探析富集金属锂微生物菌株的筛选及其富集特性的研究

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天津大学硕士学位论文富集金属锂微生物菌株的筛选及其富集特性的研究姓名：孙建申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：杨冬;陈蓝天20090401 摘要对采集自新疆阿尔泰山脉可可托海锂矿区周边的土壤样品，进行分离、筛选抗金属锂及富集锂的微生物菌株(包括细菌、放线菌、真菌、酵母)。并对筛选所得细菌菌株进行形态学鉴定、金属锂耐受性、金属锂富集能力和富集培养条件进行了研究。经分离筛选得到一株可在3000mg·L叫锂浓度下存活的芽孢杆菌，编号为NAl。初步研究表明，该菌对金属锂具有很强的抗性和富集能力。对NAl菌株金属锂耐受性进行研究，结果表明，NAl在液体培养时，培养基初始锂浓度在3．05mg·L。1以下时对其生长无抑制作用，当锂浓度达至tJl06．8mg·L-1时有较大影响，菌体生长基本停止：对冷冻干燥和烘干干燥两种预处理方式对菌体富集锂的影响进行了研究，研究结果显示，此两种预处理方式对菌体富集金属锂的影响非常有限；对NAl摇瓶发酵条件进行了优化，结果表明，在30"C，pH6．0，摇床转速120r／min条件下培养72h，每克干菌体金属锂富集量可达329．69mol。本研究为细菌富集金属锂提供了新的材料来源和相关信息，为利用微生物进行盐湖卤水提取(回收)锂奠定了一定基础。关键词：微生物；锂；筛选；富集；抗性 ABSTRACTMicrooganism(includingbacterium，actinomycete，fungi，andyeast)wereisolatedandsereened五旧msoilsampleswhichcollectedfromsurroundingareaofKeketuohaiLithium．diggingsinAltai，Xinjiang．Atthesametime，themorphology,lithiummetaltole瑚mcc．1ithi啪．microbialaccumulationandenrichmentcultivateconditionsoftheisolatedbacteriumwereinvestigated．oIleS仃咖ofbacilluswhichcouldsurvivalwith3000rag。L-1concentrationoflithiumw鹞designatedNA1．Investigationshowsthatithashighabilityoflithiumresi啦mce觚d∞cumulation．TheresultsofLithiumresistanceexperimentofNAlshowthatitcallgrowthwithoutinhibitionintheinitiallithiumconcentrationof3．05mg'L一1orbelow,butcellgrowthstoppedwhenthelithiumconcentrationachleVed106．8mg．L-1．Wealsostudiedtheinfluenceofpre-treatmentmethodsoffreeze‘dryinganddryingonlithiumaccumulationofthecell．Resultsshowthattheeffectwas．Vcrylimited．Atthes锄etime，thefermentationconditionsofNA1werealsooptimized，the佗sultsshowthatundertheoptimalcultureconditionsof30"C，pH6，shakingSpeed120r／min，cultivated72h，thecontentoflithium—richreachamount329·6岬oIeverygramdrymass．Thisstudyprovidesnewmaterialandrelatedinformationforlithiumconcentrationofbacteriaandlaysthefoundationforextract(recovery)oflithiumbytheuseofmicroorganismsfromSaltLakebrine．KeyWords：microorganisms；lithium：screening；accumulation；resistance 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁注盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：碰签字日期：工‘，罗年么月厂日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解墨鲞苤鲎一有关保留、使用学位论文的规定。特授权墨盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名：鼍p』垒～导师签名：书冬签字日期：O-扩厶9年么月厂Et签字日期：必口绰么月,r'-Et 前言刖吾极端环境通常是指普通微生物不能生存的环境条件，如高温、低温、高盐、高压、高或低的pH、含抗代谢物、有机溶剂、重金属及有毒有害物等，能在极端环境中生长的菌即嗜极菌(ex—tremophiles)。由于其特殊的生理机制，在环境保护中具有极大的应用价值。锂在地壳中约含0．0065％，其丰度居第27位。海水中大约2600亿吨锂。人和动物体内也有极少的锂存在，体重70公斤的正常人体中，锂的含量为2．2毫克。目前自然界已发现含锂矿石达150多种。锂在自然界中存在的主要形式为锂辉石(LiAlSi。0。)、锂云母[Li：(F，0H)：A1(SiO。)。]等。锂及其化合物在能源工业、金属冶炼及制造业、航空航天工业、石油工业、电器电子工业等部门具有重要的用途，被誉为“推动世界进步的重要元素”。应用微生物吸附和富集金属始于20世纪七、八十年代。传统处理金属的方法多为物理化学法，如化学沉淀法、离子交换法、反渗透法、萃取法、活性炭吸附法等。这些方法虽然各有优点，但不同程度地存在着投资大、能耗高、操作困难、易产生二次污染等缺点。生物修复技术因其具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到人们的广泛关注。其中，利用微生物进行金属修复是研究中的一个热点。微生物从溶液中分离金属离子的机理主要有以下几种：(1)胞外富集／沉积。(2)细胞表面吸附或络合，(3)胞内富集。其中细胞表面的吸附和络合对死活微生物都存在，而胞外和胞内的大量富集则往往要求微生物具有活性i在一个吸附体系中，可能会存在上述一种或几种机制。新疆处于我国的大西北，具有得天独厚的自然条件和丰富的生物多样性，从富含锂的可可托海锂矿区分离、筛选高抗锂和富集锂的微生物菌株，研究其吸附锂的特性，及其与锂的相互作用。由于从海水、盐湖卤水中提锂具有资源丰富、耗能少、成本低等特点，并鉴于锂及其化合物的特殊性能和应用价值，所以从盐湖卤水利用微生物吸附方法提取(回收)锂必将成为人们关注和研究的重要领域。 第一章文献综述1．1锂的性质及用途锂(1ithium)位于化学元素周期表第一主族，原子序数3，银白色的金属。熔点为180．54。C，沸点1342。C，密度0．534克／厘米3，自然界中最轻的碱金属，1817年由瑞典化学家贝齐里乌斯的学生阿尔费特森在分析透锂长石矿时发现。