抗莪术醇单链抗体基因的构建及其在大肠杆菌中表达研究

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1、独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得(注i翅没直甚他孟要特别童明的：查拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：0。犀年占月／D曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解桂林医学院有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机

2、构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权桂林医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社、中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》、《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期：04年．6月／口日焉：』‰日目录抗莪术醇单链抗体基因构建及其在大肠杆菌中表达研究⋯⋯

3、⋯⋯l中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英汉缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯_⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8刖舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯苓1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111．2主要实验试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1l1．3主要实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．121．4主要溶液的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131．5引物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．6实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．1杂交瘤细胞总RNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．2RT．PCR法扩增编码抗莪术醇抗体基因片段⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．3抗莪术醇抗体轻链及重链基因克隆，测序，序列分析⋯⋯⋯⋯302．4抗莪术醇ScFv的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．5抗莪术醇ScFv基因的序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．342．6抗莪术醇ScFv在大肠杆菌中表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．342．7抗莪术醇ScFv免疫活性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：．353讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．364结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．44攻读学位期间发表的学术论文目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯⋯⋯54致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55抗莪术醇单链抗体基因的构建及其在大肠杆菌中表达研究中文摘要目的：利用抗体基因工程的方法得到高亲和力的抗莪术醇单链抗体蛋白。方法：利用RT-PCR及分子克隆的技术，从分泌抗莪术醇单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆编码抗体重链及轻链的基因；利用重叠延伸PCR的方法构建抗莪术醇单链抗体基因，并将该基因克隆到大肠杆菌表达载体中；在细菌中诱导表达抗莪术醇单链抗体，并利用ELISA的方法测定抗莪术醇单链抗体与莪术醇的结合能力。结果：利用RT-PCR的

7、方法获得了抗体轻链及重链Fab片段基因，并克隆在了T载体中，长度为620bp左右；测序后序列分析表明我们获得的抗体基因为全新的抗体基因，在GeneBank中没有报道。利用重叠延伸PCR的方法将轻链和重链基因的可变区通过多聚甘氨酸接头连接为单链抗体，所得单链抗体基因长度为750bp左右。利用PCR克隆的方法将单链抗体基因3’末端加入Flag标签序列，并克隆到细菌表达载体pET21a中得到质粒pET21aScFvFlag6XHis(pET21ScFvFH)，测序结果表明基因表达框正确，没有发生突变。将质粒

8、转化到大肠杆菌BL21(DE3)，利用IPTG诱导2小时后，Westemblot检测到ScFv的表达，大约有95％的ScFv蛋白存在于包涵体，5％的ScFv蛋白为有活力的可溶性蛋白，分子量为34KD。利用ELISA检测到ScFv蛋白高特异性抗莪术醇活力。结论：此项研究工作利用基因工程的系列方法，从分泌抗莪术醇的杂交瘤细胞株中成功地构建了抗莪术醇单链抗体基因，并且在细菌中表达出了可溶性单链抗体蛋白，所表达的单链抗体具有高特异性抗莪术醇化合物活力。关键词Sc