马铃薯耐盐无性系的离体筛选

《马铃薯耐盐无性系的离体筛选》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

中閣分类号学枚化码１０２２４：气＾二－密级公开学号１２０３１０１８３去＾Ｉ４／、酱＾硕女学拉论文－真－与．一＼ＩＩ与＾－－子—＝＝＾＝＾．￣￣￣￣＾：兰－．ｊ—马铃著耐盐无性系的离体筛选怖者属明扬导师石巧副研究员孽位类别农学硕±＿＿所在挙院巧学院一级学科作物学二级学科作物遗传育种二〇－五年六月 独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注；如沿有其化需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。…ｆ：＾月旧学位论文作者签名：吗明４乃曰期冉学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被査阅和借阅。本人授权学校可将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印（、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书）、＾辟＾月｜学位论文作者签名；故日期：２日马峭＾／导师签名；日期：＞＇辟／月／Ｉ日 ClassifiedIndex：Code：10224Confidential(yes/no)：noNO.：120310183DissertationfortheMasterDegreeScreeningofSaltTolerantClonesinPotatoCandidate:ZhouMingyangSupervisor:AssociateProfessorShiYingDegreeCategory:MasterofAgricultureCollege:CollegeofAgriculturalFirstleveldiscipline:CropScienceSecondleveldiscipline:CropGeneticsandBreedingHarbinChinaJune2015 目录目录摘要...............................................................................................................................................................I英文摘要...................................................................................................................................................III1前言..........................................................................................................................................................11.1土壤盐渍化概况.............................................................................................................................11.2盐胁迫对植物的影响.....................................................................................................................11.2.1盐胁迫对植物形态发育的影响............................................................................................11.2.2盐胁迫对植物光合作用的影响............................................................................................11.2.3盐胁迫对渗透调节物质的影响............................................................................................21.2.4盐胁迫对膜脂过氧化作用的影响........................................................................................21.2.5盐胁迫对蛋白质代谢的影响.................................................................................................21.3国内外马铃薯耐盐性研究............................................................................................................31.3.1国内马铃薯耐盐性研究进展.................................................................................................31.3.2国外马铃薯耐盐性研究进展.................................................................................................41.4耐盐突变体筛选的研究................................................................................................................51.4.1耐盐筛选的试材......................................................................................................................51.4.2耐盐突变体筛选方法.............................................................................................................51.4.3突变体耐盐性的鉴定.............................................................................................................51.4.4植物细胞突变体筛选技术在耐盐育种上的应用现状......................................................71.5目的与意义......................................................................................................................................72材料与方法.............................................................................................................................................82.1试验材料..........................................................................................................................................82.2试验设计..........................................................................................................................................82.2.1试验材料耐盐性评价及耐盐临界浓度筛选.......................................................................82.2.2耐盐无性系筛选体系的建立.................