迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定

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1、迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定作者：秦红，金晓航，黄威权，刘玉林【摘要】目的构建、表达及鉴定迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因。方法采用RTPCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1E11)中克隆出VH和VL可变区基因,再通过重叠延伸拼接PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3，体外构建单链抗体基因；将其克隆至表达载体pET28a并在大肠杆菌中表达，表达产物纯化后，用SDSPAGE、Westernblot及ELASA进行鉴定。结果迟缓爱德华菌抗独

2、特型单链抗体基因scFv在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在，经过溶解包涵体、纯化和体外复性，获得了高纯度的单链抗体片段，重组蛋白的分子质量为27ku。ELASA分析结果证实迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv与原代抗体一样，具有较高的抗原亲和力。结论成功构建了迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv，为进一步制备迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定基础。【关键词】迟缓爱德华菌；抗独特型；单链抗体　　ABSTRACT:ObjectiveToconstruct,expressand

3、identifytheantiidiotypicantibodysinglechainvariablefragment12(scFv)againstEdwardsiellatarda.MethodsByusingRTPCRmethod,thevariableregionsoftheheavyandlightchainoftheantiidiotypicmonoclonalantibody(mAb)1E11againstEdwardsiellatardawereclonedandjoinedwitha(Gly4

4、Ser)3linker,andthescFvintheorientationofVLlinkerVHwasconstructed.ItwasthenclonedintovectorplasmidpET28a,expressedinEscherichiacoliBL21(DE3),andconfirmedbySDSPAGE,WesternblotandELISA.ResultsTherecombinantscFvcouldbeexpressedinE.coliBL21(DE3)inafusionprotein

5、pattern.Theexpressionproductwasintheformofaninclusionbodyandthepurifiedfusionproteinwasobtainedafterbeingpurifiedandrefolded.TheSDSPAGEandWesternblotanalysisshowedthatthemolecularweightofscFvproteinwas27ku.IndirectELISAconfirmedthatthescFvhadthebindingactivit

6、ytotheantigen.ConclusionTherecombinantantiidiotypescFvhasbeensuccessfullyconstructedandexpressedinE.coliBL21(DE3),providingthebasisandpotentialforpreparationofgeneticallyengineeredvaccineagainstEdwardsiellatarda.　　KEYWORDS:Edwardsiellatarda;antiidiotype;sing

7、lechainantibody12　　迟缓爱德华菌(Edwardsiellatarda)是肠杆菌科爱德华菌属中唯一对人有致病性的细菌,并证实其为条件致病菌。该菌含有长度为5.3kb的溶血素基因，其表达产物为一种热不稳定性蛋白质，具有很强的致病性[1]。迟缓爱德华菌感染具有暴发性发作的特点，其原发感染或引起的继发感染，对人或鱼类的致病性均较严重[2]。目前，对该菌的治疗仍然是使用各类抗生素，如在饵料中添加适量的土霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、呋喃唑酮和磺胺类药物等，但抗生素等易产生耐药性和药物残留，对人类的健康带来

8、危害。　　免疫网络学说认为[3]，针对外来抗原的抗体分子(Ab1)可变区上独特型(idiotype,Id)可刺激机体产生相应的抗Id抗体(Ab2)。其中Ab2β具有抗原“内影像”的作用，可模拟抗原诱导机体产生针对始动抗原的特异性抗体或细胞免疫应答，并抑制Ab1与相应抗原的结合反应。针对Ab2β的这一特性，研制的抗独特型抗体可代替抗原刺激机体，通过诱导机体的免