肚LPolyethylene聚乙二醇Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus猪繁殖与呼吸综合征病毒Porcinerotavirus猪轮状病毒Revolutionsperminute每分钟转数Ribonucleicacid核糖核酸Reversetranscription逆转录Reversetranscription—PCR逆转录-PCRSecond秒Sodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠Serumneutralizationtest中和试验Tissuecultureinfectivedose半数组织培养感染剂量N’，N’，N’,N'-tetramethylethylenediamineN’'N’，N’N'-四甲基乙二胺Transmissiblegastroenteritisvirusofpigs猪传染性胃肠炎病毒Trishydroxymethhylaminomethane三羧甲基氨基甲烷microgram微克Microliter微升 PRRSVGP5基因戏克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立1引言猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)蔗由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统的传染病【l】。其特征为母猪厌食、发热、怀孕后期发生流产、产死胎和木乃伊胎；幼龄猪发生呼吸系统疾病焉大量死亡。该病于1987年首次在美国的中西部暴发，并在全美迅速蔓延，随后在加拿大、欧洲国家、亚洲国家相继发现该病。1991年，荷兰科学家在感染猪体内分离到该病毒，命名为Lelystad(IⅣ)毒株强3I，美国在1992年也发现该病毒，余名为ATCCVR-2332毒株。1996年，嗡尔滨兽医研究所从我国疑似PRRSV感染猪群中也检出了PRRSV【41。现阶段在我国如现的PRRSV主要是美洲型【引，其次是欧洲型【6j。因为该病传播速度快、危害大，给养猪业造成了巨大的经济损失，所以毽界动物翌生组织将就病列为B类传染病，我蓍也将英戮为二类传染病。‘由于PRRSV本身在不断的变异，藤且混合感染、继发感染的情况到目前为止已经普遍存在，这对本病的诊断和防治就提出了新的要求。最近几年，由于生物技术在日新月异的变革与进步，鼓及人们对该瘸毒本身分子生物学特性酶不断认识，简单、准确酶诊断方法以及一些薪型的疫苗己经出现。1．1猪繁殖与呼吸综合征的病原学特性及研究进展1．1．1PRRSV的形态学特性1991年，精兰中央兽医研究中心学者Wensvooft首次从人工和自然感染病猪分离到该病毒，命名为Lelystad(LV)毒株。随后，美囡也分离到该病毒，命名为ATCCVR-2332毒株。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。病毒粒子呈卵圆形，直径50一65nm。在感染的肺泡巨噬细胞的超薄切片中，该病毒粒子是单股RNA病毒，呈二十面体对称，有囊膜，直径为45。65nm的球状颗粒。1．1。2PRRSV的培养特性根据猪繁殖与呼吸综合征病毒基因变异的程度将其分为礴个基因型，～个是欧洲基因型，以Lv株为代表；另一个是美国基因型，以VR。2332株为代表。该病毒有很强的宿主依赖性，但两种代表株对细胞豹侵蚀往有所不阏。所有毒椿在体内均对猪肺匝噬缨脆(PAMs)的亲嗜性最高，但是在体外，欧洲分离株(LV)仅能适应于猪肺巨噬细胞(PAM)，并能够使纲胞产生较明显的病理变化作用(cytopathiceffect，CPE)，而美国分离株(VR一2332)除了能在PAM细胞上增穗并产生CPE外，还可翔CL．2621、Marc一145、MA．104缨骢系培养，并能崮税CPE耵j。该病毒不同细胞培养，在产生细胞病变的时间上有所不同。当在猪肺巨噬细胞上培养时，细胞病变在四天内即可产生；而在恒河猴肾细胞的衍生株CL一262l细胞上培养时，若要出现细胞病变则需要 河北农业大学硕士学位(毕业)论文最早两天、最晚六天的时间。照然在不同细胞中产生细胞病变的时间不同，但是细胞的病变特，征却有相离的遗方，鼯：傻感染的细胞萎缩，交圆，不再贴壁两跌培养瓶上脱落下来。PRRSV在易感细胞的胞浆中复制，通过间接免疫荧光謦H免疫过氧化物酶病毒抗原可以检测到感染6h后病毒在细胞核周围分布。1．1。3PRRSV的理化特性钋界的pH值、温度是影响猪繁殖与呼吸综合征瘸毒在宿主体外生存的主要因素。其中温度的变化，对PRRSV活性的变化起着重要的作用：本病毒在，70℃时可保存18个月，4℃保存一个月，当在2l℃时能够存活六天，在37℃时仅可以生存ld，若要使其完全丧失感染的活性，猁在56℃条件下处理45min即可。当环境中的pH值低于6，0或者高于7．5时，PRRSV会很快丧失活性；当环境中pH为6．5．7．5时，该病毒活性较稳定。去污剂可以通过破坏该病毒的囊膜，而使其丧失活性，颤其对乙醚和氯仿敏感。PRRSV在培养液中的溢度敏感性与其在盘清和缱织审是棚近的【8】。该病毒在没有经过处理翦，并没有凝集红细胞的活性【9]，但是经过Triton-100和吐温．20处理后能够凝集鼠红细胞【l们。另外，该病毒在蔗糖溶液中的浮密度是1．13g／mL．1．15g／mL，在氯化铯溶液里的浮密度英|l为1．18g／mL．1．19歆n己。1．2PRRSV基因组结构及主要编码的蛋白1。2．1PRRSVI骢基因组结构PRRSV基因组全长约15硒，其5’端是一帽子结构，3’端菲编码区后有多聚腺管酸的Poly(A)尾巴。该病毒含有8个开放阕读框架(OpenReadingFrames。ORFs)，病毒蒸因组的每个ORF都和它相邻的ORF有部分重叠。其中，ORF1开始于5’端非编码医211个核替酸后，长约12硒，约占整个病毒基因组的80％。ORFI包括ORFla和ORFlb。在ORFla终止予UAG的上游有一个互补序列UUUAAAC形成的RNA假孝疆，其下游形成的环茎杆结构可能与ORFlb的表达和核糖体移码有所关联(n】。ORFIb含有四个独特的区域，包括禽有芯髓序列S／GDD的聚合酶基元(motif)、锌指区(zincfingerdomain)、三磷酸核菅结合位点和一个功能不明解保守区【控】。ORFl可以编码该病毒豹聚合酶和复制酶。ORF2．5分别编码PRRSV的GP2．5等结构蛋白，也是糖基化蛋白。ORF6。7编码的是瘸毒的非糖基化蛋囱，ORF6编码的楚基质(matrx)蛋白M。GP2、GP3、GP4、GP5及M蛋白都含有N～末端和c一末端琉水序列，因此这些蛋囟可能会作为信号序列和膜锚定蛋白。ORF7编码核衣壳(nucleocapsid)蛋白N，该蛋白具有很强的保守性。ORF2至OI狮位于全基因组的3’端，ORF焉为一非编码序歹|l(汝约l14个核菅羧)戬及一多聚腺苷酸悉巴(长约20个核营酸)[t31。另外，在该病毒的复制期间，能够形成六个噩基因组mRNA，并分别翻译成6个结构蛋白。它们的5’端和3’端分别相同，大小分别为：O．7Kb，l，lKb，1．7Kb，2．2Kb，2．7Kb，3．3Kbfl4]。1．2．2主要编码的蛋白2 PRRSVGP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立ORFl编码病毒的复制酶，是唯一的非结构蛋白。ORFla编码的复制酶寡聚蛋白经裂解后产生6种写≥结构蛋白(Nspl-Nsp6)。其中Nsp2麓氨基酸序列在美渊榛和欧洲抹之间的同源性仅有32‰实验表明Nsp2基因中含有B细胞表位免疫的优势基因【15】。ORFlb编码Rdgp，CP2，CP3，CP4四个蛋白。ORF2基因包括ORF2a和ORF2b，ORF2a编码蛋自的分予量为29KD，ORF2b编码73个氨基酸的非糖基化蛋白。Oleksiewicz等(2001)【l6】利用噬菌体展示技术发现并证实了两个非中和性抗原表位。GP2由ORF2a编码，包含2个明显的疏水峰和2个推导的N糖基化位点，肽链中含有二硫键，合成后装配予病毒粒子中。ORF3编码GP3蛋白预测的分子量只有27-29KD，但实际分子量42．50KD。GP3有7个糖基化位点，高度糖基化，研究表明针对它的单克隆抗体具有中和作用。GP3的羧基末端是最易变巽的一端信号肽，霹麓会影镌整个GP3。GP3结梅特点及其变舞情况的研究，将会深纯人们对于PRRSV生物起源和GP3潜在作用的认识。ORF4编码GP4蛋白，分子量约为3lKD，为结构蛋白。GP4也是糖基囊膜化蛋白，有四个糖基纯位熹，N端有一信号肽序刭阳。在中和病毒方瑟GP4不如GP5有效器鹫，但是近年来发现的针对美洲型分离株VR-2332株的重组ORF4蛋白的单克隆抗体缺乏中和熊力【191。ORF6编码的M矮白，是非糖基化跨膜鬣白，位于病毒的囊膜上，分子量大小约为19KD。醚蛋白的N端有三个非常臻显的巯承嚣，是蛋鑫的跨膜区。该蛋自在感染细胞的淆露内质耀(娃)中聚集，与GP5糖蛋白通过二硫键形成异源二聚体，也能通过二硫键形成网源二聚体。