纳米羟基磷灰石基因载体转染机制研究

《纳米羟基磷灰石基因载体转染机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中图分类号QZ昼2UDC610博士学位论文学校代码10533密级公珏纳米羟基磷灰石基因载体转染机制研究StudyonGeneTransfectionMechanismofNanoHvdroxyapatiteV-一作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：刘岩临床医学外科学湘雅三医院朱晒红教授论文答辩日期型主：兰：牛答辩委员会主中南大学2013年5月原创性声明㈣2㈣50咖8删5IIY24本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大

2、学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：、’止秒．知日期：巫年二月』日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。年上月丛日纳米羟基磷灰石基因载体转染机制研究摘要目的：1．模拟体液法合成的羟基磷灰石(HA)纳米

3、颗粒的制备和表征及转染效率的研究。2．纳米HA／pDNA分散稳定性和长期保存方式研究。3．优化和合成基于纳米HA、pDNA和纤维蛋白的三维基因载体系统的体外研究。4．纳米HA／pDNA跨膜及细胞内转运机制的研究。方法：1．在模拟体液法中将K2HP04·3H20与CaCl2按C卯比例为1．67进行配比。反应条件设置为pH值=7．4，温度370C，反应时间为24小时。然后将沉淀烘干后研磨即获得粉末。采用XRD、FTIR、TEM等对获得的纳米HA颗粒进行表征。结合DNA后观察结合DNA的最小使用量和保护DNA不受DNaseI降解的性能。采用传统的水热合成的HA纳米颗粒做对比，研究对HeLa细

4、胞的转染效率。2．在不同的保存温度(40C、250C)和保存时间(2周、3周)下，分别设置经过冻干或未经过冻干的以及经过冻干并加入10％蔗糖及未经过冻干并加入加入10％蔗糖的几组纳米HA／pDNA复合物转染Hela细胞，采用荧光素酶活性测定转染效率。并对颗粒大小采用动态光散射(DLS)分析仪分析。3．将不同比例的纤维蛋白原和凝血酶混合来制备纤维蛋白凝胶，并利用扫描电镜(SEM)对其形貌学观察。再将纤维蛋白凝胶与纳米HA／pDNA复合物结合，转染Hela细胞。采用碱性磷酸酶荧光分析转染后第1、3、5、7天的基因表达效率。4．采用不同浓度的非律平和氧化苯砷(PAO)预先处理Hela细胞，然

5、后再加入纳米HA／pDNA复合物进行转染。采用荧光素酶活性分析转染效率。同时应用MTT法观察非律平和PAO对细胞的活性影响。然后采用流式细胞仪分析细胞摄取的情况。最后应用激光共聚焦显微镜来观察细胞的内吞及胞内转运情况。结果：1．合成的仿生性HA纳米颗粒属于缺钙型羟基磷灰石，Ca／P比为1．658，结晶度略差，平均粒径大小为40．58nm。和人体骨骼成分非常接近。表面带正电，Zeta电位约1．1±0．6mv，在DNA与HA颗粒的质量比为1：30时可以完全结合并有效的保护DNA不被DNaseI降解。较之传统水热法合成的HA纳米颗粒在Hela细胞的转染率上有所改善。2．含有10％蔗糖的纳米H

6、A／pDNA复合体冻干样本在4oc下贮存了2到3周后，转染效率和对照组(转染前新合成的纳米HA／pDNA复合体)无显著性差异，(P>0．05)。而其余各组在贮存了2到3周后转染效率具有不同程度的下降。DLS分析结果显示，含有10％蔗糖的纳米HA／pDNA复合体冻干样本在4oC、25oC下第2周和第3周的大小与对照组无显著性差异，P>0．05。而在其他各组中均发现达到微米级的大颗粒。3．SEM中观察到纤维束厚度在纤维蛋白原／凝血酶比例为0．02纤维束较厚而且不均匀。当纤维蛋白原／凝血酶比例从O．02增加到10．oo的同时观察到纤维束的厚度也增加。基因表达峰值出现在第三天和第五天之间。基因

7、转染中纤维蛋白原／凝血酶比例0．02组基因表达上明显低于后三种凝胶载体。4．非律平处理后的细胞的基因表达水平均有下降。PAO处理后的细胞的基因转染效率也观察到明显下降。非律平和PAO浓度范围内Hela细胞存活率为86～100％。纳米HA／pDNA复合物在Hela细胞中的摄取率约为93％。荧光共聚显微镜下观察纳米HA／pDNA复合物的细胞内吞作用是网格蛋白和小窝蛋白共同介导的。结论：1．利用模拟体液法合成的仿生性HA纳米基因载体可以有效的结合和保