抗微囊藻毒素单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定.pdf

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1、高技术通讯年第卷第期：：抗微囊藻毒素单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定!宋丽敏"张维#陈明林敏潘家荣#（中国农业科学院农产品加工研究所北京）（中国农业科学院生物技术研究所北京）摘要利用方法从抗微囊藻毒素（）单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增出抗体的和基因，构建了抗分子的单链抗体（）基因。和分析结果显示，该单链抗体基因在大肠杆菌中特异性表达出分子量约为的融合蛋白。通过金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯化，获得的目的蛋白浓度为。反应结果表明该单链抗体能与特异性结合。此研究为制备多价高亲和力抗抗体奠定了基础。关键词微囊藻毒素

2、（），单链抗体，原核表达，［］测和定量。本研究通过反转录聚合酶链反应引言（）技术从一株分泌抗微囊藻毒素单克隆抗微囊藻毒素（，）是水华发生时体的杂交瘤细胞中扩增出轻链可变区及重链可水体中蓝藻爆发性繁殖产生的次生代谢产物。变区的基因序列，并采用重叠延伸克隆到是一个结构相似的环七肽家族，已知有余种异构完整的单链抗体（）基因，将携带该基因的表达体，其中是目前已知的毒性最强的、急性危载体转化大肠杆菌，获得的重组菌株能产［］害最大的一种淡水蓝藻毒素。它是一种肝毒素，生具有活性的微囊藻毒素单链抗体。本研究为制备这种毒素是肝癌的强

3、烈促癌剂，能导致肝坏死、出血多价高亲和力抗体奠定了基础。［］或凋亡。目前，水体中的检测大多采用高效液相色谱（）、液相色谱质谱（）、气液材料和方法色谱（）等方法，这些方法前处理复杂，所需的仪器设备也较昂贵，因而不适合推广应用。近年来，免!!"材料疫分析法以其价格低廉、灵敏度高、操作简单等众多分泌抗微囊藻毒素（）抗体的杂交瘤细优点，成为检测方法的发展方向和研究热胞株由中国疾病预防控制中心营养与食品安全［］点。然而，传统的单克隆抗体的制备过程较复杂所提供。克隆载体购自公司；表且成本较高，使其应用受到限制。目前世界范围内达

4、载体（）和由本实验室保存。仅有少数几个实验室获得了微囊藻毒素的单克隆抗购自公司。［］体，其他很多酶联免疫吸附试验（）检测多、、连接酶和限制［，］采用多抗。随着生物技术的发展，重组抗体技性内切酶购自公司；反转录酶、术为抗微囊藻毒素抗体的制备提供了一条简单、经和酶抑制剂购自公司；微囊藻济的途径。等从人噬菌体体库中筛选出毒素标准品为美国公司产品；抗原一株抗单链抗体，能够检测出低于世界卫生的合成由北京博奥森生物技术有限公司完成；鼠抗［］组织所规定饮用水标准的指导值（$）。将该抗体和羊抗鼠购自天根公司；法抗体固定在亲和层析介

5、质后用于检测前对水蛋白浓度定量试剂盒购自北京百泰克生物技术有限中痕迹量的进行浓缩，方便了对该毒素的检公司。!计划（）资助项目。"女，年生，博士生；研究方向：食品安全检测技术。#通讯作者，：；（收稿日期：）——高技术通讯年月第卷第期引物表。所有引物序列均由上海生工生物工程技术服引物设计参见文献［］中的描述，引物序列见务有限公司合成。表引物序列引物名称引物序列（划线部分为!位点）（划线部分为!位点）。抗抗体重链和轻链部分序列的克隆及测序加入终浓度为的诱导剂———异丙基硫代半乳从液氮罐中取出冻存的杂交瘤细胞株，复苏糖苷（

6、）于继续培养，进行诱导后用含小牛血清的培养至细胞总表达。离心收集菌体，经超声波破碎并离心后取上清量为，采用试剂盒提取细胞进行电泳，检测表达的蛋白条带。总。以总为模板，采用引物进行反转的检测及其纯化、定量录。然后以为模板，分别用，和经超声波破碎细胞后，分离的上清液用，为引物扩增抗体的重链和轻链基因。纯化和回收可溶性表达产物。以鼠抗抗体为一产物经的琼脂糖凝胶电泳，回收目标抗，羊抗鼠为二抗，用（四甲基联苯片段后，连接到载体，转化大肠杆菌胺）底物显色对表达产物进行检测。。用碱裂解法提取转化子质粒，用酶切和利用法蛋白浓度定量

7、试剂盒对纯化产物进行验证，并进行序列测定，以确定阳性重组定量，并且用软件计算目的蛋白纯度。子中携带所克隆的目标基因。的反应活性测定和的拼接及单链抗体表达载体的构建在孔酶标板中，每孔加入""根据测定的序列重新设计引物、、的，经孵育，洗涤次，用和，以上述提取的质粒为模板，分别扩增出的脱脂奶粉封闭，上述包被的酶标板经洗板和。产物经纯化后，采用重叠延伸拼接后，分别加入"倍比稀释的纯化蛋白提取液，法将和拼接成基因片段。具体过程如经孵育，洗板后，加入"稀释下：首先在没有外加引物的情况下，将纯化的和的鼠抗抗体，再经孵育，洗板后，

8、再加入混匀，反应扩增个循环（，"稀释的羊抗鼠，孵育，）；然后补加和，在同样的，洗板后加底物于显色，用的硫反应条件下，再扩增个循环。扩增获得预期大小酸终止显色，并在波长下测定各孔吸光值。的产物经的琼脂糖凝胶电泳和胶回收后，以转化空质粒的菌株粗提液作阴性对照，抗连接到!和!酶切的表达载体单克隆抗体为阳性对照。每个处理个重复。（）上，将构建的重组质粒转化大肠杆菌。