................................................................................82.2.3耐盐无性系材料耐盐性的鉴定............................................................................................92.3取样和测定方法.............................................................................................................................92.3.1形态指标的测定......................................................................................................................92.3.2生理指标的测定......................................................................................................................92.4数据统计........................................................................................................................................123结果与分析...........................................................................................................................................133.1马铃薯脱毒试管苗的耐盐性评价和耐盐临界浓度筛选.......................................................133.1.1盐胁迫对脱毒试管苗形态指标的影响..............................................................................133.1.2盐胁迫对脱毒试管苗生理指标的影响..............................................................................153.1.3耐盐临界浓度筛选...............................................................................................................21I 东北农业大学农学硕士学位论文3.2耐盐无性系筛选体系的建立......................................................................................................213.2.1薯块愈伤组织诱导...............................................................................................................213.2.2耐盐再生植株的诱导...........................................................................................................233.2.3耐盐再生植株的初步筛选...................................................................................................233.3耐盐无性系材料的评价..............................................................................................................243.3.1耐盐无性系的材料选择.......................................................................................................243.3.2盐胁迫下耐盐无性系材料的形态指标..............................................................................253.3.3盐胁迫下耐盐无性系材料的生理指标..............................................................................274讨论........................................................................................................................................................334.1盐胁迫对马铃薯形态指标的影响.............................................................................................334.2盐胁迫对马铃薯生理指标的影响.............................................................................................334.3五个品种耐盐性评价...................................................................................................................344.4耐盐临界浓度的筛选...................................................................................................................344.5耐盐无性系筛选体系...................................................................................................................354.6耐盐无性系耐盐性的评价..........................................................................................................365结论........................................................................................................................................................37致谢............................................................................................................................................................38参考文献...................................................................................................................................................39攻读硕士学位期间发表的学术论文.....................................................................................................45II