可与大量无机试剂和有机试剂发生反应。是唯一能生成稳定得足以熔融而不分解的氢化物的碱金属，与氧、氮、硫等均能化合，是唯一的与氮在室温下反应，生成氮化锂(Li3N)的碱金属。由于易受氧化而变暗，锂只能存放在凡土林或石蜡中。在自然界中，主要以锂辉石和锂云母及磷铝石矿的形式存在⋯。锂与其它碱金属不同，在室温下与水反应比较慢，但能与氮气反应生成黑色的一氮化三锂晶体。锂的弱酸盐都难溶于水。在碱金属氯化物中，只有氯化锂易溶于有机溶剂。锂的挥发性盐的火焰呈深红色，可用此来鉴定锂。金属锂作传热介质，能简化释热元件的结构，减小系统的体积和重量，是理想的热载体拉1。在冶金工业上，锂很容易与氧、氮、硫等化合，做脱氧剂。在铜的冶炼过程中，加入十万分之一到万分之一的锂，能改善铜的内部结构，使之变得更加致密，从而提高铜的导电性。lkg锂燃烧后可释放42998kJ的热量，因此理是用来作为火箭燃料的最佳金属之一。lkg锂通过热核反应放出的能量相当于二万多吨优质煤的燃烧。若用锂或锂的化合物制成固体燃料来代替固体推进剂，用作火箭、导弹、宇宙飞船的推动力，不仅能量高、燃速大，而且有极高的比冲量，火箭的有效载荷直接取决于比冲量的大小。在玻璃组分中添加锂，作为强有力的助熔剂，以降低操作温度，进而减少折射损失，延长容器寿命。目前锂换可用于制作低热膨胀玻璃纤维、整体封装玻璃和高档化妆品容器。锂在原子能工业上的独特性能，人们称它为“高能金属”。6Li捕捉低速中子能力很强，可以用来控制铀反应堆中核反应发生的速度，同时还可以在防辐射和延长核导弹的使用寿命方面及将来在核动力飞机和宇宙飞船中得到应用。6Li在原子核反应堆中用中子照射后可以得到氚，而氚可用来实现热核反应。6Li在核装置中可用作冷却剂。锂电池是本世纪三、四十年代才研制开发的优质能源，它以开路电压高，比能量高，工作温度范围宽，放电平衡，自放电子等优点，已被广泛应用于各种领域，是很有前途的动力电池。用锂电池发电来开动汽车，行车费只有普通汽油发2 第一章文献综述动机车的1／3。由锂制取氚，用来发动原子电池组，中间不需要充电，可连续工作20年。目前，要解决汽车的用油危机和排气污染，重要途径之一就是发展向锂电池这样的新型电池。锂化合物早先的重要用途之一是用于陶瓷制品中，特别是用于搪瓷制品中，锂化合物的主要作用是作助熔剂。LiF对紫外线有极高的透明度，用它制造的玻璃可以洞察隐蔽在银河系最深处的奥秘。锂玻璃可用来制造电视机显像管。用氘化锂和氮化锂来代替氘和氚装在氢弹里充当炸药，达到氢弹爆炸的目的。我国于1967年6月17日成功爆炸的第一颗氢弹里就是利用氘化锂。LiBH4和LiAIH4，在有机化学反应中被广泛用做还原剂，LiBH4能还原醛类、酮类和酯类等。LiAIH4，是制备药物、香料和精细有机化学药品等中重要的还原剂。LiAIH4，也可用作喷气燃料。LiAIH4是对复杂分子的特殊键合的强还原剂，这种试剂已成为许多有机合成的重要试剂。有机锂化合物与有机酸反应，得到能水解成酮的加成产物，这种反应被用于维生素A合成的一步。有机锂化物加成到醛和酮上，得到水解时能产生醇的加成产物。锂作为轻合金、超轻合金、耐磨合金及有色合金的组成部分，能大大改善合金性能。锂铝和锂镁合金是导弹、火箭、飞机、卫星和飞船的理想结构材料b3。锂的化合物如氯化锂和氟化锂，用作金属或合金焊接的焊剂或助熔剂。溴化锂、氯化锂、氢氧化锂广泛用于空调、除湿、制冷和空气净化系统。锂电池H1广泛用于心脏起搏器、台式或袖珍计算机、电子手表、助听器、摄像机、闪光灯、磁带录音机等方面。其它锂盐，如：硝酸锂、硅酸锂、磷酸锂、钛酸锂、钼酸锂、锰酸锂、铬酸锂等，用途主要包括焰火信号弹、炼钢、显像管、二次锂电池原料和溴化锂溶液的缓蚀添加剂等。锂盐可治疗癫狂病，动脉硬化性心脏病的发病率哺1。锂基润滑脂兼有高抗水性，耐高温和良好的低温性能阳1。在冶金工业上，利用锂能强烈地和0、N、C1、S等物质反应的性质，充当脱氧剂和脱硫剂等催化剂口1。在现代需要的优质特殊合金钢材中，锂是清除杂质最理想的材料。Li—Pb合金是一种良好的减摩材料隋3。锂化合物用于搪瓷制品中的主要作用是作助熔剂睛1。80年代中期以前，世界各国主要开发伟晶岩锂资源，以锂辉石为原料生产锂盐，主要生产国有美国、智利、德国、原苏联和中国，美国一直是世界最大的锂盐生产国、消费国和出口国，在世界锂产品市场上处于垄断地位，控制着60％左右的世界锂盐市场。随着南美洲智利的阿塔卡玛和阿根廷的翁布雷穆埃尔托等巨大盐湖的开发，世界锂资源产量迅猛增长。锂市场大体上是供过于求的，但是由于卤水提锂工艺流程简单和生产成本低廉，该地区的锂业公司以最低的价格打入 第一章文献综述供过于求的锂盐市场，成为世界锂市场的主要生产者，使世界传统锂资源的供求型发生了重大的变化，地域上，从以北美供应为主转移到南美为主，从资源上来看，以开采高成本的伟晶岩矿为主转向从盐湖卤水中提取低成本的锂资源。1．2盐湖卤水提取锂方法及其工艺近年来，随着锂电池技术的发展n仉111，锂的消费量逐年攀升，并以每年7％～11％的速度增长。自然界的锂资源主要赋存于海水、盐湖卤水、地热水和花岗伟晶岩型矿床中，其中矿石中锂的储量不足总储量的3％¨引，而盐湖卤水中锂的含量较高，资源丰富，目前己成为国外公司开发生产锂盐的主攻方向n31。近年来中国虽然也在积极开发盐湖锂资源，但目前产品仍以矿石生产为主，生产成本高(超过智利的2倍)，没有市场竞争力。因此，研究低成本卤水中锂的提取技术，积极开发中国丰富的盐湖卤水锂资源具有重要的经济价值。1．2．1沉淀法’沉淀法原理：利用太阳能将含锂卤水在蒸发池中自然蒸发、浓缩、制盐，然后通过脱硼、除钙、镁等分离工序，使Li存于老卤中，当锂含量达到适当浓度后，以碳酸盐、铝酸盐或碱石灰与氯化钙的混合物为沉淀剂或盐析剂，使锂以碳酸锂的形式析出n如151。也有直接降低温度沉淀锂盐的报道n61。碳酸盐沉淀法是将工业纯碱Na。C0。作为沉淀剂加入浓缩的盐湖卤水中，使锂以碳酸锂形式析出。美国西尔斯湖银峰锂矿及智利阿塔卡玛盐湖都采用此方法开发Li：C03产品。我国自贡张家坝化工厂和正在开发中的西藏的扎布耶盐湖也采用这一技术从生产钾盐后的老卤中提取Li：CO。产品nq。该法适于处理低镁锂比的盐湖卤水，对于镁锂比值高的卤水(如察尔汗盐湖和死海)，提锂之前必须除镁，而除镁工序常需消耗大量的碱类物质，成本较高。铝酸盐沉淀法是先制取A1(OH)。，将制得的Al(0H)。按一定的铝锂重量比加入提硼后的卤水里沉锂除镁，将得到的铝锂沉淀物煅烧。室温下在水中浸取，使沉淀物中的铝锂分离，再用石灰乳和纯碱除去钙、镁等杂质，蒸发浓缩后，加入碳酸钠溶液进行反应，生成碳酸锂，锂的收率8．7％，Li：C0。产品纯度可达到98％以上。该工艺的优点是收率和纯度较高，不足之处是碳化液及焙烧浸取液需要蒸发大量的水，能耗高且工艺流程复杂。总之，该法将锂作为副产物进行回收，工艺技术较为成熟，可靠性高¨"。美国Searles及我国四川自贡都采用沉淀法提锂。但此法不适用于含大量碱土金属的卤水及锂浓度低的卤水。1．2．2离子交换吸附法吸附法是利用对锂离子有选择性吸附的吸附剂来吸附锂离子，再将锂离子洗脱下来，达到锂离子与其它杂质离子分离的目的。吸附法更适合于从高镁锂比的4 第一章文献综述卤水中提取锂，因此其更具有发展前景，根据吸附剂的性质可分为有机系吸附剂和无机系吸附剂。无机吸附剂有高价无定型磷酸盐，如磷酸钛，磷酸锡和磷酸锆等，适合于从中性或酸性溶液中吸附锂，吸附容量分别为0．30，0．15和0．09mg／g：水合SnO：，无定型Al(OH)。，NaAlO：，AICl。等适合于从海水、卤水、地下水中回收锂。离子交换剂有大孔弱碱性阴离子交换树脂或大孔强碱性阳离子交换树脂。