虽然破坏这种分子问的二硫键会影响鼠乳酸脱氢酶病毒(LDV)的感染性，但是目前还没有有力的证据表明，在其二硫键被破坏以舞，PRRSV的感染性是否会受到影确。在PRRSV美洲分离毒椿之闻以及在欧美毒株之间，M蛋白是最保守的，也是感染猪免疫应答的主要抗原。有资料表明M蛋白可使感染10天后的猪产生抗体，所以可以利用体外表达的融合蛋白作为一些盘渍学试验操作的抗原[20,2”。Yang等(2000)研发了一株M蛋白单克隆抗体，具有中和活性【221。同年，针对我国分离株J1，韩庆安等制备了10株抗M蛋白单抗，能够与美洲株MLV反应的共有7株12引。Oleksiewicz等(2002)利黑噬菌体肢库技术，在醚蛋盘Aal33．159区域，鉴定出一个在美洲型毒株和欧溯型毒株中保守的B细胞线性表位【24】。ORF7编码N蛋白，分子量15KD。该蛋白至少有7个抗原决定簇，其中有对所有毒株的共曩决定簇，也有j艺美溯型或欧渊燮毒株静特异性决定簇，两且C一末端对撬原决定簇的形成起着很关键的作用。N蛋白是PRRSV结构蛋白中保守程度最商的，含量占整个结构蛋白的20％,-40％，有资料表明该蛋白具有很强的免疫原性【2副。N蛋白有6个疏水区及5．7个抗原决定簇【26|。该蛋白N端的半段是囱Arg，Lys翻His这三种氨基酸组成熬，这是=|艺美渊型或欧渊型毒株共同的特点；其C端在维持蛋白构象上起着羹要作用。在PRRSV感染猪后，大约11天产生的是针对N蛋白的抗体，中和抗体直到34周后才出现。按N蛋皂抗体在体内持续时闻最长，可持续几瘸到五个爿。N蛋皂是阂前巍清学诊凝最常用的抗原，也是猪繁殖与呼吸综合征体液免疫应答反应的主要抗原。ORF5编码GP5强自，又称E蛋自，分子量大小约为25KD。E蛋自在N端有有一段31个氨基酸的信号默及3个糖基化位点，分别位于62—83，90．106，l13．130位氨基酸。E蛋自含有蘸' 河北农业大学硕士学位(毕业)论文个很重要的抗原区域：27-41aa，180．197aa(C．端)。GP5蛋白总共有六个抗原决定簇，其中一个是线性决定簇，能够中和病毒。GP5的胞外区在PRRSV的免疫过程中起着重要的作用。Ph-zauch等(1997)鉴定出了北美洲型毒株的一个具有中和活性的线性表位【27】。Zhang等发现(1998)除了在北美分离株中存在2个不连续表位外，还存在4个连续的连续表位【2引。Rodriguez等(2001)研究发现E蛋白的aal70．201在欧美毒株问高度保守，且能与PRRSV阳性血清反应【291。Oleksiewicz等(2002)发现B细胞在美洲型毒株和欧洲型毒株中保守。同年，Plagemann发现欧洲株的LDV中和表位与美洲株VR。2332、欧洲经典毒株LvGP5外结构域有相当高的氨基酸同源性：另外，针对LDV中和表位的单克隆抗体同样也对VR2332株和LV株有中和能力【301。Ostrowski从噬菌体12肽库中鉴定出一个高度保守的中和表位即B表位，其氨基酸序列为H38，142，Y43和N45。该表为能够被PRRSV中和血清识别口¨。Wissink等(2003)证实了中和单抗可识别欧洲型PRRSV株N端外结构域的这一表位【32】。2004年，王玉娥发现GP5C端末端的11个氨基酸是PRRSV的抗原表位【331。同年，Plagemann发现NE均存在于欧洲型和美洲型毒株中B表位的区域p引。在PRRSVGP5的外结构域中还有一免疫优势区域，此区域有着很高的变异性，称为A表位，位于B表位的七个氨基酸之前，其在感染后快速产生非中和抗体。与HⅣ的GP41蛋白特点相同，A表位有可能会降低针对邻近中和抗原表位的保护性反应。以上研究表明GP5基因中含有两个在PRRSV抗原性起着重要作用的区域，其中一个位于胞外区(aa27．aa41)，另外一个位于C端(anl80一aal97)。A表位的核心氨基酸序列为：Aa27．31：B表位的核心氨基酸序列为：Aa37-45。在美洲株和欧洲株之间既存在共同抗原表位，又存在型独特性表位。而且，GP5糖基化与中和活性无关，但其内部的构象对中和活性抗体的产生具有重要作用。1．3PRRSV的基因组遗传与变异猪繁殖与呼吸综合征病毒有两个非常典型的毒株，～个是以VR-2332为代表美洲株，另一个是以LV为代表的欧洲株。各欧洲株之间抗原性差别较小，而相比之下各美洲株之间则具有较大的抗原性差别。此外，对这两种PRRSV毒株进行氨基酸序列比对后发现，美洲株和欧洲株基因之间具有很大的差异性，其中主要的几个开发阅读框之间的同源性只有60％．70％。ORF6基因是该病毒基因组中最为保守的基因片段；NSP2、ORF3和ORF5基因则是变异性最高的基因片段。近些年来，伴随着现代分子生物学诊断技术的不断发展以及PRRSV毒株的不断变异，人们对PRRSV基因组的遗传与变异分析也有了更深刻的认识。1996年，在美国衣阿华州出现了非典型性PRRSV，毒力很强，可导致较高的仔猪死亡率和严重的母猪繁殖障碍疾病，后经核苷酸序列分析证明是PRRSV的变异株。蔡雪辉等【35】(2005)发现我国PRRSV分离毒株与欧洲型LV株的抗原性相比差异性较大，但是却和美洲型VR-2332株的抗原性比较接近。2006年下半年，在我国南方一些省份爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征，该分离毒株基因序列与经典的PRRSV分离株相比，其Nsp2基因序列有90个碱基非连续的缺失，后经核苷酸序列分析证明是北美洲型的HP—PRRSV变异株【361。4 PRRSVGP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立吴锦艳等【3‘7】(2009)对分离自Marcl45细胞的PRRSV毒株运用RT-PCR方法扩增得到了缺失90个核苷酸Nsp2基因。李贺等网(2008)在江苏几个猪场分离得到了4株PRRSV毒株，这四株分离的毒株均在Nsp2基因的481位、532—560位出现了编码30个氨基酸碱基的缺失，后经鉴定均为美洲型。朱紫祥等139】(2010)从华东地区分离了3株PRRSV毒株，发现这三个PRRSV分离株全基因组序列与与美洲株的同源性较高达98．3％．99．7％，其中Nsp2基因变异最大，其次是GP5基因。王剑非等【40】(2011)通过对山东14株PRRSV毒株进行Nsp2和ORF5基因序列分析，所有毒株均在Nsp2基因上存在编码30个氨基酸碱基的缺失，ORF5基因则没有碱基的缺失现象。杨利琴等L4lJ(2010)对从云南分离出来的12份PRRSV毒株进行Nsp2、ORF5基因的分析测定，结果发现ORF5氨基酸序列仅有个别位点发生了点突变，有一份样品在Nsp2基因的486-489位氨基酸上发生了碱基的缺失。1．4PI水S流行病学、临诊症状和发病机理1．4．1PRRS流行病学本病一年四季均可发病，并没有明显的季节性。野猪和猪是该病仅有的自然宿主，而且各种品种和年龄的猪都易感。本病的传染源有病猪和亚临床感染的猪群、康复猪以及病母猪所产的仔猪。发病猪和带毒猪是本病的主要传染源。猪繁殖与呼吸综合征可通过多种途径感染猪，如可通过病猪的鼻分泌物、粪便、尿向外排出病毒。耐过猪在临诊症状消失后8周仍可向外排毒。只要易感猪与其接触就可感染发病，尤其是妊娠中后期的母猪和仔猪。病毒会在猪群中繁殖，通过呼吸道感染，特别是健康猪与病猪同圈饲养、频繁调运时可引起间接传播。同时，感染本病的母猪也可以通过胎盘将病毒传给仔猪，从而造成垂直传播。另外，感染该病毒的公猪，会由于人工授精而使大批母猪感染。在我国该病迅速传播的主要原因之一就是盲目的引进携带该病的后备母猪。本病在湿度高，气温低，风速大的条件下会迅速传播，特别是短距离的传播则更为快速。猪场饲养密度大、气候恶劣、卫生条件差，也可促进该病流行。单纯的猪繁殖与呼吸综合征病毒并不能引起猪的死亡。但是，现在该病毒与病原微生物双重感染的情况很普遍。尤其是猪细小病毒以及支原体与本病毒经常混合感染，这样会使症状加剧而引起死亡。1．4．2临诊症状及病理变化人工感染潜伏期4—7d，自然感染一般为14d。急性感染的母猪主要表现是发热，食欲减退，咳嗽，呼吸困难，在其耳部、鼻盘、乳腺、阴门等皮肤发绀或有不同程度的充血。少数母猪会出现肢体麻痹性神经症状。妊娠后期多发生早产、流产，所产窝中有不同数量的死胎、木乃伊胎及弱仔。这种现象一般会持续大概6周，然后出现重新发情的现象，但常造成繁殖母猪发情延迟且妊娠率低，不育或产奶量下降，从而导致产仔率降低。断奶前的弱仔和正常}J台JL死亡率高达80％，JL乎所有的早产仔猪在出生后数小时内或几天内死亡，并且死亡可延续到断奶以后。大多数哺乳仔猪症状表现为精神沉郁、食欲不振、呼吸困难、消瘦、后肢麻痹、发热、打喷嚏、瞌睡，有的仔猪躯体末端皮肤发绀和耳部发紫。英国报道有猪5 河北农业大学硕士学位(毕业)论文繁殖与呼吸综合征导致持续性腹泻。断奶仔猪和育成猪同群个头差异较大，发生结膜炎和轻度的呼吸症状。公猪感染后除表现咳嗽等呼吸道临诊症状外，可能表现不同程度的性欲减弱、射精减少和精液质量降低等。主要病理变化为肺脏呈现问质增宽，出血、呈深红色或紫色等弥漫性间质性肺炎，扁桃体发炎，全身淋巴结，特别是腹股沟淋巴结、肺门淋巴结出血肿大，切面似大理石样病变。