CONTENTSCONTENTSAbstractinChinese...................................................................................................................................IAbstractinEnglish...................................................................................................................................III1Introduction............................................................................................................................................11.1Soilsalinitysurvey...........................................................................................................................11.2Effectofsaltstressonplants..........................................................................................................11.2.1Effectofsaltstressonplantmorphologydevelopment........................................................11.2.2EffectofsaltstressonPhotosynthesis....................................................................................11.2.3Effectofsaltstressonosmoticadjustmentsubstance..........................................................21.2.4Effectofsaltstressonlipidperoxidationinmembrane.......................................................21.2.5TheEffectofsaltstressonproteinmetabolism.....................................................................21.3StudyonsalttoleranceofpotatoinChinaandabroad.................................................................31.3.1StudyonsalttoleranceofpotatoinChina.............................................................................31.3.2Studyonsalttoleranceofpotatoinabroad............................................................................41.4Studyonsalttolerancemutantsselection......................................................................................51.4.1Saltresistantscreeningtestmaterial.......................................................................................51.4.2Salttolerantmutantscreeningmethod...................................................................................51.4.3Identificationofmutantsalttolerance....................................................................................51.4.4Applicationofmutantscreeningofplantcellsinsalttolerancebreeding..........................71.5Purposeandsignificance.................................................................................................................72MaterialsandMethods.........................................................................................................................82.1Experimentalmaterial......................................................................................................................82.2Experimentaldesign.........................................................................................................................82.2.1Salttoleranceevaluationoftestmaterialas............................................................................82.2.2Establishmentofscreeningsystemforsalttolerantclones..................................................82.2.3Salttoleranceidentificationofsaltresistantclone................................................................92.3Samplinganddeterminationmethod..............................................................................................92.3.1Determinationofmorphologicalindex...................................................................................92.3.2Determinationofphysiologicalindex....................................................................................92.4Statisticalanalysis..........................................................................................................................123Resultsandanalysis............................................................................................................................133.1SalttoleranceevaluationoffivevarietiesofpotatovirusfreetesttubeseedlingsandSalttolerancethresholdscreening.........................................................................................133.1.1EffectofvarioussaltconcentrationonMorphologicalindicesofdiploidpotatoes....................................................................................................13III 