水合TiO：和钛酸也可以作锂离子的无机阳离子交换剂，在pH>12时，锂选择性地吸附于吸附剂上，用1m01／LHN0。或0．5mol／LHCl淋洗，锂可浓集78．5倍；用0．2mol／LLiOH吸附和0．5mol／LHCl淋洗，经30个循环后，H2Ti。0，中的锂只有0．18％流失。二氧化锰离子筛也可用于从海水和卤水中选择性吸附锂。从海水中吸附锂时，pH在8左右，碱金属的吸附次序为K+12)，使M92+以Mg(OH)。沉淀，再通入C0：，使溶液的pH保持在中性或弱碱性，使Ca2+以碳酸钙沉淀，在此pH下，避免了Li。C0。沉淀的生成。中国地质科学院盐湖中心对西藏扎布耶盐湖锂资源采用擦洗分离水浸碳化热解制取碳酸锂的新工艺，得到的碳酸锂精矿品位76．86％，锂回收率72．91％。该法易于实现工业化，有连续化，有生产成本低、产品质量好等优点口61。1．2．7选择性半透膜法该法采用物理手段进行提锂，是非常绿色的工艺技术，也是盐湖提锂的一个新的研究方向。国内马培华等他71将含锂的盐湖卤水蒸发，通过一级或多级电渗析器，利用一价选择性离子交换膜进行循环(连续式、连续部分循环式或批量循环式)浓缩锂，获得富锂低镁卤水。然后通过深度除杂、精制浓缩，便可制取Li。C0。或LiCl所需的原料。该法可使Li+的回收率超过80％、多价阴阳离子的脱除率超过95％，分离浓缩得到Li+浓度为2一--209Li㈨。1．2．8其它分离方法美国钾碱和化学公司从Searles盐湖卤水中回收锂采用浮选法，做法是在煮解三效蒸发过程中析出的复盐时，有许多溶解度较小的锂盐悬浮于溶液中，煮解液送入浮选槽，加入起泡剂浮选这些锂化物，得到主含磷酸锂钠的精矿，精矿经浓硫酸分解后制取磷酸和碳酸锂，锂的作业收率为88％，浮选法通常比结晶分离法收率高20％左右。1．3国内外盐湖卤水资源及其开发现状盐湖卤水提锂发展至今已有20年左右的历史。由于盐湖卤水提锂工艺简单、能耗低、成本低，如此显著的优势，使盐湖锂资源的开发倍受青睐。l-3．1国外盐湖卤水资源及其开发现状国外利用盐湖卤水进行锂盐开发利用的有：美国的西尔斯(Searles)湖、银峰(SilverPeak)地下卤水、玻利维亚乌尤尼(Uyuni)、阿根廷的翁布雷穆尔托 第一章文献综述(HombreMuerto)盐沼和智利阿塔卡玛(Atacama)盐湖等。锂储量大但尚未生产的有：美国的大盐湖(TheGreatSaltLake)、前苏联的卡拉博加斯海湾、以色列和约旦的死海(DeadSea)及玻利维亚的乌尤尼(Uyuni)盐沼等心叭。1．3．1．1美国的西尔斯湖阳仉3¨．美国的西尔斯湖位于加利福尼亚州东部干旱地区是一个于盐湖，该盐湖面积约lOOkm2，海拔512m，年均降雨量与蒸发量比例在1／20左右，卤水年均蒸发量为960mm左右。该湖的氯化锂净储量约26．6万t，是世界上第一个进行工业化生产锂盐的盐湖，早在20世纪30年代，美国钾碱化学公司就从该盐湖卤水中回收磷酸锂钠供应市场。1951年，凯尔马基(Kerr-McGee)公司开始由磷酸锂钠转为碳酸锂生产，年产量为750t～1200t，该公司其化工生产工艺流程是以水盐体系相图理论为依据，采用三效蒸发分离各盐类，再经一系列加工，加工成产品。由于用该法生产的碳酸锂缺乏与银峰产品竞争优势，该公司于1978年后停止生产。1．3．1．2美国的银峰盐湖美国的银峰盐湖位于内华达州，面积32km2，该地气候干燥，年降雨量230mm，蒸发量年均1800mm，卤水含锂0．016％，由塞普路斯福特公司(CyprusFoote)开发并生产碳酸锂。该公司利用地下卤水在日晒池中自然蒸发浓缩，使锂达到一定浓度后m1，用碳酸钠沉淀出碳酸锂。1964年碳酸锂年产达2250t，经两次扩建后生产能力达7300tPa，1998年4月，该公司被德国的一家专用化学品公(Chemetall公司)兼并。现在该公司在银峰和阿塔卡玛盐湖都有加工厂生产碳酸锂，但该公司卤水提锂开发的重点已转向阿塔卡玛盐湖，其碳酸锂销量曾占市场18％。1．3．1．3智利阿塔卡玛盐湖阿塔卡玛盐湖位于南美洲智利北部，海拔2300m，年均降水量20mm--一50mm，年均蒸发量3300mm以上。该盐湖是一个巨大的干盐湖，面积2900km2，盐类沉积面积达1400km2，在盐类沉积中富含晶间卤水，其深度达0．6m，是一种富含硼、锂的硫酸盐型卤水。现在主要由智利锂公司(塞普路斯福特公司分支机构)和敏撒尔(Minsal)公司(SQM子公司)开发。1984年，智利锂公司就开始用该盐湖卤水生产碳酸锂，1989年生产能力为6800t，1990年达11800tPa，1995年其加工出口的碳酸锂达12600t∞羽，其副产品钾盐全部出售给SQM公司。智利锂公司目前进行加工方法是将除去镁和硫酸根后的母液蒸发浓缩到一定浓度后，用碳酸钠沉淀出碳酸锂产品。敏撒尔公司对阿塔卡玛盐湖的资源勘查和开发研究始于1986年，该公司在开发盐湖时把钾碱作为卤水提取的主要产品，碳酸锂作为副产品，同时回收卤水中的硼，使卤水中的生产成本大大降低阳31。2003年，该公司已有年产碳酸锂2．8万t的生产能力，其产量占世界总产量的30％，销售份额占国际碳酸锂市场的40％， 第一章文献综述销售至,Jso多个国家。1．3．1．4阿根廷翁布雷穆埃尔托盐湖阿根廷翁布雷穆埃尔托盐湖位于阿根廷西北部，海拔4300m，盐盆直径40km，日光蒸发强烈，年均蒸发在2300皿n左右，降雨量在70砌左右。卤水含锂0．02％0。2％，平均含锂0。065％，杂质含量极低，镁含量也较低，可开采深度至少30m。该盐湖由芝加哥食品机械有限公司(FMC)进行开发，从1991年开始开发，1996年11月正式投产，1997年产品投入市场，每年生产锂盐达1．8万t，20世纪末，碳酸锂的生产能力达2．2万tPa曲引。该公司其生产工艺是采用公司自己的专利工艺——选择性净化吸附法，直接从卤水中提取氯化锂、碳酸锂和其它盐类产品，但核心内容未见报道。1．3．1．5玻利维亚乌尤尼盐沼乌尤尼盐沼(SalardeUyuni)是玻利维亚最大的盐沼。在波托西省西部高原内，海拔3600m。从1990年以来FMC公司己耗资600万$进行勘探和开发可行性研究确定的锂储量为890万t，‘属世界大型锂矿床之一，按计划生产能力为7000tPaLEC(碳酸锂当量)并规划40年的开采期限内最大开采量40万t锂，但由于税收方式、开发期及产品价格未能协调，后期开发至今未见报道陋‰圳。1．3．1．6美国大盐湖大盐湖位于美国犹他州的西北部，属于典型硫酸盐型盐湖。面积达3800km2，该湖湖区最高温度40．6"C，最低温度-32．2"C，全年平均气温约10℃。美国大盐湖矿物化学公司以卤水为原料，形成年产钾盐45万t(其中硫酸钾20万t)，硫酸钠20万t，氯化锂3600t(锂浓缩卤水中镁锂比高，曾计划生产，但未实现)，硼砂4500t，溴3600t生产规模的综合利用化工基地。其盐田生产工艺是利用复杂的水盐体系相平衡关系，分步获得所需的混合盐，再进一步加工成各种产品。1．3．2国内盐湖卤水资源及其开发现状我国是一个锂资源大国，已探明的锂资源工业储量仅次于玻利维亚，约占世界的盐湖锂资源的1／3。我国锂资源主要赋存于盐湖卤水中，卤水锂占79％，仅青海和西藏盐湖卤水锂的远景储量能与世界其他国家已探明的总储量相当，是全球重要的锂资源之一。主要分布于青海柴达木盆地的大柴旦湖、一里坪湖、东台吉乃尔湖、达布逊湖、察尔汗盐湖等多个盐湖及西藏扎布耶湖、扎仓茶卡湖等15个盐湖。1．3．2．1扎布耶盐湖扎布耶盐湖位于青藏高原岗底斯山脉北麓，海拔4422m。湖区蒸发量9 第一章文献综述(2423mmPa)与降水量(121mmPa)比为20：1，年均气温为1．