部分病死猪肾脏肿大(用大量抗生素治疗后死亡的尤其明显)，呈褐色或土黄色，质地较脆，有淤血现象；脾脏肿大、质脆，新鲜或陈旧性出血且有梗死；膀胱内尿液浑浊呈茶色；部分病猪的肝脏可见黄白色坏死灶或出血灶。偶尔有病猪表现消化道病变，主要表现为肠出血，胃粘膜充血、出血。在感染病毒后48h，60h，72h剖检猪，可见腹膜、肾周围脂肪、肠系膜淋巴结、皮下脂肪和肌肉等部位发生水肿和肺水肿【7】。1．4．3主要发病机理PRRS病毒感染猪体后，首先会侵入肺的巨噬细胞，然后进入局部淋巴结，12h后会发生全身性的病毒血症，继而扩散至全身的巨噬细胞和单核细胞。巨噬细胞负责吞噬侵入体内的细菌和病毒，具有免疫方面的功能。虽然PRRSV在感染猪后的最初2h，吞噬细胞的吞噬作用也曾增强，但是PRRS病毒却在感染机体后的第二天入侵肺巨噬细胞，并导致巨噬细胞死亡。尤其是在感染7天后，由于释放超氧负离子的能力减弱，巨噬细胞依赖其发挥杀菌的作用也大大降低了，免疫力也随之降低。另外，由于PRRS毒株存在较强的变异性，各毒株之间又没有交叉免疫力，导致免疫细胞对其识别能力降低，从而逃避抗体的作用。这也为继发病原微生物感染创造了有利条件。1．5PRRS诊断方法研究进展我国自1996年报道有PRRS以来，全国许多省市都相继发现PRRS。左玉柱【42】在2008年9月至2009年3月，对河北省石家庄、保定、衡水、沧州、唐山规模化猪场PRRS感染及免疫情况进行了调查，结果显示非免疫猪场母猪阳性率为45．81％，仔猪为33．86％。表明河北省存在PRRSV感染，应该采取多种措施积极防制。根据母猪妊娠后期发生流产、新生仔猪死亡率高以及临诊症状和间质性肺炎等可初步做出诊断，但由于PRRS不仅与其他许多引起猪繁殖障碍的疾病(猪细小病毒病、猪伪狂犬病、圆环病毒病、日本乙型脑炎、猪瘟等)的临诊症状非常相似，而且极易发生混合感染，同时不同猪场感染PRRS后临诊症状又有很大差异，因此根据本病的临床症状可做出初步诊断，但是要确诊还是要靠实验室诊断。目前实验室常用的诊断方法主要有以下几种。1．5．1反转录PCR(RT-PCR)截止到目前，针对PRRSV不同基因，建立了多种I汀．PCR方法。由于PCR方法具有很强的灵敏度，所需模板量是微量的，而且具有快速准确诊断的特点，所以对一些即使病毒含量很低的6 PRRSVGP5基因戏克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立样品、已灭活的样品以及不可以通过病毒分离的精液都能够准确的进行鉴定。另外，RT—PCR方法还可以区分PRRSV酶不瓣毒株，妇欧渊型秘美渊型毒株。l。5．2免疫过氯化物酶单层试验(辩MA)IPMA是最先检测到PRRSV的血清学方法，其特异性和敏感性比较好，所以至今仍在欧洲一垡国家使焉。Wensvoort等(1991)酋先用IPMA方法，从感染PRRS6天后的病猪体内，检溺到TPRRSV血清抗体H31。我国在1996年，由王刚等成功的用IPMA方法，检测了赢渍中的PRRSV抗体。此方法可用于PRRSV的病毒鉴定、抗原检测及血清抗体检测∽】。但该方法的缺点是主观性较强，费时费力，不利予普及。’1．5．3病毒的分离与鉴定病猪的肺、死胎儿的肠和腹水、母猪血液、鼻腔拭子和粪便等可用于病毒的分离。将病料处理后，接种到恒河猴肾细脆的衍生株CL-2621或Marc一145细胞，培养7d赢可观察细胞的病理变化，最后通过使用特异性血清剑蚕闻接荧光抗体，检测该病毒的抗原。也可以进行用斑清中和试验进行鉴定，或者把病料经过一定的处理后接种猪肺泡巨噬细胞，放到细胞培养箱中培养5d后，使用免疫过氧仡耪酶法进行染色，检查PAMs中的PRRSV抗原。1．5．4间接荧光抗体试验(姒)Yoon等删(1992)率先用IFA从感染厩7d的猪体中检测了PRRSV抗体。本方法可以在PAMs，CL-2621及Marc-145培养物土进彳亍。郭宝清等渊(1996)就是应霜IFA方法检测东托、华={艺、华中、华南等地区的猪场，并首次发现了我国猪场存在PRRSV感染。该方法与IPMA柜比，特异性和敏感性相似，但是该方法也需要特殊的显微镜观察以及细胞培养，并且实验结果的判定还是依靠肉眼观察，赦具有很大的主观髓。1．5．5血清中和试验(SN)Yoon等‘47】(1994)最先在96孔微量板上，使用培养的Marc．145细胞将SN用于血清中的PRRSV抗体的检测。但该法对急性感染敏感性差，且费时费力，实验结果数据只能目溺，翔断具有主观牲。所以仅限于实验室诊断，但它熊够区分PRRSV不周毒株的抗原性。1．5．6酶联免疫吸附试验(曼狐SA)Albina等(1992)将PRRSV接种PAM上培养来获得阳性抗原，建立了检测血清中PRRSV挠体的闻接ELISA方法f4引。隧后，Takikawa等建立了以Marc．145制备抗原检测PRRSV抗体魄ELISA，其结果显示其敏感性和特异性均较IPMA和IFA高，而且以Marc一145培养也比PAMs上培养更加方便【矧。这些特点都有助予ELISA检溺方法的研究和推广。近些年来，剥j!l{|基因jE程技术获取重组蛋白作为诊断用ELISA抗原，逐渐成为研究的热点。7 河北农业大学硕士学位(毕业)论文DeaS等(2001)将N蛋白的全长基因克隆到PGEX4T．1载体上原核表达，将获得融合蛋白作为竞争ELISA的抗原【501。TorstenS(2002)等建立了一种可同时检测并区分针对欧美毒株的血清的间接ELISA方法【511。Oleksiewiez(2005)等依据GP4蛋白中一个高变的免疫优势表位，建立了可以区分感染PRRSV欧洲型野毒LV和弱毒苗Porcills接种猪群的peptide-ELISA[52】。目前，我国主要是利用N蛋白作为诊断用ELISA抗原。江云波(2005)等利用谷胱甘肽转移酶(GST)表达系统将PRRSV的ORE5和ORF6基因依次克隆于pGEX—KG载体中，在大肠杆菌中表达，与谷胱甘肽转移酶结合，从而获得了GP5一M—GST融合蛋白。以此建立了P56一ELISA方法，且与国外诊断试剂有较高的符合率【531。ELISA方法简单易操作，特异性和敏感性高，稳定性好，操作要求条件低，能够大批量检测，这些特点都有助于该方法的基层应用。目前，许多国家都把ELISA法作为监测和诊断本病的常规手段，诸如法国和英国。我国也将此方法作为诊断PRRSV抗体的主要手段。1．6PRRS的防治本病目前尚无特效药物疗法，主要采取综合防治措施及对症疗法。最根本的方法是消除病猪、带毒猪和彻底消毒，切断传播途径。PRRS病猪从恢复期开始可产生免疫力，对于再次感染PRRSV均有抵抗力。因此，在地方流行性区域内接种疫苗对预防繁殖障碍是比较有效的。目前针对PRRS的防控主要是接种疫苗。国内外均已研制成弱毒疫苗和灭活疫苗，一般认为弱毒疫苗效果较好，能在细胞内进行繁殖，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，能保护猪不出现临床症状，但不能阻止强毒感染，而且存在散毒问题和毒力返强的危险，并且返强的几率相当高。灭活疫苗不能在细胞内复制，因此不能诱导机体产生较强的免疫应答，免疫效果不是很理想。近些年来，我国各种猪病的继发感染以及混合感染情况很普遍，而PRRSV的不断变异，又使得该病的诊断变得越加困难。因此，应该与时俱进不断加深对PRRS的研究，以建立有效防治方法。1．7本课题研究的目的与意义国内大多数ELISA诊断用抗原多为全病毒或N蛋白，该方法虽然可以成功检测血清中的PRRSV抗体，但并不能有效地反映出猪群的免疫保护水平，GP5蛋白是PRRSV的重要的结构蛋白和免疫保护性蛋白之一，并且能够诱导产生中和抗体。本研究通过对河北省保定地区感染猪体内分离的PRRSV毒株的ORF5基因进行亚克隆、核酸测序及原核表达，成功获得了缺失了N端30个氨基酸残基的GP5蛋白，并以此为抗原，建立了一种新型的间接ELISA诊断方法，为建立标准化诊断试剂盒奠定基础，本方法的建立也为PRRS免疫监测以及疫苗的研究提供了科学依据。8 PRRSVGP5基因强克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立2．1材料2GP5基因的亚克隆及原核表达2．1．1细胞、抗体和毒株Marc．145细胞：购自中国兽药监察所。HRP．羊抗猪IgG-购自乾京索莱宝科技有限公司HRP一兔抗鼠IgG：赡自北京索莱宝科技有限公司PRRSV毒株：由河北农业大学兽联微生物实验室分离鉴定及保存，命名为HB-3(bd)／09株。2．1．2菌株与载体克隆载体pMDl8-T：购皂大连宝生物工程有限公司产燕。表达载体pGEX-6p-1：由河北农业大学兽医微生物实验室保存。E．co／／DH5(z菌株、BL21(DE3)菌株：由河北农业大学兽医微生物实验室保存。2．1．3实验动物及阳性血清8髑龄BALB／c小鼠10只：购自河北省试验动物中心猪PRRSV阳性、阴性血清：由河北农业大学兽医微生物实验室保存。2．1．