东北农业大学农学硕士学位论文3.1.2Effectofvarioussaltconcentrationonphysiologicalindicesofdiploidpotatoes.Morphological.........................................................................153.1.3Salttolerancethresholdscreening........................................................................................213.2Establishmentofscreeningsystemforsalttolerantclones.......................................................213.2.1Callusinductionoftubertuber..............................................................................................213.2.2Inductionofsalttolerantregeneratedplants........................................................................233.2.3Preliminaryscreeningofsalttolerantregeneratedplants..................................................233.3Evaluationofsaltresistantclonesmaterials...............................................................................243.3.1Materialselectionforsalttolerantclones............................................................................243.3.2Morphologicalindexofsaltresistantclonesinsaltstress.................................................253.3.3PhysiologicalindexofsaltresistantclonesinrSaltStress................................................274Disscussion............................................................................................................................................334.1Theinfluenceofsaltstressonmorphologicalindexoftheplantletsinvitro..........................334.2Theinfluenceofsaltstressonphysiologicalindexoftheplantletsinvitro............................334.3Salttoleranceevaluationoffivevarieties...................................................................................344.4Salttolerancethresholdscreening................................................................................................344.5Salttolerantclonalscreeningsystem...........................................................................................354.6Evaluationofsalttolerantclones.................................................................................................365Conclusion.............................................................................................................................................37Acknowledgement...................................................................................................................................38References.................................................................................................................................................39PaperspublishedintheperiodofPh.M.education.........................................................................45IV 摘要摘要马铃薯具有分布广泛、适应性强、产量高、营养丰富等特点，是具有宜粮、宜菜、宜饲、宜做工业原材料等多种用途的主粮兼经济作物。近年来，土壤盐渍化对马铃薯的生长发育造成了很大的威胁，对马铃薯进行耐盐材料的创制成为新的研究领域。本试验以5个马铃薯品种为试验材料，选取微型薯作为外植体培养愈伤组织，获得耐盐无性系植株。对获得的耐盐无性系克新4-1-200号、克新18-1-150号、克新18-3-200号和克新23-3-150号进行盐胁迫处理，并从形态和生理特性两方面进行耐盐性评价。主要试验结果如下：（1）以株高、植株鲜重、根长和茎粗这四项形态指标综合评价马铃薯脱毒试管苗的耐盐性，得出茎粗随着盐胁迫的加强呈增加趋势，株高、茎叶鲜重和根鲜重呈下降趋势。盐胁迫下马铃薯试管苗的茎粗影响最大，其次是株高；耐盐性差的品种茎叶鲜重和根鲜重变化幅度比耐盐性强的品种茎叶鲜重和根鲜重变化幅度的更加明显。（2）经过盐胁迫处理后，脱毒试管苗的叶绿素含量下降，盐敏感品种的下降幅度要大于耐盐品种；根系活力呈下降趋势，盐敏感品种的下降幅度要大于耐盐品种；脯氨酸含量呈上升趋势，盐敏感品种的变化幅度要大于耐盐品种；SOD和POD两种保护性酶活性的变化趋势不一致，不同基因型材料在盐胁迫后的变化趋势不同，与材料本身酶发挥作用的能力有关。综上所述，叶绿素含量和根系活力可以作为评价耐盐性强弱的有效指标，而脯氨酸含量和保护性酶活性可以作为参考指标。（3）采用马铃薯微型薯为外植体，区别于前人采用的叶片和茎段的外植体类型。每1L培养基中加入1mLZT和4mLIAA进行愈伤组织培养，诱导率均达到85%，说明此激素配比及浓度适宜耐盐愈伤组织诱导。（4）五个马铃薯品种脱毒试管苗耐盐性由强到弱顺序为克新18号>克新4号>克新13号>克新25号>克新23号；耐盐无性系材料的耐盐性由强到弱顺序为克新18-3-200号>克新4-1-200号>克新18-1-150号>克新23-3-150号。