4℃，年均日温差12℃，年日照时数达3100h。镁／锂比为0．003---0．01，其固相沉积物中就含有天然碳酸锂，与国内外各大盐湖卤水相比，扎布耶盐湖卤水具有明显的资源优势。除了固相的硼砂、芒硝、石盐等外，卤水中富含锂、硼、钾、铷、铯、溴等多种元素。1982年，郑绵平院士就在西藏扎布耶盐湖建立世界最高科学观测站，通过多学科的综合研究，利用西藏扎布耶盐湖高寒、日照强等优势环境条件，首创了适合我国国情的冷冻、热晒、梯度太阳池的低成本提锂新工艺。日前已生产出600t锂混盐，并建成了一条年产7128t75％碳酸锂精矿的生产线，年产5000t锂盐生产线已投料试车，该项目是目前我国盐湖卤水提锂生产规模最大的工程项目，它的建成标志着我国盐湖提锂工艺取得了成功突破∞51。1．3．2．2班戈湖—牡佳里盐湖区班戈湖一杜佳里盐湖区位于藏北东部，海拔高约4520m，年均气温低，年日照时数长(2994．3h)，年蒸发量与降水量比为7．26：1，氯化锂储量达50万t，镁／锂比低(约1．28)，属中度碳酸盐型盐湖，LiCl约为430mgPL，远高于工业生产品位要求。中国地质科学院矿产资源研究所已对该盐湖的锂资源做了调查和提取技术的探索，·并在班戈湖建立了长期观测站和锂资源提取试验基地，初步探索和总结出了锂富集的基本思路，完成了400m2盐田放大试验汹11．3．2．3东台吉乃尔盐湖东台吉乃尔盐湖位于青海柴达木盆地的西北部，海拔2700m，气候干燥、降水量小(30．24mmPa)、蒸发量大(2649．6tamPa)、风速高、风期长、平均气压低。该盐湖属于硫酸镁亚型盐湖，卤水中锂、硼离子的含量较高，但卤水中镁的含量较高，提锂技术相对较复杂。中国科学院青海盐湖研究所的盐湖工作者已进行了多年的探索和攻关，在卤水提锂技术方面取得了突破性的进展，继2000年“东台盐湖锂矿年产50t碳酸锂试验”后，2001年又完成了lOOt碳酸锂工业性试验，使中国典型的高镁锂比盐湖卤水提锂技术难题获得突破，其提锂工艺流程简单、合理，经专家论证，中国卤水提锂技术经济指标属于世界先进水平。在此为基础的“青海盐湖提锂及资源综合利用”的产业化示范生产项目正在建设之中，该项目建成之后，将形成年产能力为碳酸锂3000t、硫酸钾2．5y／t和硼酸2500t口7棚】。1．3．2．4藏北盐湖区藏北盐湖区属于硫酸盐型盐湖，比较典型的富锂盐湖有西部的扎仓茶卡和东部的鄂雅错、比洛错。扎仓茶卡属硫酸镁亚型盐湖，卤水中Mg／Li比为17．4(晶间卤水)---15．96(表卤)。甘肃省科学院自然能源研究所的邹今平根据扎仓茶卡卤水的平均化学成分配制模拟卤水，经多种工艺条件实验制备碳酸锂，总结出了工艺lO 第一章文献综述流程，该流程生产的碳酸锂的纯度达88％"--90．1％，锂回收率约达30％阳引。但关于该湖锂资源进一步开发工作未见报道。鄂雅错与比洛两个盐湖前者属硫酸镁亚型，后者为硫酸钠亚型。郑绵平院士等人进行了有关锂资源提取技术的研究并于2001年组织有关科技人员进行了小规模的天然蒸发对比实验(夏卤)。对如何实现镁锂分离及生产碳酸锂产品，现已有初步设想。1．4微生物富集金属应用微生物富集金属在20世纪七、八十年代已经陆续有人研究，但大部分工作则是在九十年代以后开展，研究重点包括：微生物吸附体的筛选及吸附特性研究，对重金属的富集与抗性机制，以及对重金属的固定或活化作用。Pethkar等H∞用经过处理的家禽羽毛处理包埋芽枝状枝孢(C]adosporiumcladosporiodies)所制备的固定化细胞可以吸附Au3+；Akthar等用碱处理的黑曲霉(AspergiIlusniger)菌体可有效地从稀银溶液中回收AgH¨。国内也报道过刘月英等m1、傅锦坤等H钉利用微生物菌体吸附金属离子的研究。1991年的Nature杂志就公布了美国学者Lovley等有关微生物还原六价铀的实验研究结果H制。微生物富集技术的应用为金属的生物修复提供了新的途径，然而这种技术也面临着两大问题：一是微生物富集金属的机理研究；二是在自然界条件下的实际应用问题。国内外学者针对微生物富集金属的机理，已从亚细胞角度、生理生化角度、分子生物学角度开展了广泛的研究；而针对微生物富集技术应用于金属的生物修复方面的研究较少，而且研究结果还存在一定的不确定性。因此，一方面仍然需要做大量的野外试验以获得准确的试验参数来验证室内试验的结果，以期微生物修复技术的推广；另一方面，将微生物修复技术与其它环境修复技术进行有效的集成，可为环境的生物修复提供更为有效的技术支持。1．4．1微生物与重金属的相互作用H鄹1．4．1．1微生物与重金属的固定作用1．4．1．1．1吸附作用吸附作用一般指活的和死的微生物菌体都能进行的被动吸附过程，生物吸附机理主要有静电吸附、离子交换、络合和氧化还原等作用m3。重金属离子主要积累在细胞壁上，细胞壁主要由甘露聚糖、葡聚糖、蛋白质和几丁质组成，富含羧基阴离子和磷酸阴离子，很容易与金属发生反应，因而金属很容易结合到微生物的表面。细胞壁带有负电荷而使微生物表面呈现阴离子特性，通过微生物细胞中均聚物或杂聚物上的羰基或磷酰基等阴离子作用可以增加金属离子的吸附。此外，细胞壁中的分子结构也具有活性，可以将金属螯合在细胞表面，这些多糖中 第一章文献综述的离子能与溶液中的二价金属离子交换。例如：海洋藻类中的褐藻细胞壁中的藻酸盐，含有K+、Nat、Ca2+或M矿+，这些离子能与溶液中的c02+、cu2+、Cd2+、zn2+交换，结果溶液中的金属离子被吸附到细胞壁上H71。1．4．1．1．2络合作用一些微生物如动胶菌、蓝细菌、硫酸盐还原菌以及某些藻类，能够产生胞外聚合物，如糖、糖蛋白和脂多糖等，具有大量的阴离子基团，可与金属离子结合。有些细菌、真菌、蓝细菌和藻类在限定铁的条件下，产生一些低分子量的铁载体(siderophores)，能与铁、铝、铜、铀、钍等金属结合。1．4．1．1．3胞外沉淀在厌氧条件下，硫酸盐还原菌及其它微生物可在胞外形成CdS沉淀H81。许多微生物通过依赖或不依赖代谢的作用，能够将多种金属转化成为沉淀物的形态㈨。还有的微生物可通过产碱来提高环境pH值从而促进重金属沉淀物的形成m3。1．3．1．1．4胞内积累金属进入细胞后i通过“区域化作用”分布在细胞内的不同部位。近年来，国内学者加强了对胞内金属硫蛋白(MT)的研究。该蛋白的基本特征：低分子量(2000"---10000)富含半胱氨酸，能够结合铜、镉、锌等重金属。1．4．1．2微生物对重金属的活化作用有些微生物，如曲霉∞¨，可以产生有机酸而增强重金属的可溶性，还有一些微生物可以通过降解重金属络合物，如EDTA魄3、柠檬酸喵砌等，释放重金属离子。1．4．1．3微生物的转化作用微生物作用可以改变重金属离子的活动性，从而影响重金属离子的生物有效性。在自然条件下，很多微生物可通过氧化～还原作用、甲基化作用和脱烃作用等将重金属离子转化为无毒或低毒的化合物形式。White等(2001)利用锌的超富集植物，结合植物根际细菌用于土壤锌污染的修复。结果表明，锌得到明显的活化，提高了植物对锌的富集能力。由此可见，研究和应用具有耐性植物根际细菌可为金属污染土壤的植物修复提供更佳的方案。微生物作用转化重金属离子的主要方式有以下3种：(1)通过微生物对重金属的主动与被动堆积作用而使重金属得以在体内富集。一些重金属(特别是汞、镉、铅、铬等)在水体中不能被微生物降解，而只能发生各种形态相互转化和分散、富集过程，如无机汞在底泥中厌氧细菌的作用下，可转化为毒性更强的甲基汞，而甲基汞又可通过食物链在生物体内富集，最后进入人体m】。12 第一章文献综述(2)通过微生物的金属转化作用，如氧化一还原作用或烷基取代作用等，而使重金属从一种形态转化为另一种形态。