4主要试剂和试剂盒NC膜(购自北京索莱宝科技有限公司)，特级新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，青霉素(160万单位)、链霉索(100万单位)(购自华托制药集团)，1640(购自GIBCOBRL)，胰蛋白酶(购自BDHChemicals)，HEBES(购自mml-esco)，DNA胶回收试剂盒、质粒小受提取试剂盒、GST琼脂糖凝胶纯化柱(购自康为世纪生物科技有限公词)，DNAMarker100bpLadder、ProteinRulerl、BluePlusProteinMarker(购自j艺京全式金生物技术有限公司)，限制性内切酶BarnHl、EcoRI、TaqDNA聚合酶、DL2000DNAplusMarker、T4DNA连接酶(购白大连宝生物工程有限公司)2．1．5RNA提取用试剂TRLZOLLSReagent：购自Invi台ogen公司。0．1％DEPC水(W／V)：准确称量0．1gDEPC，加入99mL无菌蒸馏水，充分溶解，37℃放置2h后，121℃高压灭菌30min，4℃保存备用。9 河北农业大学硕士学位(毕业)论文75％乙醇(V／V)：用0．1％DEPC水和无水乙醇按比例配制成浓度为75％的乙醇，4℃保存备用。2．1．6细胞培养用液10xRPMI一1640浓缩液：按lO．4g／100mL比例用灭菌蒸馏水溶解RPMI一1640粉剂，过滤除菌，一20℃保存备用，使用时作1：10倍稀释。特级新生牛血清：56℃灭活30min，分装后，4。C保存备用。2×104U／mL青霉素、链霉素液(双抗)：青霉素、链霉素各2×106u溶于100mL蒸馏水中，过滤除菌，分装，．20℃保存备用。7．5％NaHC03：7．5gNaHC03溶于100mL蒸馏水中，l15。C高压灭菌15min，4。C保存备用。10xEDTA．胰酶溶液(2．5％)：Na2EDTA0．2g，NaCl8．0g，KCl0．2g，Na2HP04‘12H202．89g，KH2P040．2g，胰酶2．5g，溶于100mL蒸馏水中，NaOH调节pH值至7．2—7．5，过滤除菌，分装，．20℃保存备用。lxEDTA一胰酶溶液(2．5％)：10xEDTA．胰酶溶液(2．5％)用高压灭菌蒸馏水按1：10稀释，4℃保存备用。lxRPMI．1640培养基：4xRPMI．1640溶液100mL，灭活的特级新生牛血清40mL，2x104U／mL青霉素、链霉素液4mL，灭菌蒸馏水243mL，用7．5％NaHC03溶液调节pH值至7．2左右，4"C保存备用。1xRPMI．1640维持液：4xRPMI．1640溶液100mL，灭活的特级新生牛血清8mL，2x104U／mL青霉素、链霉素液4mL，灭菌蒸馏水275mL，用7．5％NaHC03溶液调节pn值至7．2左右，4℃保存备用。PBS(10mmol／L．pH7．4)：NaCl8．00g，KHEP04O．24g，Na2HP041．44g，KClO．20g，加900mL三蒸水，37℃溶解，定容至1000mL，121℃灭菌15min。2．1．7大肠杆菌感受态细胞制备及转化用液O．1mol／LCaCl2溶液：无水CaCl21．665g，TIis0．242g，用浓HCI调pH值为6．5，用去离子水定容至200mL，121℃高压灭菌20min，储存于4℃备用。CaCl2一甘油：取上述CaCl2溶液85mL加15mL甘油混匀，121℃高压灭菌20min，储存于4℃备用。氨苄青霉素(Amp)贮存液(100mg／mL)：将lgAmp粉剂溶于10ml灭菌去离子水中，过滤除菌，分装，．20℃保存备用。IPTG贮存液(200mg／mL)：IPTG2g溶于10mL去离子水中，配制成200mg／mL，过滤除菌，分装，一20℃保存备用。LB液体培养基：称取Tryptone1g，Yeastextract0．5g，NaCllg，／JH*去离子水80mL，用10mol／LNaOH调节pH值至7．4，然后定容至100mL，115℃高压灭菌20min，4℃保存备用。Amp／LB液体培养基(100．g／mE)：于5mLLB液体培养基中，加入5plAmp储存液，4℃保存备用。Amp／LB固体培养基(100．g／mL)：营养琼脂粉4．2g溶于100mL去离子水中，121。C高压10 PRRSVGP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立灭菌20min，冷却至50℃左右，加入Amp储存液100gl，浇制平板，4℃保存备用。Amp／LB／X—GaL／IPTG平板：在制备好的Amp／LB平板上加40IrtLX-Gal(20mg／mL)和4¨LIPTG(200mg／mL)，用灭菌涂布器均匀涂布于平板表面，37℃温育至完全吸收。2．1．8琼脂糖凝胶电泳用溶液10mg／mLEB贮存液：以t0mg／mL浓度将EB溶于蒸馏水中，剧烈搅拌至完全溶解后，室温避光保存备用。50xTAE('Iris一乙酸)贮存液：24．2gTris碱，5．71mL冰乙酸，1．46gEDTA，蒸馏水定容至100mL，室温保存备用。lxTAE电泳缓冲液：取50xTAE(Tris一乙酸)贮存液用蒸馏水做1：50稀释，室温保存备用。l％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖溶于100mL1xTAE电泳缓冲液中，溶化后加入10mg,／mLEB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到O．5gg／mL。2．1．9诱导表达用溶液100mmol／LIPTG贮存液：IPTG0．2383g溶于10mL去离子水中，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。2xYT液体培养基：Tryptone16g，Yeastextract8g，NaCl5g，加入去离子水950mL，10mol／LNaOH调节pH值至7．4，定容至1000mL。115℃高压灭菌20min，4℃保存备用。Amp／2xYT液体培养基：于2xYT液体培养基中按终浓度100I．tg／mL加入Amp贮存液，4℃保存备用。Amp／2xYT固体培养基：琼脂粉1．5g溶于100mL2xYT液体中，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃左右，加入Amp至终浓度为100Irtg／mL，浇制平板，4℃保存备用。2．1．10SDS．PAGE电泳用溶液30％丙烯酰胺(W／V)：丙烯酰胺29g，N’，N’一二甲基甲叉双丙烯酰胺lg，37℃加热使之溶解，去离子水定容至100mL，pH不能超过8．8，过滤，4℃避光保存备用。1．5mol／LTris—HCl(pH8．8)：Tris．碱18．17g溶于80mL去离子水中，加入约3mL的浓盐酸调pH至8．8，用去离子水定容至100mL，室温保存备用。1mol／LTris—HCl(pH6．8)：Tris．碱12．1lg溶于80mL去离子水中，加入约9mL的浓盐酸调pH至6．8，用去离子水定容至100mL，室温保存备用。10％SDS：109SDS加100mL去离子水，加热至65℃助溶，用去离子水定容至100mL，室温保存备用。10％过硫酸胺：过硫酸胺1g，去离子水定容至10mL，4℃保存备用。5xTris一甘氨酸电泳缓冲液贮存液(pH8．3)：在900mL去离子水中溶解15．1gTris碱和949甘氨酸，然后加入50mL10％(W／V)的电泳级SDS贮存液，定容至1000mL，室温保存备用。2×SDS加样缓冲液： 河北农业大学硕士学位(毕业)论文Tris—HCl(pH6．8)100mmol／LDTT或5％B一巯基乙醇200mmol／LSDS2％(W／V)溴酚蓝O．03％(W／v)甘油20％(VⅣ)，混匀分装，．20oC保存备用。考马斯亮蓝染色液：90mL甲醇：去离子水(1：1VⅣ)和10mL冰乙酸的混和液中溶解O．25g考马斯亮蓝R250，混匀，滤纸过滤去除颗粒状物质，室温保存备用。脱色液：按甲醇：冰乙酸：去离子水(3：l：6)的体积配成脱色液，室温保存备用。2．1．11包涵体纯化相关试剂10xPBS(pH7．4)：NaCl140mmol／LKCl2．7mmol／LNa2HP0410mmol／LKH2P04I．8nlmo儿调pH值至7．4，用去离子水定容至1000mL，115℃高压灭菌，4℃保存备用。EDTA(pH8．0、10mmol／L)称取0．3gEDTA加到100mL去离子水中，4℃保存备用。菌体裂解液1xp’BS90mL，EDTA(pn8．0，10mmol／L)10mL。包涵体洗涤液I：Tris—HCI(pH8．0)50mmol／LNaCl100mmol／LEDTA(pH8．O)10mmol／LTritonX—1000．5％(VⅣ)包涵体洗涤液II：同包涵体洗涤液I，尿素2mol／L包涵体洗涤液III(pH9．O)：同包涵体洗涤液I，尿素4mol／L包涵体溶解液：Tris—HCl(pH9．0—10．0)50mmol／LNaCl100mmol／LEDTA(pH8．0)1mmol／LTritonX．1000．5％(V／V)尿素8m01／LD1vr5mmol／L包涵体复性缓冲液(pH8．