关键词马铃薯；生理指标；形态指标；离体筛选；愈伤组织I AbstractScreeningofSaltTolerantClonesinPotatoAbstractPotatowithwidedistribution,strongadaptability,highyield,richinnutrition,andothercharacteristics,withappropriategrain,appropriatefood,appropriatefeed,industrialrawmaterialsforavarietyofpurposes,suchasstaplefoodgrainandeconomiccropsshoulddo.Inrecentyears,thesoilsalinizationonpotatogrowthanddevelopmentcausedgreatthreat,Thedevelopmentofsalttolerantmaterialsofpotatohadbecomeanewresearchfield.Thisexperimentwasbasedonfivepotatovarietiesasthetestmaterials,Selectionofmicrotuberasexplantforcallusandobtainingsalttolerantclones.SalttolerantclonesgramsKenxin4-1-200,Kenxin18-1-200,Kenxin18-3-150andKexin23-3-150subculturemultiplication.AfterculturedmediumwereaddedNaClsaltstresstreatment,andfromtwoaspectsofthemorphologicalandphysiologicalcharacteristicsofforsalttoleranceevaluation.Themainresultsareasfollows:(1)Toplantheight,plantfreshweight,rootfreshweightandstemdiameterofthefourmorphologicalindexcomprehensiveevaluationofpotatodevirusfreeplantletsresistanttosalt,theappearance,amplitudevariationandsignificantanalysis,Thestemdiameterwasincreasedonthesaltstress,theplantheight,andtheshootfreshweightandtherootfreshweightweredecreased.drawsthesaltstressonpotatovirusfreeplantletsofstemdiameterinfluenceisthelargest,followedbyplantheight,resistanceoflowsaltplantfreshweightandrootfreshweightchangesweremoreobvious.(2)Afterthedeterminationofphysiologicalindex:aftersaltstresstreatment,andthechlorophyllcontentofvirusfreeplantletsaredeclining,andsaltsensitivevarietiesdecreasedtoagreaterextentthansalttolerantvarieties;rootvigordecreased,andsaltsensitivevarietiesdecreasedinsalttolerantcultivar;prolinecontenttheupwardtrend,andthechangesinsaltsensitivevarietiesthansalttolerantvarieties;thetrendofSODandPODtwokindsofprotectiveenzymeactivitiesarenotconsistent,differentgenesmaterialsshoweddifferenttrendsinsaltstress,thematerialitselfandrelatedenzymesplayrole,theabilitytosumup,theeffectiveindexofchlorophyllcontentandrootactivitycanbeusedastheevaluationofsalttolerance,andtheprolinecontentandprotectiveenzymeactivitycanbeusedasareferenceindexforevaluation.(3)Theexperimenttakespotatominipotatoasexplant,anddistinguishesitfromtheleavesandstemsoftheformerleaves..Perliterofculturemediumadded1mlZTand4mlIAAcallustissueculture,inductionratereached85%,theproportionandconcentrationofthishormoneweresuitableforcallusinductionofsalttolerance.III 东北农业大学农学硕士学位论文(4)Thesalttoleranceofthetesttubeseedlingsofthefivepotatovarietieswasfromstrongtoweakorder:Kexin18>kenxin4>Kexin13>Kexin25>Kexin23,salttoleranceofsaltresistantclonesisfromstrongtoweakorder:Kexin18-3-200>Kexin4-1-200>Kexin18-1-150>Kexin23-3-150.Keywords:potato;physiologicalindex;morphologicalindex;isolation;callusCandidate:ZhouMingyangSpeciality:CropGeneticsandBreedingSupervisor:AssociateProfessorShiYingIV 前言1前言1.1土壤盐渍化概况盐碱地是盐类汇集的一个总称，是指土壤里面所含的盐分（尤其是Na+和Cl-含量过高）影响到植物的正常生长。土壤溶液中含高浓度Na+、Mg2+、Ca2+及CO2---2-3、HCO3、Cl、SO4为盐碱土。土壤中的盐分来源很多，如火山、海洋、岩石和人类的活动等[1,2]。土壤盐渍化是人类面临的生态危机之一，人类赖以生存的有限土地资源正受到土壤的盐碱化问题威胁[1]。根据不完全统计，全世界有9.5438亿公顷盐碱地，其中有9913万公顷在我国。盐胁迫对植物生长的威胁是全球性的问题[3]，全球的3∕4的被海水覆盖，它的侵蚀是土壤盐渍化的原因之一，但在干旱、半干旱地区，使用水(含Na+和Cl-)灌溉或灌溉不当，使水位（地下）上升，土壤含盐量再次增加。土壤盐渍化的另一主要原因是森林退化。随着建筑面积、灌溉耕地和塑料大棚栽植面积的不断扩大，土壤次生盐渍化问题日益突出[4]。农林业生产因此遭受土壤盐渍化的严重压制，在农业占地变少的情况下，人们逐渐意识到盐碱地作为宝贵的资源应为人类所用。当前主要采取两种措施对开发盐渍土：一是通过工程改良，即用淡水洗盐，但要耗费大量物力和人力，并且难以从根本上解决问题。二是生物治理，而根据植物耐盐的差异性和遗传性，选育耐盐作物品种改良土壤。1.2盐胁迫对植物的影响1.2.1盐胁迫对植物形态发育的影响大量的研究得出：盐胁迫抑制植物的生长发育。张俊莲等[5]发现，随盐胁迫浓度增强并时间的延长，马铃薯试管移栽苗生长因受到明显抑制。江超等人[6]研究出紫花苜蓿根系活力在盐胁迫下明显下降。王保平[7]等研究发现紫花苜蓿在盐胁迫下株高降低。罗敏[8]等人研究得出，玉米的株高均受到不同程度的抑制（在不同浓度的盐处理），随着盐浓度的升高株高逐渐降低，且根活力变弱。沈振荣[9]和郭彦[10]得出相同结论，根的变化小于幼苗的变化（在盐肋迫下），说明根对盐胁迫的敏感程度相对差。1.2.2盐胁迫对植物光合作用的影响叶绿体是植物光合作用的主要场所，其含量直接反映植物光合作用能力（作为生理指标）。研究绿优谷的张强[11]发现，随着混合盐碱胁迫的增强，叶绿素含量下降。崔众森等人[12]研究发现影响马铃薯脱毒试管苗生长的有三个主要原因：叶绿素含量下降、膜透性增大和Na+积累。张俊莲等[5]研究发现，气孔导度、光合速率和叶绿素含量极显著地下降（在盐胁迫下）。许兴等[13]研究小麦得出叶绿素含量显著下降（在盐胁迫下）。1 东北农业大学农学硕士学位论文1.2.3盐胁迫对渗透调节物质的影响渗透调节是植物受到逆境胁迫的主要生理机制之一[14]。在盐胁迫条件下，植物体内蛋白质合成受到抑制而促进其分解，于是氨基酸含量上升，脯氨酸含量的升高是最为突出的[15]，而且随胁迫浓度的加深，脯氨酸含量呈上升趋势，此结论在小麦[16]、草坪草[17]、紫花苜蓿[18]等植物上均得到了证明。目前，学者认为有两种主要原因使脯氨酸(盐分胁迫下)积累的机制：一是脯氨酸生成被促进，即以谷氨酸和鸟氨酸在限速酶毗咯琳-5-梭酸合成酶催化下合成[19]；二是抑制其氧化，即在Na+和Cl-条件下脯氨酸氧化酶活性被抑郁了，促进了合成脯氨酸增加。