有些微生物，如嗜酸铁氧化细菌(氧化亚铁硫杆菌、氧化亚铁钩端螺旋杆菌等)能够氧化Fe2+、还原态的S(如H：S、S：0。2一等)和金属硫化物来获得能源，影响许多金属的活动性。除了通过氧化金属离子外，微生物还可把一些重金属还原成可溶性的或挥发性的形态，如有些微生物可把难溶性的Pu还原成可溶性的Pu针，把H92+还原成挥发性的Hg，铁锰氧化物的还原也可把吸附在难溶性Fe3+、Mn4+氧化物上的重金属释放出来㈣。(3)微生物能够产生影响重金属活性的物质，如微生物新陈代谢过程中产生的简单有机化合物、大分子腐殖酸和富里酸或其它分泌物等都能络合环境中的重金属离子，从而实现不同重金属离子形态间的转化。Chanmugathas和Bollag报道，在营养充分的条件下，土壤微生物代谢活跃，促进了对镉的转化嘟1。Kurek和Bollag比较了在不同碳源条件下微生物对重金属的溶解，发现以土壤有机质或土壤有机质加麦秆作为微生物的碳源时，微生物并不促进铅、镉、锌、铜等重金属的溶解；如果同时加入葡萄糖作为碳源，经过一段时间后，不灭菌处理的淋洗液中重金属离子的浓度显著高于灭菌处理∞71。微生物能够通过氧化还原、甲基化和去甲基化作用转化重金属使其呈不同的价态或化合态而改变其毒性。例如：别样单胞菌(A1teromonasputrefaciens)可以将U(VI)还原成U(IV)，大肠杆菌(￡coli)、金属还原菌(Shewanellaputrefacier)还原Np5+至lJNp4+障引，硫还原菌(DesuJfovibriodesu]furicans)将Pd2+还原成Pdo嵋引，火杆菌(Pyrobaculumislandicum)将U(vi)还原成U(IV)，将Tc7+还原为Tc州删，奇异球菌(Deinococcusradiodurans)还原Tc7+、Cr6+、U(VI)等到低价哺¨，罗尔斯通氏菌(Ralstoniametallidurans)将Se4+还原成Se毗训，假单胞菌(Pseudomonadsp．)将Cr6+还原cr州训。1．4．1．4菌根与金属的相互作用菌根是土壤中的真菌菌丝与高等植物营养根系形成的～种联合体，具有很强的酸溶和酶解能力，菌根根际分泌物及菌际提供的微生态环境使菌根根际维持较高的微生物种群密度和生理活性，从而促进植物生长。同时，菌根真菌的活动可改善根际微生态环境，增强植物抗病能力，极大地提高植物在逆境(如干旱、有毒物质污染等)条件下的生存能力m3。Bradley哺司等在调查英国铜(锌)矿区植物时发现，植物非常稀疏，少量生存的植物中多为石楠菌根植物，且与非菌根植物相比较生长好。自此以后，许多国家的研究人员对菌根在重金属修复的作用展开了广泛的研究。菌根真菌对于重金属植物修复的作用主要有以下几个方面： 第一章文献综述(1)菌根真菌通过分泌特殊的分泌物等形式改变植物根际环境，改变重金属的存在状态，降低重金属毒性。Heggo等汹3发现，菌根真菌能通过改变土壤pH值和分泌物成分来减弱重金属的生物有效性。Liao等哺73在研究莴苣对铅的吸附中发现，用GC(气相色谱法)对含有不同重金属浓度的菌根真菌培养物进行分析，发现草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等有机酸随着重金属浓度的增加而增加，这可能是真菌利用这些有机酸降I'L毛pH值，与重金属结合进而富集重金属的结果。所有这些研究成果表明了菌根能促进菌根植物对重金属的富集。(2)菌根真菌能影响菌根植物对重金属的积累和分配，使菌根植物体内重金属积累量增加，提高植物的富集效果。国外学者研究发现，在锌、镉和镍污染的土壤或尾矿库上接种菌根真菌后，苜蓿(Medicagosativa)、黑麦草(LoliumperennD和自车轴草(TrifolYumrepens)等植物对重金属的耐受性增强，能获取更多的营养成分，这就可以很好地应用于植物修复∞蛳1。(3)在菌根植物对重金属的吸收或运输、迁移或积累等过程中，AM(Arhusclarmycorrhiza)真菌很可能参与调控这些相关功能基因的表达。在重金属胁迫条件下，AM真菌侵染的豌豆(Pisumsativum)、西红柿(Lycopers]conescu]enturn)与对照植物在某些抗性基因的表达上表现出差异"¨。Repetto等口21通过二维凝胶电泳一液相色谱技术证实菌根调节合成了Cd诱导蛋白，认为这是菌根共生体对Cd的解毒机制之一。(4)菌根真菌向宿主植物传递营养，使植物幼苗成活率提高，宿主植物抗逆性增强、生长加快，间接地促进植物对重金属的修复作用H引。近年来，采用同位素标记及尼龙网、PVC板隔开等方法对菌根真菌菌丝向宿主植物传递N和P进行了定量的分析测定，结果表明，菌根菌丝对植物体N和P的运输量较大，促进植物的生长‘74·例。(5)菌根的形成也同时影响植物根际微生物的种类和数量。有研究表明，树木每克外生菌根(鲜质量)能支持106个好氧细菌和102个酵母菌，菌根根际微生物的数量比周围土壤高出近千倍"副。植物根区的菌根菌有独特的酶系统和代谢途径，能降解不能被细菌单独降解的污染物，将菌根修复与植物修复综合运用，是植物生态修复新的研究方向。一般认为，重金属污染土壤中的土著菌根真菌耐受重金属能力较强，植物与菌根真菌生物修复的关键在于筛选有较强降解能力的菌根真菌和适宜的共生植物口利，从而相互匹配形成有效的菌根。1．4．2微生物对金属的生物吸附和富集生物吸附重金属主要发生在细胞壁上，不依赖能量代谢过程。由于生物体本14 第一章文献综述身的复杂性，生物吸附机理也十分复杂。在生物吸附剂和重金属离子一定的条件下，生物吸附机制主要有静电吸附、离子交换吸附、络合和沉淀等。一种生物吸附剂吸附重金属离子是上述多种机制共同作用的结果口蛳1。细菌是近地表环境中分布最广、生物量很大的生物类型，其表面通常有多种带负电荷的功能基团，如羧基、磷酰基、羟基等№¨，因此，细菌往往表现出显著的亲金属特性m3。细菌通过表面杂化方式吸附并富集金属离子，能够显著影响流体环境中金属的活动性，甚至在细胞壁或细胞内外聚合物的诱导作用或模板作用下形成矿物沉淀，从而使重金属离子固定下来埔引。到目前为止，已发现细菌，放线菌，真菌都具有吸附金属离子的功能。细菌和放线菌作为生物吸附剂的一类，对很多金属离子有富集作用，细菌、放线菌对金属离子吸附作用：动胶菌(ZoogloearamJgezal)易吸附Cu2+，Cr3+，U023H蚓；链霉菌(Streptomycessp．)易吸附U023+，Pd2+，Zn2+‘洲1；柠檬酸细菌(Citrobactersp．)易吸附Cd2+陋71；微球菌(Micrococcuslutaus)易吸附Sr2“蚓；发硫菌(Thiothriral)易吸附Zn2+，Ni2+旧1；仙影拳芽孢杆菌(Bacillusceteus)、枯草芽孢杆菌(Bacdllussubtilis)、大肠杆菌(BscheriehiacDJ力易吸附Ag+，La3+，Cu2+，Cd2“舯1；铜绿假单胞菌(Pseudomouasaeruginasa)易吸附Hg+，Ag+，La3+，Cu2+，Cd2+‘帅蚓。真菌类微生物由于菌丝体粗大，吸附后易于分离，吸附量大，它们可以吸附U，Th，Pb，Cr，Ra，Cd，Cu等多种金属离子，根霉(Rhezopus砌Ijz∽，oligosporus,nigricaris)易吸附U022+，Pb2+，Th2“蚋71，黑曲霉(Asperigg]lusniger)易吸附Cu2+，Pb壮，Z∥，Cr2+，Ni2+，C02+，Mn3+，Th2“辨删，产黄青霉(Petucilliumchriysogerium)易吸附U022+，Pb2+，Ra2+，Cr042“1州∞1，酿酒酵母(Sacchatromycescerevister)易吸附Cu3+，Pb2+，Ag+，Cd2“m叫唰。