0)： PRRSVGP5基因赃克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立lxPBS100mLEDTA(pH8。O)lmmolJL尿素(4．5tool／L)27g尿素(3．5mol／L)21g尿素(2。5tool／L)15g尿素(1．5mol／L)99尿素(0．5tool／L)3譬尿素(0molfl一)090．25mmol／LKCl溶液：KCl18．64gDW0．15g去离子水定容至1000mL。PB洗脱液(pH7．2)：錾℃lO，2gNa2HP042．13gKH2P04O．24g调pH值至7．2，去离子水定容至1000mL。2．1。12Westem-blottingm溶液蛋白转印缓冲液(pH9．3)：Tris碱3．025g甘氨酸14．49甲醇(VⅣ)20％去离子水定容至1000mL。10xTBS(pH7．5)：Tris碱12．1g甘氨酸40g用浓盐酸调pH至7．5，去离子水定容至500mL。1xTBST(抗体稀释液)：Twe热-200．25mLIOxTBS(pH7．5)50mL去离子水定容至500mL，室温保存备用。封闭液：含3％BSA的TBST缓冲液，4℃保存备耀。底物溶液(O．05mol／LTris—HCIpH7．6)：Tris碱0．6057g，用浓盐酸调pH至7．6，去离子水定容至100mL。DAB显色液：DAB5mg用O+05mol／LTris．HCI(pH7．6)10mL溶鳃，过滤，4℃保存，用前加入10“L30％过氧化氢溶液。13 河北农业大学硕士学位(毕业)论文2．1．13主要仪器设备全自动不锈钢立式蒸汽消毒器光学显微镜台式离心机冰箱琼脂糖水平电泳槽台式冷冻离心机超净工作台倒置显微镜高性能无菌试验台稳压稳流电泳仪制冰机二氧化碳培养箱电子天平超声破碎仪电热鼓风干燥箱液氮罐恒温恒湿箱移液器2．2方法2．2．1PCR]l物设计与合成R206124上海三申医疗器械有限公司YSl00NikonTGL-16G上海安亭科学仪器厂BCD．205TA青岛海尔股份有限公司DTCZ．24DN北京六一仪器厂Centrifuge5810REppendorf公司SW．CJ．1FB苏州净化设备有限公司37)(B上海光学仪器厂DL．CJ．1N哈尔滨市东联电子开发有限公司DYY一8C北京六一仪器厂SIM—F124日本三洋BBl5德国Heraeus公司FA-N／JA-N上海民桥精密仪器公司K570美国KONETS公司GX一9140MBE上海博讯实业有限公司YDS一15乐山市东亚机电工贸有限公司HWS一270宁波江南仪器厂DRAGoNMED公司根据GenBank中发表的PRRSVGP5全基因序列，使用Primer5．0软件设计合成1对特异性引物，扩增序列预期大小为603bp：GP5全基因序列引物P1：5。GGATCCAAGCl_11ATGTTGGGGAAA．3P2：5一CCATGGCTCGAGCTAGAGACGAC．32．2．2GP5基因的克隆与鉴定2．2．2．1组织样品的处理称取患病动物肺部组织1g，剪碎以1：3与生理盐水混匀后，于研磨器中研磨。待制成匀浆后转至1．5mL灭菌离心管中，反复冻融3次，8000rpm／min离心5min，取上清液．20℃保存备用。14 PRRSVGP5基因距克隆、原核表达及EUSA抗体检测方法的建立2．2．2．2PRRSV总Ⅺ妊的提取取已处理好的病料上清液250gL加入750laLTRNzol，剧烈振荡，室温静置5min，使其充分裂解；加入200gL氯仿，振荡15—30S，室温放置10min，4℃，12000r／min离心10min；吸取上清搬入等体积的舅蔼醇混匀，室瀑放置30min或．约℃静置lh；4"C，12000r／min离心lOmin，弃上清后加入600laLDEPC水配制的75％乙醇，洗涤；4℃，7500r／min离。tl,5min，弃尽上清；室温晾干5．10min后，溶于20pL无RNA酶的水中，混匀，于．80℃保存备用或直接进行反转录。2．2．2．3PRRSV总RNA的反转录按照MLV鼠源反转录酶说明书进行操作，建立20llL反转录反应体系：RNA模板7。5媾下游引物3”LdNTPs(2．5mmol／L)4gL75℃5min后立刻冰浴5min，MLV反转录酶(10U／1．tL)l}lL5×MLVBuffer4gLRnasin(40U／gL)0．5gL混匀后置42℃水浴lh，95℃5min，即为GP5基因的eDNA，悫接进行PCR反应，或．20℃保存备用。2．2．2．4PRRSV目的基因片段扩增以eDNA为模板，建立25此PCR反应体系：eDNA模板2“L2．5mmoldNTPs3|lLlO×PCRbuffer2．5gLTaqDNA聚合酶O．5uL上游弓|物(P1)1taL下游引物(P2)l丝L灭菌蒸馏水15uL加完上述试裁后，佟瞬时离心混匀，进行PCR扩增。反应参数为：94℃颈变性5min，进入循环：94℃变性45S，52℃退火45s，72℃延伸lrain，共35个循环；然后72℃延伸10min。反应完成后，取5gLPCR产物在1．0％的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增结果。2．2．2．5PCR产物的纯化与阐收参照DNA纯化网收试剂盒说明二f5进行操作，主要操作步骤如下：电泳分离待回收的目的片15 河北农业大学硕士学位(毕业)论文段，从琼脂糖凝胶上切下目的条带，放入1．5mL的离心管中，称重，按0．1g胶重，加300pL溶胶液的比例添加溶胶液，50℃水浴放置10min，其问要每隔2．3min翻转离心管，以使胶充分溶解。将上一步所得溶液降至室温后，加入吸附柱CAl中，(吸附柱提前平衡)12000r／min离心30S，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入600儿漂洗液PW，12000r／min离心30一60S，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；重复洗涤1次；将吸附柱放回收集管中，12000r／min离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；将吸附柱放入一新离心管中滴加洗脱液30LLL，室温放置2min。12000r／min离心2min收集溶液。2．2．2．6目的基因与克隆载体的连接●‘将回收获得的目的基因与pMDl8．T载体连接，命名为pMD．GP5，建立10“L连接体系如下：pMDl8-TVector(50ng／laL)0．5laLLigationSolutionI5．0pLPCR回收产物4．5uL混匀后，16℃连接过夜。2．2．2．7大肠杆菌感受态细胞的制备与连接产物的转化2．2．2．7．1大肠杆菌DH50t感受态细胞的制备-CaCl2法①将菌种在普通在LB平板上划线培养12h后，挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养(200r／min)12h。②取lmL培养物接种于100mLLB液体培养基中，37℃振荡培养3h，使OD600值达No．4．0．6。将培养物转移到两个经过高压灭菌，并提前预冷的50mL聚丙烯管中，在冰上放置10min。③4℃4000r／min，离心15min。弃上清后，每管用10mL冰预冷的O．1mol／LCaCl2溶液重悬菌体沉淀(冰上操作)。冰浴30min后，4℃4000r／min，离心15min，弃上清，收集菌体沉淀。④最后每管用15％甘油一CaCl2溶液4mL悬浮菌体，在冰上迅速分装，每管200斗L，．80。C冻存备用。2．2．2．7．2连接产物的转化16①于．80℃冰箱中取出冻存的感受态细胞5min，使其溶解。②将10uL连接产物加入到200gL感受态细胞中混匀，冰浴30min。③42℃水浴90S，然后再冰浴3min。④向感受态混合物中加入750gLLB液体培养基混匀，37。C振摇培养(200r／min)45min。04000r／min离一t35min。弃掉部分上清液，剩下100—200gL后将沉淀混匀转移到涂布Amp PRRSVGP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立的LB固体琼脂培养基平板上，用无菌L形玻璃棒涂布均匀，先将平板正面放置45min，然后倒置平皿于37℃恒温箱培养12h。2．2．2．8重组质粒DNA的抽提挑取白色菌落接种于3mLAmp／LB液体培养基中，37℃摇菌过夜。参照质粒小提取试剂盒说明书进行操作，主要步骤如下：向吸附柱中加入500gL的平衡液，12000r／rain离心1rain，倒掉废液。取3mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000r／min离心lmin，除上清；加入250此溶液Pl，彻底悬浮沉淀；加入250rtL溶液P2，温和上下翻转6．8次使菌体充分裂解；向离心管中加入350此溶液P3，温和翻转6．8次混匀，12000r／min离心10min。将上一步得到的上清加入吸附柱中，12000r／min离心lmin，倒掉废液；向吸附柱中加入漂洗液600皿，12000r／min离一tb1min，倒掉废液，再重复洗一次。