张俊莲等[5]在试验中发现，随盐胁迫浓度增加和时间的延长，马铃薯脯氨酸含量初期（在胁迫）极显著地大量增加，随后呈下降并趋于稳定的趋势，马铃薯（正常生长）脯氨酸含量值为0.6013g/gFw，是非盐生植物。崔众森等[12]人研究表明，马铃薯脱毒试管苗的受伤害程度（在盐胁迫下）可用脯氨酸多少反映。颜宏[20]研究发现，羊草（在NaCl胁迫下）脯氨酸及可溶性糖含量随Cl-浓度增大呈直线式平缓上升，在Na+胁迫下则呈明显的曲线变化。可溶性糖是大多数非盐生的植物的主要渗透的调节剂之一，也可以作为碳架保护和能量来源用于合成别的有机溶质，在盐胁迫初期，植物中可溶性糖含量增加，但到由于呼吸作用的增强和光合作用的衰竭后期其含量却开始降低，它可以稳定细胞膜和原生质胶体，也可保护细胞[21]（在无机离子浓度高时）。1.2.4盐胁迫对膜脂过氧化作用的影响正常情况下，植物细胞内自由基与清除系统保持平衡，自由基水平较低，不会引起伤害。而盐胁迫条件下，产生自由基量比较大，平衡会打破，进而对植物产生伤害在一定程度上SOD、POD可以保护了细胞膜整个系统，因其可清除活性氧自由基，因而在研究中很受学者重视。保护酶活性的变化--是植物对盐胁迫的对抗之一反应，如小麦[22]、果树[23]等在盐胁迫下均表现出保护酶活性不同程度的增加。田小磊[24]研究表明，SOD、POD和CAT活性的提高可降低盐胁迫下玉米黄化幼苗。1.2.5盐胁迫对蛋白质代谢的影响生物大分子，主要指蛋白质和DNA等物质。一般认为，盐胁迫使植物的蛋白质合成在盐胁迫下受到阻碍，进而水解加剧，即导致蛋白质含量下降[25]，但也有报道指出，在盐胁迫下某些植物的蛋白质合成增加[26]。不管哪种情况，可溶性蛋白质含量的提高是增强渗透调节能力的应对之一。外界Na+和Cl-大量进入植物细胞后，对这些生物大分子产生巨大破坏作用。例如，这些酶（对Na+敏感）遇到Na+后，常会使其讲解，进而失活。与核酸的作用在Na+环境下也会导致它们的断裂，对一些蛋白质也会引起它们的水解，导致生理代谢紊乱、从而影响生长发育、最综导致植物死亡[27]。孙静[28]研究表明，小麦处于高盐环境时，会诱导那些抑制蛋白质增加的同工酶的产生，进而导致蛋白质的增加，以适应细胞在盐胁迫下特殊的代谢反应，从而达到抵抗盐渍侵害的目的。盐诱导基因的开启和盐抑制基因的关闭决定了蛋白2 前言质（在盐胁迫下）的表达，一些谱带在电泳图谱上的消失和增加可以得以表现[29]。1.3国内外马铃薯耐盐性研究1.3.1国内马铃薯耐盐性研究进展马铃薯（SolanumtuberosumL.）起源于安第斯山脉的高原地区，是茄科茄属的一年生的能结块茎的草本、多倍性作物，可利用浆果内的种子进行有性繁殖，也可借块茎进行无性繁殖。马铃薯具有分布广泛、适应性强、产量高、营养丰富等特点，是具有宜粮、宜菜、宜饲、宜做工业原材料等多种用途的主粮兼经济作物。因此在我国农作物中也占有相当重要的的地位。另外，在栽培中马铃薯是良好的前茬，又适于间作、套种，所以马铃薯在粮食、蔬菜栽培以及农业经济、人民的日常生活中起着非常重要作用。马铃薯栽培种在南美洲的历史悠久，大航海时代西班牙人将马铃薯从南美洲引入欧洲，明朝万历年间（1573-1620年）荷兰人把马铃薯传入中国，迄今为止，马铃薯在我国有400年的栽培历史。目前我国马铃薯种植分布情况以东北、华北、西北和西南等地区为多，中原与东南沿海各地较少。马铃署适应性很强，体现在土壤pH4.8-7.1之间都能正常发育，无论是沙质土壤还是较粘重的土壤都能获得满意的产量；还体现在在春旱的情况下比其他区作物容易出苗，遇到自然灾害具有较强的再生能力。马铃薯一般亩产可达1500-2000kg，高产者可达5000kg，比其他粮食作物单位面积的干物质产量高2-4倍。马铃薯营养成分既丰富又齐全，蛋白质质量与动物蛋白相近，能很好地为人体所吸收；脂肪含量较低；富含粗纤维和多种维生素；矿质盐类含量多呈强碱性，对平衡食物中的酸碱度与保持人体血液的中和具有显著效果。美国农业部门高度评价马铃薯的营养价值，指出每餐只吃全脂奶粉和马铃薯就可以满足人体所需要的一切营养元素。土壤盐分过多对植物造成的危害称为盐害[30]。马铃薯对盐害较敏感[31]，盐渍化土壤不利于其生长[32]。因此，选育耐盐马铃薯品种具有很重要的经济效益和社会效益，寻找一种高效的马铃薯抗盐育种途径已成为重要的研究课题。19世纪40年代我国才开始马铃薯的研究，并且多倾向于研究马铃薯生长对盐胁迫的反应。研究结果表明盐胁迫可延迟马铃薯的出苗时间、降低幼苗存活率、抑制地上部分生长，且盐浓度的增加会导致影响程度加大。随着研究的不断深入，马铃薯的耐盐性研究也逐渐涉及到生理变化。研究结果表明盐胁迫会增加脯氨酸、Na+和丙二醛的含量，减少叶绿素的含量，降低气孔导度和光合速率，增大质膜的透性，导致SOD的活性先升高后降低及POD的活性升高等。康玉林等[33]的马铃薯对四种氯盐（氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁）处理的反应实验表明：四种氯盐对马铃薯的出苗、长势、株高及块茎产量均有不利影响，程度由大到小依次为：NaCl>KCl>CaCl[34]2>MgCl2；且随着盐浓度的增加，影响不断加大。同年，康玉林等的马铃薯小苗和小薯对不同盐浓度处理的反应实验表明：盐浓度的升高，对小苗和小薯的出苗、长势、株高和结薯粒数、结薯重量等均产生逐渐明显的负影响；小苗比小薯对盐胁迫更加敏3 东北农业大学农学硕士学位论文感，且小薯播种与大田种植相接近，筛选抗盐品种（系）初期可以扦插苗为主。康玉林等[35]的相同盐浓度处理下，实生种子于土壤和MS培养基上生长情况的对比实验表明：相同盐浓度时，生长在MS培养基的实生种子比生长在土壤中的更耐盐，筛选抗（耐）盐品种（系）时可以初步从实生种子开始。龚家栋[36]的不同马铃薯品种对相同盐胁迫的生长反应的对比实验表明：通过株高、茎叶数量、干物质的积累、总生物量及块茎产量的测定，发现6个品种均对盐胁迫比较敏感，但品种间的耐盐性存在较大差异。康玉林等[37]的多个马铃薯品种在不同程度盐碱地播种后，主要数量性状的对比实验表明：马铃薯的产量与盐碱地程度呈显著负相关，且耐盐碱的品种相较于不耐盐碱的品种，其出苗、长势及产量均较高，可以通过在盐碱较重地里的适应性鉴定筛选耐盐碱新品种。王新伟[38]（1998）的不同NaCl浓度处理鉴定马铃薯品种抗盐性的实验表明：NaCl浓度的升高会导致试管苗生长和生物产量受抑制程度的不断加大，并得出0.3%NaCl为筛选浓度。王新伟等[39]在MS培养基（含0.3%NaCl）上进行的马铃薯耐盐性鉴定得到：各马铃薯品种在对照和处理间，不论是各时期的生长速率还是生物产量均存在显著差异；耐盐性强的品种，其生长速率先下降，后趋于正常，但均高于不耐盐品种，这种差异也表现在生物产量上；基于实验结果，将各品种划分为抗、中抗、不抗三个类型。王新伟等[40]的在含有不同盐浓度土壤中种植高淀粉马铃薯品种（系）的实验表明：3种盐浓度的土壤均对马铃薯的生长起到抑制作用，单株结薯数、产量及淀粉含量均随土壤盐分含量的增加而降低。王新伟等[41]也针对马铃薯的生物产量及Vc含量在盐胁迫下的变化作了研究，发现在盐胁迫条件下的马铃薯生物产量显著低于对照，但Vc含量相对高于对照。张俊莲等[5]对马铃薯进行不同浓度盐处理，并分别测定不同时期的各项表型及生理生化指标。实验结果表明：随着盐浓度的加大，马铃薯的株高、生物产量、叶绿素含量、净光合速率和气孔导度均逐渐降低；脯氨酸含量先升高后降低；细胞间隙CO2浓度无明显变化。尹江等[42]也通过在含不同浓度NaCl的MS培养基上种植多个马铃薯品种，进一步筛选出抗盐材料2份。崔焱森等[12]通过测定不同盐浓度处理下马铃薯的生理指标发现：Na+含量、MDA含量及膜的透性相对值均与盐浓度呈正相关；叶绿素含量与与盐浓度呈负相关；脯氨酸含量先升高后降低；K+含量无明显变化。张瑞玖[43]也做了同类实验，得到相似的结论：随着盐浓度的增加，马铃薯的长势及各表型指标均不断降低，干物质含量、淀粉含量、蛋白质含量以及叶绿素含量和根系活力也呈下降趋势；脯氨酸含量、相对电导度、POD活性均明显升高；SOD活性先升高后降低。同时还进行了氮素调控实验，发现：在盐胁迫下，施加氮素可显著提高马铃薯SOD和POD的活性、根系活力、叶绿素及可溶性蛋白含量，且随着氮素施加量的增加，叶绿素及可溶性蛋白含量呈先增加后降低的趋势；但整体实验结果表明施加氮素并不能有效缓解盐胁迫的影响。1.3.2国外马铃薯耐盐性研究进展Zhang等[44]通过对3种方式（茎段、根尖和块茎）培养下的耐盐马铃薯品种浇灌同浓度盐水发现：虽然3种方式下培养的马铃薯，其生长速度与块茎产量均有所降低，但茎段方式培养相对强于根尖和块茎培养。4 前言Khrais等[45]通过盐胁迫条件下测定多个马铃薯品种的不同参数，并进行聚类分析，最终筛选出6个抗盐品种：AmisK，BelRus，Bintje，Onaway，Sierra及Tobique；包括Mainechip在内的20个对盐敏感的品种。