土壤微生物本身及其代谢产物都能吸附和转化金属，细菌对金属的富集、转化作用主要是通过胞壁吸附、氧化还原、细菌淋滤及与其它生物协同作用而进行。微生物对金属的生物积累机理主要表现在胞外络合作用、胞外沉淀作用以及胞内积累三种形式n071。微生物可通过带电荷的细胞表面吸附金属离子；或通过摄取必要的营养元素主动吸收金属离子，将金属离子富集在细胞表面或内部n蚓。微生物表面结构对金属的吸附起着重要的作用，微生物细胞壁和黏液层能直接吸收或吸附金属。微生物表面即带正电荷，又带负电荷，但大多数微生物所带的是阴离子基团，有利于对金属的吸附。已有很多报道指出，细菌细胞吸附金属离子的组分主要是肽聚糖、脂多糖、磷壁酸和胞外多糖，它们是细菌细胞壁的组分n嘲。革兰氏阴性细菌富集金属离子的位点主要是指多糖分子中的核心低聚糖和氮乙酰葡萄糖残基上的磷酸基及2一酮3一脱氧辛酸残基上的羧基n10】。革兰氏阳性细菌的吸附位点是细胞壁肽聚糖、磷壁酸上的羧基和糖醛酸上的磷酸基。．． 第一章文献综述微生物与重金属的相互作用的研究已成为环境微生物学中的重要研究领域。从发展趋势来看，今后的研究重点将会朝着生物净化技术的开发以及生物净化机理的深化两个方面发展，从而充分发挥微生物在环境保护中的作用。1．发现更多的微生物菌种，深入了解微生物的组成结构、代谢工程、遗传表达等内容，揭示微生物对重金属的吸附和富集机理。2．筛选具有专一吸附能力的微生物和降低微生物培育的成本。研究提高微生物吸附特定重金属离子的能力及收集被吸附重金属的方法。3．加强极端微生物的研究应用。极端微生物由于其特殊的生理机制，在环境保护中具有极大的应用价值。4．利用有代谢活性的细菌作为金属离子的生物吸附剂，解决如何保证在废水化学组成和浓度不断变化情况下，维持细菌的吸附活性。5．解决如何通过对环境介质中各生态因子的有机调控，充分发挥微生物净化功能，实现微生物生态修复的更大功效。1．5实验目的及意义传统处理锂等金属的方法多为物理化学法，如化学沉淀法、离子交换法、反渗透法、萃取法、活性炭吸附法等，它们各有优点，但不同程度地存在着投资大、能耗高、操作困难、效果不稳定、易产生二次污染等缺点。自从20世纪80年代以来，生物修复技术因其具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到科学研究者的广泛关注。鉴于锂及其化合物的特殊性能及高应用价值，运用微生物方法从盐湖卤水提取(回收)锂，具有成本低、效率高、高纯度、无污染等优点，借助微生物吸收、积累、富集金属锂具有广阔的应用前景和开发价值。本实验的主要目标是筛选抗锂和富集锂的微生物，研究其去除锂的特性，及其与锂的相互作用主要为富集和抗性机制，为利用微生物进行锂提取(回收)奠定基础。16 第二章分离、筛选抗锂和富集锂的微生物菌株2．1材料2．1．1土样采自新疆阿尔泰山脉的新疆富蕴县可可托海锂矿区富含锂矿石(主要是锂辉石、锂云母)周边土壤，共6份土样。2．1．2试剂 第二章分离、筛选抗锂和富集锂的微生物菌株培养皿，试管等玻璃仪器均为常规玻璃仪器2．1．4培养基(1)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3．09，蛋白胨5．Og，NaCI5．09，水lL，琼脂15—209，pH7．0(2)高氏1号培养基：可溶性淀粉209，KNO。ig，NaCl0．59，K2HPO。0．59，MgSO。7H：00．59，FeSO。0．Olg，琼脂15—209，水1L，pH7．2—7．4(3)马铃薯培养基(PDA)：马铃薯2009，葡萄糖209，琼脂15—209，水1L，pH自然。18 第二章分离、筛选抗锂和富集锂的微生物菌株马铃薯去皮，切成块煮沸30rain，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，融化后补足水至1L2．2实验方法2．2．1抗锂菌株的分离、筛选2．2．1．1梯度平板分离2．2．1．1．1土样悬浮液制备分别取29土加到50ml生理盐水中，标号，恒温摇床振荡10min备用。2．2．1．1．2梯度平板制备配制不同锂浓度0、1000、2000、3000mg／L的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(细菌)，倒平板，制成梯度浓度平板。放线菌、真菌、酵母同上。2．2．1．1．3涂布培养吸取0．1ml悬浮液分别涂布到不同锂浓度培养基梯度平板上(6份土样、4个锂浓度梯度、3个重复)，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃生化培养箱中培养2—3天，高氏1号培养基和马丁氏培养基平板倒置于28℃生化培养箱中培养3—5天，观察微生物的生长情况，并从中挑取不同的菌落进行平板划线。2．2．1．1．4菌株纯化与保存四线法划线分离抗性为1000、2000、3000mg／LLiCI的菌株，接种到相应锂浓度的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏l号培养基、PDA培养基上保存，每组设三个重复。对所筛选出的单一菌株进行斜面保藏，置于4℃的冰箱中。2．2．1．1．5菌株形态观察将分离纯化后的细菌菌株接种于斜面培养基上，于37℃培养箱中培养18．24h后，用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为对照，进行革兰氏染色进行形态观察。革兰氏染色反应【l6】是细菌分类和鉴定的重要性状。G+菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫．碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G。菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫．碘复合物溶出细胞壁，番红复染后呈红色。用革兰氏染色法对纯化后的细菌菌株进行鉴定具体步骤：①涂片：在干净的玻璃片上滴一滴生理盐水(或蒸馏水)，在无菌操作下挑取细菌放于水滴中涂匀。②干燥：在室温下自然干燥或在火焰上轻微加热烘干。19 第二章分离、筛选抗锂和富集锂的微生物菌株③固定：涂片的面向上于火焰上通过3～4次使细菌的胞质凝固以固定细菌的形态并使其固着在玻片上不易脱落，注意不要停留在火焰上烤。④初染色：用结晶紫染液染色约为1～2min，然后水洗。⑤媒染：滴加碘液约l～2mill，使结晶紫与细胞结合牢固。⑥酒精脱色：用95％乙醇滴洗30秒左右，到流下的乙醇无色为止，立即水洗干燥。这一步是革兰氏染色的关键，若脱色过轻阴性菌脱不掉紫色会造成假阳性，若脱色过重阳性菌的紫色会被脱掉而成假阴性。⑦复染：用番红染液(或复红染液)复染1～2min，然后水洗干燥。⑧镜检：观察两种菌的不同染色结果。红色为革兰氏阴性，蓝紫色为革兰氏阳性。2．2．1．1．6菌体制备将斜面保存的单一细菌菌株接种于装有牛肉膏蛋白胨的液体培养基300ml的500ml三角瓶中，30℃，120rpm，恒温摇床培养72h，发酵液离心8000rpm，10min，收集菌体，干燥处理为干菌体。2．2．1．2液体培养下去除锂能力的分析将分析菌株接种到不同初始锂浓度的液体牛肉膏蛋白胨培养基(细菌)中培养一周，分别测定溶液及干菌体锂含量，溶液经过滤器(0．2岫)除去菌体后测定滤液锂浓度，菌体经过滤收集，并用蒸馏水洗涤两次，70一80℃烘干至恒重后测定锂含量。