将吸附柱放入收集管中离心2min后，将吸附柱放入另一个离心管中，滴加30此洗脱液，室温静置2min，12000r／min离心2min将质粒溶液收集到离心管中。2．2．2．9重组质粒的PCR鉴定用特异性引物P1和P2对质粒pMD—GP5进行PCR扩增，建立25gLPCR反应体系：质粒DNA模板1uL2．5mmoldNTPs3“L10xPCRbuffer2．5pLTaqDNA聚合酶0．5“L上游引物(P1)1uL下游引物(P2)l“L灭菌蒸馏水16uL加完上述试剂后，作瞬时离心混匀，进行PCR扩增。反应参数为：94℃5min：94℃40s，51．7℃40S，72℃lmin，共30个循环，72℃延伸10min。反应完成后，取5gLPCR产物在1．0％的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增结果。PCR产物用琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒进行纯化回收，主要步骤同2．2．2．5。2．2．2．10序列测定将鉴定正确的阳性重组克隆菌用60％甘油LB保存至1．5mL离心管中，送天根生物技术有限公司进行序列测定。测序结果登录mvw．ncbi．nlm．nih．gov／blast利用件Blast软件与GenBank中相应的基因序列进行比较分析同源性。2．2．3dGP5目的基因表达载体的构建与鉴定17 河北农业大学硕士学位(毕业)论文2．2．3．1引物的设计与合成由于GP5蛋白在表达系统中难以表达，在设计引物P3、P4时将氨基端疏水性较强信号肽序列去掉。根据pMDl8-T克隆载体以及pGEX。6p-1表达载体的特点，用Primer5．0软件设计特异性引物，并在上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入EcoRI酶切位点，预期大小为513bp。根据GenBank中发表的PRRSVGP5全基因序列，使用Primer5．0软件设计合成dGP5目的基因表达载体用引物：dGP5引物P3：GGATCCATGAGCAACAGCAACAGP4：G^A弋飞呶KQhQKCGACCCCATT上述引物由天根有限公司合成。2．2．3．2目的基因的PCR扩增及纯化回收以重组质粒pMD—GP5为模板，PCR扩增截短后的GP5基因，建立25laLPCR反应体系如下：阳性克隆质粒I1．tL2．5mmoldNTPs3“L10xPCRbuffer2．5pLTaqDNA聚合酶0．5uL上游引物(P1)1uL下游引物(P2)1／aL灭菌蒸馏水16uL加完上述试剂后，作瞬时离心混匀，进行PCR扩增。反应参数为：94℃5min；94℃40s，51．7℃40S，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min。反应完成后，取5laLPCR产物在1．0％的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增结果。PCR产物用琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒进行纯化回收，主要步骤同2．2．2．5。2．2．3．3dGP5基因重组表达载体的构建2．2．3．3．1dGP5基因的克隆将纯化回收的dGP5基因扩增产物克隆至pMDl8一T载体，命名为pMDl8-T—dGP5。操作方法同2．2．2．6，2．2．2．7。2．2．3．3．2pMDl8-T-dGP5质粒提取18质粒提取操作方法同2．2．2．8。 PRRSVGP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立2．2．3．3．3重组质粒pMDl8-T-dGP5和表达载体pGEX．6p．1的酶切将纯化后的表达载体pGEX一6p．1和pMDl8．T．dGP5重组质粒分别用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，建立50uL酶切体系如下：10×bufferH5肚LEcoRI1．5pLBamHI1．5“LpMD18一T—dGP5／pGEX一6p一120pL灭菌蒸馏水22uL混匀，离心瞬间，37℃消化3h，1％琼脂糖电泳检查酶切结果。2．2-3．3．4电泳回收酶切后的目的基因和线性表达载体DNA将酶切后的目的基因以及线状表达载体，在1．0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，将含所需DNA的目的条带切下，胶回收试剂盒进行回收，操作步骤同2．2．2．5。2．2．3．3．5目的基因与载体DNA的连接与转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞的制备方法及目的基因与载体DNA的连接与转化。操作方法同2．2．2．7将纯化回收后的目的基因与表达载体进行连接，构建重组表达质粒，命名为pGEX．6p-dGP5，连接反应体系如下：lOxT4DNA连接酶BufferlLlLT4DNA连接酶(3U／gL)1uL表达载体DNA5uL目的基因3uL混匀，瞬离，16℃连接过夜。按前述方法2．2．4．8将过夜连接产物转化E．coliDH5ct感受态细胞，均匀涂布于Amp／LB平板，37℃培养过夜，利用氨苄青霉素抗性筛选重组转化体。同时，以同样的方法将表达质粒pGEX一6P．1转化转入E．coliBL21(DE3)感受态细胞。2．2．3．3．6pGEX一6p—dGP5质粒提取操作方法同2．2．2．8。2．2．3．4dGP5基因重组表达载体的鉴定2．2．3．4．1菌液PCR鉴定用特异性引物对质粒pGEX一6p-dGP5进行PCR扩增，建立25laLPCR反应体系如下；质粒DNA模板luL19 河北农业大学硕士学位(毕业)论文2．5mmoldN’I’Ps10xPCRbufferTaqDNA聚合酶上游引物(P1)下游引物(P2)灭菌蒸馏水2．2．3．4．2酶切鉴定3肛L2．5gL0．5gL1gL1pL16肛L对PCR初步鉴定为阳性的重组质粒pGEX一6p．dGP5，用限制性内切酶BamHI、EcoRI双酶切鉴定。BamHI和EcoRI双酶切体系(20gL)如下：质粒4pLBamH10．5pLEcoR10．5pL10xKBuffer1pL灭菌蒸馏水4肛L混匀，37℃水浴3h，1．0％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。2．2．3．4．3序列测定将酶切鉴定正确的阳性pGEX．6p-dGP5重组克隆菌用60％甘油LB保存至1．5mL离心管中，送天根生物技术有限公司进行序列测定。测序结果登录、)ln棚r．ncbi．nlm．nih．gov／blast利用件Blast软件与GenBank中相应的基因序列进行比较分析同源性。2．2．4重组表达菌的诱导表达2．2．4．1重组菌的诱导表达挑取含阳性重组表达质粒的单菌落，接种于含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600到0．6—0．8，加入终浓度为lmmol／L的IPTG。在30℃下诱导培养，分别于诱导前和诱导后2h、3h、4h、6h取菌。将不同时间取的菌液12000r／min离心lmin，弃上清，再用PBS重悬菌液沉淀，加入等体积的2xSDS上样缓冲液，煮沸变性5min，12000r／min离心1min，取上清。2．2．4．2重组蛋白的可溶性检测将100mL菌液，37℃振荡培养3h(OD600=0．6—0．8)，加IPTG至终浓度为1mmol／L37℃诱导4h。然后离心，取菌体沉淀放于菌体裂解液混匀(每克沉淀加3mL菌体裂解液)，冰上放置10rain。然后进行冰上超声波裂解：超声2S、间歇2s，共20min，波幅为30％。待菌液较20 PRRSVGP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立清亮时，4℃12000r／min离心10min，分别收集上清和沉淀。进行SDS．PAGE电泳，以确定表达产物是以包涵体形式存在于沉淀中还是以可溶性形式存在于上清中。2．2．4．3重组蛋白的纯化由于该蛋白存在于包涵体沉淀中，故在用镍柱纯化前经过了洗涤、溶解、复性。然后按照康为世纪生物科技有限公司的GST琼脂糖凝胶试剂盒纯化。主要步骤如下：轻轻混匀GST凝胶直至完全重悬；用吸管移取适量的GST凝胶至层析柱中；用10倍柱床体积的PBSBuffer洗涤柱子：将含有GST融合蛋白的PBS溶液加入到已平衡好的层析柱中，流速控制在10．15cm／h；上样完成后，用20倍柱床体积的PBS洗涤，洗涤液中最好加入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶活性。用10．1．5倍柱床体积的新配置的洗脱液洗脱。分别取等量的流穿液、洗涤液和洗脱液进行SDS—PAGE以分析目的蛋白。洗脱完成后，用3—5倍柱床体积的1×PBSBuffer洗涤柱子。2．2．5纯化蛋白的SDS．