Velasquez等[46]通过研究茎段培养时多个马铃薯品种在盐胁迫下的耐盐性及脯氨酸的累积发现：不同种质资源间的耐盐性差异对抗性育种具有积极的意义，同时也发现盐胁迫下的脯氨酸积累并无明显的相关性规律，进一步排除使用该参数评价品种的耐盐性。Shaterian等[47]通过盐胁迫的方式对野生二倍体马铃薯种与四倍体马铃薯栽培种进行筛选，发现四倍体栽培种相较于二倍体野生种对盐更加敏感，尤其在幼苗期更加严重；同时发现，块茎形成初期的相对块茎产量和增长指数可以作为抗性种质资源的有效筛选参考指标。1.4耐盐突变体筛选的研究1.4.1耐盐筛选的试材愈伤组织[48-51]与悬浮细胞系[52]在耐盐植物的筛选中是利用率最高的材料，另外还有利用原生质体培养[53,54]的方法进行筛选。但再生过程中也存在着诸多问题，包括细胞再生困难、植株畸形、优良性状消失等，目前应对的方法只有直接培养植株生物组织，例如根、茎尖和叶片等。目前已有许多植物成功使用植株本身的生物组织进行抗性种质筛选，如玄参使用茎或叶片[54]，马铃薯使用叶片[55]，番茄使用下胚轴[56]，水稻使用根尖、胚、胚乳、胚芽、幼穗、茎尖、叶片、叶鞘、花药、子房、种子等[57]。1.4.2耐盐突变体筛选方法长期研究表明，在盐胁迫条件下筛选耐盐材料时，盐的浓度及筛选时间是成功的关键。首先，筛选浓度要适宜。前人的实验表明，较低的筛选压力会导致大多数植株存活，加大进一步筛选的工作量[58]。因此需要加大压力，以致正常细胞生长受到抑制，此时才可能筛选出耐盐材料。其次，盐胁迫处理下的时间越长，越有利于筛选真正抗盐的材料，并加大抗盐材料的稳定性和纯度。目前，耐盐材料筛选的常用手段为NaCl和海水；也有人利用羟脯氨酸（HYP）、聚乙二醇（PEG）、L-氮杂环丁烷-2-羧酸（L-Azetidine-2-CarboxylicAcid）等处理植株，把渗透调节能力作为筛选的指标[59]。1.4.3突变体耐盐性的鉴定是否具有稳定遗传性对筛选出的耐盐性突变体是至关重要的，进一步对突变体进行的耐盐性鉴定是必需的。当前，鉴定方法主要包括直接鉴定法、间接鉴定法和分子标记辅助鉴定。5 东北农业大学农学硕士学位论文1.4.3.1耐盐性直接鉴定直接鉴定法是通过在评定浓度胁迫下，对种子的发芽情况、形态指标、产量等表现性状进而判定突变体的耐盐性。一般情况下，植物对盐的敏感期为种子萌发期和幼苗期，因此，耐盐性直接鉴定主要是研究在萌发期和幼苗期在盐胁迫下的植株，筛选出耐盐性鉴定标准，建立直接鉴定法耐盐性筛选技术体系。无论在植株什么时期鉴定，确定适宜临界盐浓度是首要的。不同的植物、不同的植物器官对盐的敏感性和耐受性都各不相同，过高或过低不能达到鉴定的目的。因此，筛选出适合的耐盐性鉴定NaCl浓度是耐盐性鉴定的首要问题。目前，主要采用的方法就是设定不同的盐梯度，将与不同品种间或是同一品种对照间耐盐筛选指标差异显著的NaCl浓度作为该植物耐盐性鉴定的NaCl浓度。1.4.3.2耐盐性间接鉴定间接鉴定法是指用一些与植物的耐盐性相关的生理生化指标的变化来评价突变株的耐盐性。目前，用于植物耐盐性鉴定生理生化指标主要有渗透调节物质(脯氨酸、多胺、可溶性糖等)含量、光合作用、细胞膜透性、各种保护酶系统(SOD、POD、CAT等)活性、丙二醛(MDA)含量以及激素等。毛桂莲等[60]通过对枸杞耐盐突变体（1.0%NaCl)的进行生理生化研究表明，对照的抗氧化酶SOD、CAT、POD活性低于突变体；丙二醛含量高于突变体。Luan等[61]研究甘薯试管苗的耐盐突变体，得到突变体中质膜透性降低，脯氨酸含量升高。1.4.3.3SDS-PAGE鉴定SDS-PAGE是检测耐盐突变株在蛋白质水平上是否发生了遗传变异。蛋白质（能用SDS-PAGE方法进行品种鉴定）主要包括贮藏蛋白和同工酶，遗传决定这些蛋白的组成，不受环境的影响，因此，当基因不同时，可表现出蛋白组分的差异，又称为品种的“生化指纹”。相对于DNA多态性检测，蛋白质的检测具有结果稳定性好、时间短、费用低、材料用量小、技术简单、重复性高等优点，因此，已经被广泛用于品种鉴定。毛桂莲枸杞对照组有21个蛋白条带，获得耐盐突变体有22个蛋白条带，并且它们都有其特有的蛋白条带，从图谱上可看出蛋白的它们的表达量不同[60]。1.4.3.4分子标记辅助筛选随着分子遗传学及相关学科的研究发展，对耐盐突变体进行分子鉴定，进而分析个体的遗传组成可以从分子水平上评价是准确的，对突变株基因型的进行直接选择[62]。分子标记是指DNA多态性为基础的遗传标记，主要应用有RAPD、RFLP、AFLP等。它可用来定位基因（即可筛选耐盐分子标记），进而进行耐盐品系的选育；从而克服了传统诱变育种的随机性和盲目性，受环境和植物生长发育阶段的影响很小，且检测快速简便[63]。到目前为止，在分子水平上已成功鉴定的耐盐突变体有苜蓿、芦苇[64]、小麦[65]、大豆、豆瓣菜[66]。6 前言1.4.4植物细胞突变体筛选技术在耐盐育种上的应用现状目前，许多植物抗盐性材料在利用体细胞无性系变异上获得成功。1972年Melcher第1次就植物组织培养技术可用于筛选耐盐突变体的优势性进行了专门讨论[67]，后来Zenk又利用该技术获得了耐盐细胞系[68]。郭岩[69]等以水稻花药（经EMS处理或未处理）为材料，筛选耐盐突变体所获耐盐变异系可稳定遗传到第13代，试验结果表明回交测定F2耐盐性呈3:1的分离，表明一个主效基因控制着植物耐盐性，同时还得出无论进行诱变处理与否，通过合适的筛选方法，能得到耐盐突变体并稳定遗传。周荣仁[59]用烟草叶片作为外植体(以0.5%NaCl作选择剂)，诱导耐盐愈伤组织，并逐步增加选择剂浓度，获得了耐盐细胞系(可耐受2%NaCl)和再生植株。李洪建[70]用水稻愈伤组织在不同盐浓度胁迫下研究其生理生化的变化，以及其再生植株的生理生化指标的测定，找出耐盐突变体（稳定性）的鉴定方法。冯桂荃[71]等对水稻愈伤组织采用逐步增加NaCl浓度及多次继代筛选法，对水稻F2。成熟胚愈伤组织的耐盐突变体（在细胞水平上）进行的筛选研究。李驹首次在林木育种中获得了不同杨树种和品种的耐盐突变体[72]。1.5目的与意义[31]马铃薯属于盐表现敏感的作物，盐胁迫会严重影响马铃薯的代谢活动，进而影响了马铃薯的生产。因此，研究马铃薯的盐胁迫具有现实意义。目前马铃薯育种进展一直比较缓慢，常规杂交育种仍是目前育种的主要手段，建立高效的马铃薯再生体系，以及离体筛选耐盐突变体将对马铃薯品种改良具有重要意义。前人研究基本都以茎段和叶片为离体筛选材料，本试验就五个马铃薯品种微型薯薯块作为离体筛选材料，另外本试验就五个马铃薯品种在不同NaCl浓度胁迫下的生理生化指标的变化以及变化幅度大小进行试验研究，评价其耐盐性，并对其耐盐无性系在不同NaCl浓度胁迫下的各种形态指标和生理指标的动态变化趋势进行研究，为筛选和培育马铃薯耐盐品种提供理论和基础数据。7 东北农业大学农学硕士学位论文2材料与方法2.1试验材料以马铃薯品种克新4号、克新13号、克新18号、克新23号和克新25号五个品种脱毒试管苗及微型薯为试验材料，马铃薯脱毒试管苗和微型薯分别由东北农业大学马铃薯研究所和黑龙江省农科院克山分院提供。2.2试验设计2.2.1试验材料耐盐性评价及耐盐临界浓度筛选以马铃薯脱毒试管苗为试验材料，外植体茎段在MS培养基上生长28d后，挑选生长势基本一致的试管苗，去除顶芽和基部茎段，剪成带有一片叶的茎段，分别接种到含0、50、100、150、200和250mmol·L-1NaCl的继代培养基上，以0mmol·L-1NaCl为对照(C)，每瓶接种10株，，每个品种接种20瓶，3次重复。在温度（25号±2）℃，光照2000~3000Lx，光照14h的下培养，培养28d后进行形态指标和生理指标的测定，探索其变化规律，并综合评价试验材料的耐盐性；且根据幼苗的受盐害情况筛选耐盐临界浓度。2.2.2耐盐无性系筛选体系的建立以五个马铃薯品种试管薯为试验材料，选取芽眼刚刚开始萌动，薯块坚硬的微型薯进行试验。2.2.2.1薯块愈伤组织诱导以马铃薯微型薯为外植体，先用毛刷在自来水下反复轻轻刷洗，再用70%的乙醇消毒30秒种，无菌水冲洗3-4次，再用0.1%的升汞(氯化汞)10-15min，随后用无菌水冲洗3-5次。去薯皮，切成厚度为1~2mm的薄片，接种在愈伤组织诱导的培养基上，分别放在暖光、冷光、红白光和红蓝光下进行培养。每瓶放3～4片薯块，每个品种每个处理15瓶，培养观察愈伤组织的诱导和生长情况。愈伤诱导培养基MS+1.0mg/LIAA+4.0mg/LZT。2.2.2.2耐盐再生植株的诱导将薯块恢复绿色并有颗粒状胚性愈伤的薯块转至含有150、200、250mmol·L-1NaCl的愈伤诱导培养基上培养，直至再生植株长至1~2cm。2.2.2.3耐盐再生植株的初步筛选将再生植株经过MS培养基继代一次，转接在含有100mmol·L-1NaCl的MS培养基上进8 材料与方法行初步筛选，淘汰生长速度慢、生根能力差的再生植株。2.2.3耐盐无性系材料耐盐性的鉴定2.2.3.1耐盐无性系的材料选择根据耐盐无性系材料的株高和生长情况（图3-13），选择耐盐无性系克新4-1-200号（以下简称克新4-1号）、克新18-1-150号（以下简称克新18-1号）、克新18-3-200号（以下简称克新18-3号）和克新23-3-150号（以下简称克新23-3号）。