初始锂浓度设0、10、100、1000mg／L。 第三章菌株NA!对锂的富集特性第三章菌株NAl对锂的富集特性3．1菌体液体培养3．1．1接种方法将固体斜面培养基上保存的NAl单菌活化、生长，接种至无菌水中制成菌悬液，吸取2ml接种于装有100ml液体培养基的500m1三角瓶中。3．1．2培养条件优化3．1-2．1pH值溶液pH值是影响微生物吸附的重要因素，金属阳离子与水溶液中的H+之间存在竞争吸附作用。许多研究表明，在一定的pH范围内，吸附量随pH值的升高而增大。黄民生等用曲霉吸附Pb2+和Cd2+时发现，pH值从4．0升N5．5时，吸附量随pH值的升高而增大，而pH值提高到6．O以后，吸附量逐渐下降。屠娟等用黑根霉吸附Cr(VI)，当pHtJ、于3时，黑根霉对金属离子的吸附能力都很低；在pH值升高至3时，金属吸附量急剧上升；当溶液pH值高于7对，金属吸附量逐渐下降。选择pH值为(3、4、5、6、7、8)，优化最适生长pH值。3．1．2．2温度过高或过低的温度都会使吸附量有所降低，吴涓等研究了温度对白腐真菌吸附Pb2+的影响，结果表明：28℃和35℃时的吸附率分别为95．62％和94．81％，40℃时的吸附率为82．49％，温度对吸附影响不大。黄民生等研究了温度对啤酒酵母吸附U的影响，温度在20--．50℃范围内，随着温度的升高啤酒酵母吸附U量有一定的增加。但由于升温会增加运行成本，因此在微生物吸附过程中不宜采用高温操作。选择温度(26℃，28℃，30℃，32℃)，优化最适生长温度。3．1．2．3共存离子溶液中，一般都存在两种或两种以上金属离子，当溶液中存在其他金属离子时，一般都会抑制主要金属离子的吸收。这些共存离子与主要离子竞争细胞上有限的带负电荷的基团，使得主要金属离子的吸附量较其单独存在时减少。如吴涓等考察YCu2+、Zn斗、Cd2+三种离子对Pb2+吸附能力的影响，结果发现这些共存离子的存在均使Pb2+的吸附量下降。但也有例外，牛慧等的研究发现，非活性产黄青霉对Pb2+的吸附受到Cd2+、Zn2+、Cu2+、As2+等离子的影响，其中Cd2+、As2+对Pb2+的吸附影响很小，Cd2+使Pb2+的吸附量略有增加，Zn2+则使pb2+的吸附量减少。屠娟等研究了Cu2+对黑根霉吸附Cr(VI)的影响，结果Cu2+的存在增加了黑根2l 第三章菌株NA!对锂的富集特性霉对Cr(VI)的吸附，这可能是由于Cu2+中和了细胞壁的负性基团，使得阴离子Cr(VI)更易接近细胞壁。3．1．2．4转速选择转速(0，60，120r／min)下NAl菌株的生长状况，优化最佳转速。选择最佳组合作为以后的培养条件。3．2NAl活菌体对锂的富集与去除作用3．2．1不同初始锂浓度液体培养下NAl的生长及对锂的富集分析优化后的培养条件下，设初始锂浓度约0、3．05、106．8mg／L，培养期最长72小时。定时取样，溶液经细菌过滤器(0．22lJm)除去菌体后测定滤液锂浓度。菌体经过滤收集，并用蒸馏水洗涤两次，70-80"C烘干至恒重后测定干重及锂含量，同时测定滤液pH值。菌体干重以滤纸和菌体总重减去滤纸重量计算而得。3．2．2不同生长周期的菌体对培养基中锂的吸附去除作用过滤收集培养期分别为l、2、3天的湿菌体各49，蒸馏水洗涤两次，置于加有锂浓度约lmg／L的pH为6的50ml培养基的150ml三角瓶中。反应1小时。溶液经细菌过滤器(0．22um)除去菌体后测定滤液锂浓度，菌体经过滤收集，70-80"C烘干至恒重后测定锂含量。3．3富集实验及锂含量测定20rag干菌体悬浮于100mlLiCl溶液包含72．0um锂，pH6(调pH用0．1MHCl、0．1MNa0H)，悬浮液室温摇床培养(120rpm)2h，抽滤后用膜孔径为0．22um细菌过滤器过滤，收集滤液，待检测。电感耦合等离子体光谱分析仪(ICPQ-1000)测量滤液中锂的含量，由新疆维吾尔自治区分析测试研究院协助完成。(检测依据：DZ／T0064．22-1993，环境温度：20℃，环境湿度：30％RH)。进行试验指标的计算：去除率：是指处理前后锂离子浓度差与初始浓度的比值。其计算公式为：去除率=(Co—c)／c。×100式中：c厂含锂初始浓度，mg／Lc一吸附后的含锂浓度，mg／L吸附量：是指单位质量的干菌体上吸附的锂离子的量。其计算公式为：吸附量(IImol／g)=(Co—c)×V／胁式中：c。广含锂溶液初始浓度，mg／L 第三章菌株NAI对锂的富集特性c一吸附后的过滤后的浓度，mg／L∥一溶液的分子质量，g／mol一菌体重量，g 第四章结果与讨论4．1抗锂与富集锂菌株的分离、筛选4．1．1梯度平板法分离抗锂菌株4．1．1．1土样中分离、筛选微生物表4-1新疆富蕴县可可托海矿区周边土壤中分离筛选得到的菌株微生物类群菌株数(株)细菌放线菌真菌酵母菌4226182各土样微生物总体上在富营养条件下生长良好，5号土样梯度平板分离，微生物数量较多，种类有较大差异，但都随着锂浓度的升高呈不同程度的下降趋势，尤其在3000mg／LLiCl浓度时，微生物生长较少，表明高浓度锂对各土样中大多数微生物具有明显抑制作用。锂矿区周边土壤中微生物的类群，细菌是分布最多的。从各个锂浓度中梯度平板上分离得到细菌菌株数(6个土样的总数)为：Omg／LLiCl：15株；1000mg／LLiel：14株；2000mg／LLiCl：8株；3000mg／LLiCl：5株。4．1．1．2锂浓度梯度平板上菌株生长情况由下图可知，不同的菌株在锂浓度梯度平板上的生长状况，在相同的培养条件下，细菌在Omg／LLiCl的平板上生长出较多不同的菌株和菌落，而随着LiCl溶液中锂的浓度逐渐增加，菌落数量逐渐减少，而抗锂的菌株生长良好，从而分离、筛选到抗锂菌株。 第四章镕皋与讨论下6号土样的NA+3000mg／LI．1C1圉4—2不同LiCl浓度下2号土样的细菌生长状况 镕目i镕&与讨论4．1．2菌株形态观察表4_2分离出抗锂的细菌苗株革兰氏染色细苗菌株数(株)革兰氏阳性细菌口革兰氏阴性细菌G2913对可可托海锂矿区周边土壤分离、筛选到的抗锂、富集锂的细菌苗株，进行革兰氏染色，结果如表2所示，革兰氏阳性菌株在锂矿区生长的数量明显要比革兰氏阴性细菌多。水t。》-圄4—3革兰氏染色左图为N^5菌株，右图NAll菌株图3中两株菌株NA5和NAli。NA5是从5号土样1000mg／LLiCl浓度梯度平板中筛选出，NAll筛选自5号土样2000mg／LLiCI浓度梯度平板，从图3中可以看出NAo和,KAIl菌株革兰氏染色后，分别成紫色和红色，NAB是革兰氏阳性细菌，球菌；NAll为革兰氏阴性细菌，杆菌。篾、．弋羽蕊 第四章结果与讨论4l3分离、筛选到的高抗锂、富集锂菌株蒸黼圈4-4NAt(Lb+33@)+嚷1遗～、遣‘、。^匠缨圈4—5NA6(Lb+l3①)由上图4、5可知，在富含锂的矿区里分离、筛选到的微生物在高锂浓度下．生长依然良好，其中NAI(Lb+33@)筛选自3号土样3000mg／LLiCl浓度梯度平板(芽孢杆菌)；NA6(Lb+13①)筛选自j号土样1000mg／LLiCI浓度梯度平板(细长杆菌)4I4液体培养下直簟锂殛对锂的去除分析将筛选到的抗锤菌株NAll(革兰氏阴性菌)和高抗锂菌株NAI(革兰氏阳性菌)进行液体培养后对培养基中锂的去除及富集能力的比较，培养基中锤的初始浓度分别为91j、1037、10675mg／L，结果如表3所示。表4—3不同初始锂浓度液体培养下NAt和NAIl对溶液中的锂的去除辜处理初始锂浓度(粗估)测定浓度(mg／U)去除率(％)对照lOmg／L915NAIlOmg／L27707№1llOmg／L402对照100mg／L1037NAtlOOmg／L4B574NAlllOOmg／L59453对照1000mg／U10675NAti000mg／L987131NAll1000mg／L969147 第四章结果与讨论由表中所知，当锂的初始浓度为9．