PAGE鉴定及其蛋白浓度的测定参照分子克隆实验指导的方法配制12％的分离胶，装好制胶板，加入分离胶(使梳子到胶面的距离约1cm)，胶面上加一层水，室温放置待胶充分聚合后吸干水份，加入配好的浓缩胶，装上梳子，胶充分聚合后拔出梳子即可上样进行电泳。收集诱导后的菌液，加入等体积2xSDS上样缓冲液，混匀，煮沸5min，12000r／min离心2min，取上清10“L上样，同时设置空载体和诱导前菌体作对照。电压在浓缩胶内为90V，在分离胶内为llOV。电泳后，用考马斯亮蓝染色1h左右，再在脱色液中脱色2h，期间更换脱色液2．3次，直到蛋白区域清晰为止。检查重组蛋白的表达情况。用紫外分光光度计测定纯化蛋白样品在波长260nlil和280nlll时的光吸收值，按下式计算样品中的蛋白质含量：蛋白质浓度(mg／mL)=(1．45xA280一O．74xA260)×稀释倍数。分装后，．20℃保存备用。2．2．6重组蛋白的Western-blotting分析将重组蛋白进行SDS—PAGE电泳后，转印到NC膜。湿转3h后再转移至5％的脱脂奶粉封闭液中，4℃过夜。次日加入l：100的猪阳性血清(一抗)。室温下作用3h后，用TBST洗膜3次，每次6min，然后加入l：1000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG(二抗)，室温振荡1h；洗涤同上。最后在暗处将洗涤后的NC膜放入新配置的DAB底物显色液中显色3．5min，直至条带清晰后迅速用去离子水终止显色反应，拍照记录结果。2．2．7小鼠免疫试验21 河北农业大学硕士学位(毕业)论文2．2．7．I小鼠免疫程序将6．8周龄BALB／c小鼠分成踊组，一组是空白对照组，一组为融合蛋白组，每组5只。每只皮下多点注射重组蛋白50,ug。另一组注射每只皮下注射生理盐水200p．L，作为空白对照。麸免疫4次，每次间隔10d。免疫当天进行取盘。前四次断尾取盘，最后一次免疫后第十天眼球取衄，分离血清。进行Western-blotting和血清中和试验。2。2．7。2Western-blotting按照2．2．6方法，将重组蛋自转印NC膜，然詹把经过GST孵育过的小鼠血清作为一抗，HRP标记的兔抗鼠IgG作为二抗。2．2。7．3盘清中和抗体实验2．2．7．3．1Marc．145细胞复苏与培养从液氮中取出～管冻存的Mare．145细胞在37℃水浴中迅速融化；1000r／min离心10min，沉淀细胞；用20％血清的营养液重悬细胞；加入细胞瓶，37℃、5％C02静止培养；12h后换液，待长满单层焉传代，备孀。2．2。7．3．2病毒的增殖按照常规方法进行细胞培养，待细胞长到60％．80％的融合度的时候，将。80℃冻存的病毒渡抉速融曩二瑟按一定比铹接种子生长良妊的Marc．145缨脆土，37℃、5％cch琢境下吸附1h，期间每隔15min轻轻摇动细胞瓶1次，吸附完雁，加入Mare．145细胞生长维持液，观察细胞病变。待80％．90％的细胞出现细胞病变(CPE)时收获病毒液，将细胞液反复冻融3次，3000r／rain离心l◇min，去除细胞碎片，测定瘸毒酶TCIDso，．80"C保存各用。2．2．7。3，3病毒的TCID50测定取Marc．145细胞铺于96孔细胞培养板各孑L内，待细胞长成单层后，接种用2％RPMI。1640细艴维持液作l伊1，lff强系列稀释静PRRSV，100瓣。孔，于37℃吸附lh；弃去病毒液，鞴PBS轻轻洗涤细胞2次；加入2％RPMI。1640细胞维持液，100塾U孔，将细胞置37℃5％C02恒温培养箱内培养。每个稀释皮重复6孔，观察、计数细胞瘸变。按照Reed—Muench法计算病毒TCID50。2．2．7．3．4血清中和抗体实验22(1)血清的处理：取适量的血清样品于56℃条件下作用30rain，以灭活补体； PRRSVGP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立将血清作1：2、l：4、l：8、l：16、1：32、l：64倍比稀释后，与等量的PRRSV病毒液(200TCID，do．1mL)混合，于37℃孵育lh。(2)将病毒与血清的混合液接种到80％融合状态的Marc．145细胞培养板中，100laL／孔，每个稀释度重复3孔，同时设立不接病毒的细胞对照、阳性血清对照和阴性血清对照，于37℃5％C02培养箱中感作lh后，加入含2％特级新生牛血清的RPMI．1640维持液，丁．37℃5％C02培养箱中培养48．72h，每日观察CPE。(3)结果判定，当细胞对照、阳性血清没有出现CPE，而阴性血清没有出现CPE时，记录每个血清稀释度的CPE孔数。以能够完全抑制CPE的血清最大稀释倍数作为血清的中和效价。2．3结果2．3．1GP5基因的扩增利用设计的引物，提取病料的病毒总RNA，应用RT—PCR方法扩增出了大小约为600bp的特异性条带，与预期目的片段大小相符(见图1)。Ml000bp750bp500bp250bp图1RT．PCR扩增的GP5基因Fig．IAmplificationofGP5genebyPCRM：DNA标准DL2000；l：GP5基因的PCR产物M：DNAMarkerDL2000；I：PCRproductofGP5gene2．3．2重组质粒pMD-GP5的鉴定结果23 河北农业大学硕士学位(毕业)论文500bp—斗500bp_◆图2重组质粒pMD．GP5的鉴定结果Fig．2IdentificationoftherecombinantplasmidpMD-GP51：100bpDNAladder；2：PCR产物：3：菌液PCR产物：4：质粒EcoRI和XhoI酶切产物：5：重组质粒．1：100bpDNAladder；2：PCRproduct；3：PCRproductsofbacteria；4：doubleenzymedigestionbyEcoRIandXhol：5：Plasmid．对重组质粒进行双酶切，分别获得与空载体对照相一致的约2686bp左右基因片段和约600bp左右的GP5基因片段，将PCR和双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序，并将阳性重组质粒命名为pMD-GP5(见图2)。2．3．3原核表达质粒pGEX-6p—dGP5的构建与鉴定以pMD-GP5为模板，P3和P4为引物，进行dGP5基因扩增，扩增产物经BarnHI、EcoRI双酶切连接至pGEX．6P．1，重组质粒通过PCR扩增和酶切进行鉴定，结果见图3和图4。黜饕三400蹄叶Ml5000bp——◆750bp——◆500br,—◆M1}o翻—一}警、jI_j{f鬈。!{}■■簟“蔫龋黼疆■赣圈3重组质粒pGEX．6p-dGP5的PCR签定图4重组质粒pGEX·6p-dGP5的酶切鉴定Fig．3AmplificationofpGEX卸-dGP5genebyPCRFig．4IdentificationoftheplasmidpGEX-6p．dGP5M：DNA标准100bpLadder；M：DNA标准DL2000；I：pGEX．6p-dGP5基因的PCR产物l：BarnHI采1EcoRI双酶切产物：M：DNAMarker100bpLadder；M：DNAMarkerDL2000；I：PCRproductofpGEX·6p-dGP5geneI：doubleenzymedigestionbyBarnHIandEcoRI由图3和图4可知，应刚PCR方法从重组质粒中扩增出约500bp左右的特异性基因片段，对重组质粒进行双酶切，分别获得与空载体对照相一致的约4360bp左以基因片段和约500bp左右的dGP5基因片段，将PCR和烈酶切鉴定为阿l性的重组质粒进行测序，并将刚性重组质粒命名为pGEX-6p．dGP5。24 PRRSVGP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立2．3．4序列测定及分析重组质粒送往天根生物技术有限公司测序，结果表明：HB．3(bd)／09株GP5基因为603bp，dGP5基因有510bp，目的基因均P_AE确插入到克隆载体中。利用NCBI网站BLAST进行基因序列的同源性搜索，核苷酸序列与HB．3(cz)、HZ．1、NB一3、HZ一2等株同源性达99％。2．3．5表达产物flgSDS—PAGE分析将含有阳性重组质粒的大肠杆菌用IPTG诱导，在不同诱导时间取样，并经SDS．PAGE检测，结果在约40ku处可见表达条带，与预期蛋白大小相一致(见图5)，而未诱导菌和空载体菌诱导后，均没有出现此蛋白条带，且在诱导后4h表达量最高。诱导表达4h的菌液经超声波裂解后，其沉淀和上清的SDS．PAGE显示，虽然都比空载体组多出一条约40l(tl的蛋白条带，但其上清中的含量明显低于沉淀中。表明该重组蛋白主要是以包涵体形式存在(见图6)。80ku60ku40ku30ku20ku12ku图5诱导不同时间重组菌的SDS．PAGE分析Fig．5IdentificationoftheamountofdGP5expressedfromtheRecombinantproteinindifferenttime1：pGEX．