15mg／L时，NAl对溶液中锂的去除率是70．7％，远大于NAll对溶液中锂的去除率40．2％，但随着初始锂浓度的增加，去除率在减小，特别是初始锂浓度达至U1067．5mg／L时，NAl和NAll对溶液中锂的去除率就相差不大了，应该是菌体吸收趋于饱和了。4．2富集实验表4-4新疆富蕴县可可托海矿区周边土壤中分离筛选细菌富集锂实验结果由上表4中可以看出NAl菌株富集锂的水平较高，NAl筛选自3号土样3000mg／LLiCl浓度梯度平板。革兰氏阳性细菌富集锂的能力明显比革兰氏阴性细菌富集锂的能力要强，可能与其细胞壁的结构和成分有很大关系，因为革兰氏阳性细菌高含离子化状态的磷酸群体，赋予了细胞壁磷壁酸聚合体上含有大量的负电荷，而在革兰氏阴性细菌中含有很少的磷壁酸。所以推断出革兰氏阳性细菌的细胞壁与锂离子之间的螯合能力比革兰氏阴性细菌细胞壁与锂离子之间的螯合能力强。 第四章结果与讨论4．3NAl对锂的富集与去除特性4．3．1锂对NAl生长的影响NAl生长培养条件优化结果：pH6，30"C，转速120r／min恒温摇床培养。为了进一步确定NAl对锂的抗性和富集能力，液体培养下设定不同初始锂浓度(0、3．05、106．8mg／L)，做NAl的生长曲线。lO．90．80．7e0．6∞篙0．5暑暑0．4∞0．3O．2O．10122436486072Time(h)—◆一0mg／L——_-3．05mg／L—●卜106．8mg／L图4-6不同初始锂浓度下NAl的生长曲线由上图看出，NAl在无锂和3．05mg／L低初始锂浓度下生长较快，说明低初始锂浓度对菌株正常生长没有抑制作用，并且，趋向于早到达稳定期的迹象。而当初始锂浓度为106．8mg／L高浓度时，菌体的正常生长基本停止，对微生物生长影响显著。． 第四章结果与讨论4．3．2不同初始锂浓度液体培养下不同时期NAl对锂的富集表4-5不同初始锂浓度液体培养下不同时期NAl对锂的富集NAl在初始锂浓度为3．05mg／L条件下，正常发酵生长，细菌的生长速度较快，在72小时内，溶液中的锂被吸附到了菌体细胞上，它的锂浓度在逐渐降低，在72小时降至最低点，同时，微生物菌体中金属锂的富集含量也达到了最大值329．6mg／L，这与试验初期的设计相吻合，NAl对锂有很强的吸附与富集能力，而在将初始锂浓度增加到106．8mg／L时，可能由于较高的锂离子浓度，抑制了NAl菌株的正常生长，溶液中锂浓度减少较小，菌体中的锂的含量也维持在一个较低的水平。 第四章结果与讨论4．3．3溶液的pH值对NAI富集锂的影响图4—7LiCl溶液的pH值对NAl菌体富集锂的影响从上图中可知新疆富蕴县可可托海矿区周边土壤分离出富集锂的革兰氏阳性细菌NAl富集锂能力最高水平是在LiEl溶液为pH6，而当pH降低时，在低pH值的条件下，阴离子群是很容易质子化的。因此，随着溶液酸度升高，H+逐渐增多，细菌的富集锂的能力也随之下降：而当pH超过7以后，溶液变碱性后，富集能力也是很快就下降。4．3．4干菌体的预处理对NAl富集锂的影响表4-6不同干燥方式对NAl菌体富集锂的影响由上表，NAl菌体预处理所采用的冷冻干燥和烘干干燥两种干燥方式，两种干燥方式测得的菌体富集锂的含量分别为329．6mg／L、328．8mg／L，差别不大，而去除率也十分相近，说明烘干干燥和冷冻干燥对NAl菌体吸附和富集锂能力无太大影响，与其吸附的有效面积无关，没有破坏菌体中与吸附相关的活性基团。 第五章结论与展望从新疆富蕴县可可托海矿区周边土壤中，分离、筛选到抗锂和富集锂的微生物包括细菌42株、放线菌26株、真菌18株、酵母2株，类群最多的是细菌。从3号土样中锂浓度梯度是3000mgL-'筛选出的NAl菌株，富集锂的能力最高，测得每克干菌体锂的富集量329．6umol，溶液的去除率也很高，达到92．48％，分离出的菌株富集锂效果很明显。革兰氏阳性细菌富集锂的能力明显比革兰氏阴性细菌富集锂的能力要强，可能与其细胞壁的结构和成分有很大关系。溶液的pH值对干菌体富集锂的影响很大，当pH为6时富集锂的量达到最大值，pH值低时，微生物细胞壁上的各种基团被氢离子所占据，从而阻碍金属离子的吸附，且pH值越低，阻力越大。当pH增大时，会暴露出更多带负电荷的吸附基团，有利于金属离子吸附在细胞表面。pH值过高对金属吸附亦存在不利影响。当溶液pH值超过金属离子沉淀的上限时，溶液中的金属离子以氢氧化物的形式存在，微生物可吸附的游离金属离子减少，所以金属离子的吸附量急剧减少。．干菌体预处理采用不同的干燥方法，烘干干燥和冷冻干燥的干菌体富集锂的含量无较大影响。与其吸附的有效面积无关，两种干燥方式都不会破坏菌体中生物吸附的活性成分。微生物吸附金属的机理研究，虽然此方面的研究取得了一定的进展，但由于金属离子本身的特性以及金属离子与微生物细胞之间相互作用的复杂性，许多现象还无法从机理上得到合理的解释，需要继续做更多的实验工作去探索。可以选择利用基因工程技术建构具有较强吸附能力的或特异性吸附金属能力的工程菌，为微生物吸附和富集金属提供更加便利得菌种资源。微生物吸附重金属的自动化控制研究，此类研究包括微生物的固定化、吸附过程的自动化控制等，可为微生物吸附法的大规模工业化应用创造条件。微生物富集技术的应用为重金属的生物修复提供了新的途径。然而这种技术也面临着两大问题。一是微生物富集重金属的机理研究；二是在自然界条件下的实际应用问题。国内外学者针对微生物富集重金属的机理，已从亚细胞角度、生理生化角度、分子生物学角度开展了广泛的研究；而针对微生物富集技术应用于金属的生物修复方面的研究较少，而且研究结果还存在一定的不确定性。因此，一方面仍然需要作大量的野外试验以获得准确的试验参数来验证室内试验的结果，以期微生物修复技术的推广；另一方面，将微生物修复技术与其它环境修复技术进行有效的集成，可为金属的生物修复提供更为有效的技术支持。利用微生 第五章结论与展望物吸附水中的金属，由于其价廉、节能和去除效率高等优点而成为该领域的研究热点。微生物锂的富集题目较新，国内对其研究较少，深入研究对盐湖中提取锂的工艺有深远意义，对矿石中提取锂的化合物奠定基础。 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致谢本论文是在工作几年后，又读书完成的，所收获的不仅仅是愈加丰厚的知识，更重要的是在阅读、实践中所培养的思维方式、表达能力和广阔视野。很庆幸这些年来我遇到了许多恩师益友，无论在学习上、生活上还是工作上都给予了我无私的帮助和热心的照顾，让我在诸多方面都有所成长。谨以最朴实的话语致以最崇高的敬意。感谢我的导师杨冬教授和企业导师陈蓝天，导师开朗的性格和对科研严谨而热忱的态度是值得我学习的。导师开阔的思维、敏锐的洞察力以及详细的修改意见一直给我很大的启发，从导师身上我体味到了丰富的学养、严谨的作风、求实的态度，勤奋的精神，这都成为了我不断前行的动力和标杆。谨向导师表示诚致的感谢。在实验方案设计中，还得到了娄恺研究员、霍向东副研究员的科学指导，此外，徐长伦、李玉国、欧提库尔等老师给予了多方面的热情帮助，在此向各位老师表示衷心的感谢。。特别感谢龙宣杞、崔卫东、张志东、唐琦勇、常伟、王博、秦新政、古丽努尔同学，在实验和论文完成过程中他们给予了大力的帮助。此外，还感谢张涛、詹发强老师和李艳美、段巍巍、朱莉、胡雯、牟思颖等人的热心帮助。感谢我的父母和身边关心我的入给予我的支持和鼓励。最后，向所有在本人攻读硕士学位期间曾经关心和帮助过本人的老师和同学表示最诚挚的谢意141