6p-1空载体诱导后3h；2：pGEX一6p-I空载体诱导后0h；M：蛋白质分子质量标准：3～7：pGEX·6p·dGP5诱导0，2，3，4and6hl：uninducedplasmidin3：2：uninducedplasmidinO；M：Molecularstandardofprotein；3～7：inducedin0，2,3，4and6h25 河北农业大学硕士学位(毕业)论文60k40k30k20kM12345图6重组蛋白的包含体表达M：蛋亡|质分子质量标准；I：pGEX一6pl空载体诱导后4h；2：pGEX·6p-dGP5诱导4h后裂解上清；3：pGEX·6p-dGP5诱导4h后裂解上清；4：pGEX一6p-dGP5诱导4h后裂解沉gg；5：pGEX·6p—GP5诱导4h后裂解沉淀Fig．6ExpressionofinclusionbodiesoftherecombinantproteindGP5M：Molecularstandardofprotein；hUnindueedplasmidin4h；2：Supematantsinducedin4h；3：Supematamsinducedin4h；4：Sedimontationinducedin4h；5：Sedimentationinducedin4h；2．3．6重组蛋白的纯化回收在包涵体洗涤过程中，收集洗涤后的沉淀，然后与过柱纯化的蛋白进行SDS．PAGE电泳。结果显示经包涵体洗涤、溶解、复性后，菌体的大部分杂蛋白已去除，目的蛋白被纯化(见图7)。2665432lM80ku60ku40ku30ku12ku圈7重组蛋白的纯化Fig．7PurificationofrecombinantfusionproteinM：蛋￡J质分予质量标准：I：pGEX如l窄栽体诱导后4h；2：pGEX．6p-dGP5诱导后4h：3：包涵体洗涤液I沈涤后的沉淀；4：包涵体洗涤液lI洗涤后的沉淀；5：包涵体洗涤液1ll洗涤后的淀：6：过纯化柱后的熏组虽自M：Molecularstandardofprotein；i：inducedplasmidin3h；2：inducedin4h；3：Depositionresultedfrominclusionbodieswashingl；4：Depositionresultedfrominclusionbodieswashing11：S：Depositionresultedfrominclusionbodieswashinglll；6：Purifiedrecombinantproteinasinclusion． PRRSVGP5基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立2．3．7蛋白浓度的测定用紫外分光光度计测定纯化复性后的样品在260nin和280nlTI波长的光吸收值，按照下列公式计算样品中的蛋白质含量：蛋白质浓度(mg／mL)=(1．45×A280-0．74×A260)×稀释倍数=0．50mg／mL2．3．8Western．blotting鉴定DAB显色后，在约40l(u处有特异性条带，而阴性空载体诱导对照无此特异性反应。证明重组的dGP5在大肠杆菌中获得了正确表达，且表达蛋白具有良好的抗原性(见图8)。12M60ku40ku30ku【ot检浸Fig．8Western·blottingdetectionofrecombinantproteinPRRSV-dGP5M：预染蛋白质分子质量标准；l：pGEX．6p-dGP5蛋白；2：GST蛋白M：Molecularstandardofprestained．protein；l：pGEX-6p—dGP5protein；2：GSTprotein2．3．9重组蛋白免疫鼠血清的Western．blotting分析结果显示：pGEX-6p-dGP5重组蛋白与经GST蛋白孵育过的免疫鼠血清在约40ku处有特异性条带，而GST蛋白则与该血清不反应。说明该重组蛋白能够诱导产生抗该融合蛋白的特异性抗体(见图9)。27 河北农业大学硕士学位(毕业)论文、1I二i，j≮4f1kL：—o。‘iw，。一誓“1黪i⋯爿一3【_)kL：一一一。1¨|；l、，、i；!．；k、l——◆。ii图9免疫鼠血清的Wcst6ra．blot检测Fig．9Western．blottingdetectionofmouseserumagainstrecombinantproteinPRRSV-dGP5M：预染蛋白质分子质量标准；l：pGEX-6p-dGP5蛋白；2：GST蛋白-M：Molecularstandardofprestainedprotein；l：pGEX-6p-dGP5protein；2：GSTprotein2．3．10中和抗体水平检测2．3．10．1病毒TCID50按Reed和Muench两氏法计算，该毒株的毒价为106’80TCID5加L。2．3．10．2中和抗体水平pGEX．6p—dGP5蛋白免疫组的小鼠血清的中和抗体滴度：64—69．[s]陈军义，_芏开功，罗险峰，等，PRRSVGZJL株GP5基嚣戆克隆及殿核表达口]，河北农业大学学报，2011，34(1)：101—104．[63OleksiewiezMB，BotherA．PorcineB-cellsrecognizeepitopesthatareporcinereproductiveandconservedbetweenthestruc—turalofAmerican—andEuropean—typerespiratorysyndromevi～rus[J]．jGenVirol，2002，83(6)：1407，1418．[73顾小雪，李玉蜂，姜平，等．猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位基豳的表达及其表达产物的抗原性[J]．中匿兽医科学，2007，37(12)：1053—1057．Is]王云蜂，周艳君，仇华密，等．玻精重缀N蛋白一El。ISA检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的研究[J]．中国兽医杂志，2001，37(3)：3-5．[93刘涛，陈赛娲，曹洪站，等．猪繁殖与呼吸综合征病毒HB一3(cz)楝ORF5基因序列分析及源核表达[J]．中国善簇杂志，2008，44(12)：88—91．[to]OstvowshiM，GaleotajA．JarAM，eta1．1dentificationofneutraiizingandnonneutraliziflgepitopesintheporcinerepro～ductiveandrespiratorysyndromevirusGP5ectodomain[j]。2002，76(9)：4241-4250．[11]冷超檄，安丽获，陈家键，等。离致痰幢猿繁殖专殍吸综合征瘸毒GP5蛋白B表位诱导中和抗体能力的研究[J]．中国预防善蓬攀掇，2011，33(4)：297—300．ProkaryoticExpressionandSubcloningofORF5GeneofPRRSVLIJian—11ui，ZU0Yu—zhu，SUNYan—xin，FANJing～hui(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding，Hebei，071001，China)Abstract：Theporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolatedfromthelungmaterialsofsixswine．ThespecificORF5geneamplifiedbyRT-PCRwasclonedintopMDl8一Tvector．ThedORF5genesegmentdeletingN—terminalhydrophobicsequencewasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpGEX一6p一1andtherecombinantplasmidnamedpGEX～6p—dGP5wastransformedintoE．coliBL21．SDS—PAGEindicatedthattilerecombinantfusionproteinwasabout40ku，aftertherecombinantplasmidwasindueedbyIPTG．TheproteindGP5showedastrongimmunologicalreactiontothePRRSV—positiveserainWest—ernblmanalysis?whichmaybehelpfulforthedesignofne＼vvaccines，aswellasthedetectionofantibod—iesagainstPRRSV．Keywords：Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus；GP5gene；prokaryoticexpression