2.2.3.2耐盐无性系材料的形态指标和生理指标的测定将四份耐盐无性系材料进行继代扩繁，在继代培养基中分别添加0、150、200和250mmol·L-1NaCl进行盐胁迫处理，研究马铃薯试管苗（NaCl胁迫下）形态和生理特性的变化。2.3取样和测定方法2.3.1形态指标的测定在每个处理中随机取出10株马铃薯脱毒试管苗(3次重复)，用超纯水将苗带有的培养基洗净，然后用滤纸将水吸干，分别测定植株的株高、茎叶鲜重、根鲜重和茎粗。试验进行三次重复。茎叶鲜重和根鲜重采用电子分析天平进行测定；茎粗采用游标卡尺测定总茎高的中点处的直径；株高长度采用直尺测定。2.3.2生理指标的测定2.3.2.1试验试剂及仪器试剂：次硫酸钠、乙醇、愈创木酚、丙酮、30%过氧化氢、三氯乙酸、硫代巴比妥酸（TBA）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸缓冲液、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蛋氨酸（Met）、氮蓝四唑（NBT）、核黄素（FD）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、乙酸乙酯、TTC溶液、硫酸。仪器：分光光度计、冷冻离心机、光照培养箱、水浴锅。2.3.2.2叶绿素含量的测定采用丙酮提取法。称取待测样品0.2g，放入研钵中加入纯丙酮2mL，少许石英砂和碳酸钙粉，快速研磨，把液体移入管中，用2mL80%丙酮把残渣洗涤2次，皆移入刻度试管，最后加4mL80%丙酮，将提取液转入离心管中，离心条件为4000r/min，10min，以80%丙酮为对照，分别测定663nm、645nm和470nm处的光密度值。9 东北农业大学农学硕士学位论文Ca(叶绿素a的浓度mg·L-1)=12.72A663-2.59A645Cb(叶绿素b的浓度mg·L-1)=22.88A645-4.67A663CT=8.05A663+20.29A645叶绿素含量（mg/g）=C-3T(mg/L)×提取液体积（mL）×稀释倍数×10/样品鲜重（g）2.3.2.3可溶性糖的的测定采用李合生和孙群[73]的方法。称取鲜样0.5g剪碎，加入少许石英砂和2ml10%三氯醋酸（TCA）提取液，充分研磨成浆，将匀浆转入离心管中，再加入3ml提取液进一步研磨，以上匀浆均完全转入离心管中，在4000r/min条件下离心10min，上清液即为样品提取液，然后从中吸取2ml上清液（对照加2ml蒸馏水）于新的离心管中，加入2ml0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，再将混合液体置于沸水浴中充分反应15min，待其冷却后再进行一次离心。最后取离心后的上清液分别测定450nm波长下的吸光度。可溶性糖浓度C(mmol/L)=11.71A450可溶性糖含量(mmol/gFW)=可溶性糖浓度C(mmol/L)×提取液体积(ml)×10-3/样品鲜重(g)2.3.2.4脯氨酸的测定采用茚三酮比色法[74]。取各处理马铃薯新鲜叶片(剪碎的)0.2g，加入5ml磺基水杨酸溶液(浓度为3%）进行提取，于沸水浴中浸提10min，提取过程中要经常摇动，待其冷却至室温后，从中吸取2ml上清液于新的离心管中，再加入2ml冰乙酸和3ml2.5%酸性茚三酮显色液，在沸水浴中加热30min，溶液呈现红色，放冷水中冷却，再加入4ml甲苯，上下充分摇动将其萃取完全，用移液枪轻轻吸取上层红色液体于比色皿中，以甲苯溶液为对照，在520nm波长下进行比色。表2-1脯氨酸标准曲线制作的试剂配制方法Table2-1Madeofprolinestandardcurve管号0123456标准脯氨酸（ml）00.20.40.81.21.62.0H2O(ml)21.81.61.20.80.40冰乙酸(ml)2222222显色液(ml)3333333脯氨酸含量(g)0248121620脯氨酸标准曲线的制作：称取25mg脯氨酸，将其定容至总量250mL，取其中的10mL再次定容至100mL，即配制成10g/L的脯氨酸标准液，试剂配制如下表2-1：在7支试管中按照列表逐一加入各试剂，充分混匀后进行沸水浴30min，冷却后再加入5mL甲苯充分振荡，达到萃取完全的目的。静置一段时间后，待分层明显后吸取上层红色液体在520nm波长下测吸光度，以“0”管为对照。按照脯氨酸含量为横轴，吸光度为纵轴绘制标准曲线，求线性回归方程。10 材料与方法图2-1脯氨酸标准曲线Figure2-1Thestandardcurveofproline2.3.2.5SOD、POD和可溶性蛋白的测定酶液的制备：称取0.5g新鲜马铃薯叶片，剪碎混匀，放入研钵中，加5ml10mmol/L磷酸缓冲液（含4%PVP），冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，在10000r/min条件下冷冻离心20min，然后将上层酶液在4℃条件下冷藏备用，但不宜时间过长。SOD的测定[75]：同时取四支型号一致的试管，其中两只分别吸取0.05ml的酶液，加入2.95ml反应液(反应液中各成分比例为：磷酸缓冲液:MetNBTEDTA-Na2核黄素（FD）H2O=1533332.5)共3ml，4000lx照光（光照培养箱）30min（尽量做到照光情况一致）。另两支不加酶液，以等体积的缓冲液代替，其中一支置于黑暗处，作空白；另一支与酶液同置于4000lx条件下，照光30min，作对照（CK），温度控制在2535℃之间，至反应结束后，立即遮光保存，以空白调零，迅速在560nm波长下比色。SOD活性单位以抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原50%所需酶量（测得样品管的吸光度要在最大管的1/2左右较为合适，否则需要调整酶量）为1个酶活单位（U），计算公式如下：SOD活性（U/gFW)=（ACK-AE）×酶液总体积（ml）/(0.5×ACK×测定时酶液用量（ml）×样品鲜重(g))式中：SOD活性ACK为照光后的对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度。POD的测定[76]：取型号一致的试管，加2.2mlPBS、0.6ml1%愈创木酚和0.05ml酶液，快速加0.15ml0.1mol/LH2O2后反应开始立即进行测量，以不加酶液的为对照进行调零。在470nm波长下每隔1min读数一次，共读三次，以每分钟吸光度变化值表示酶活力的大小，POD活性单位以每分钟吸光度值变化（升高）0.01为1个酶活单位（U），计算公式如下：11 东北农业大学农学硕士学位论文POD活性（U/min·g-1FW）=ΔA470×酶液总体积（ml）/（0.01×测定时酶液用量（ml）×反应时间（min）×样品鲜重(g))式中：ΔA470为反应时间内的吸光值变化。可溶性蛋白的测定：0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL乙醇（浓度为90%）中，完全溶解后加入100mL磷酸（浓度为85%），加蒸馏水定容至1000mL，过滤后遮光保存。取型号一致的试管，加20μL酶液和3mLG-250，静置2min，于595nm波长下比色。以20μL缓冲液+3mLG-250做对照调零。计算公式如下：可溶性蛋白含量（mg/g·FW）=(C×V/Va)/W2.3.2.6根系活力的测定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[77]测定。TTC标准曲线的制作：取0.4％TTC溶液0.2mL放入烧杯中，加9.8mL乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇匀，则立即产生红色的TTF。此溶液浓度为每毫升含有TTF80μg。分别取此溶液0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL置10mL刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF20μg、40μg、80μg、120μg、160μg的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。表2-2根系活力标准曲线制作的试剂配制方法Table2-2Madeofrootgrowthactivitystandardcurve管号12345标准TTF(ml)0.250.501.001.502.00乙酸乙酯(ml)9.759.509.008.508.00显色液(ml)1010101010TTF含量(ug)204080120150得到标准曲线：四氮唑还原量(mg)=（A+0.064）/3.7125放入烧杯根样品0.5g中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液（pH7.0）各5mL（与此同时做对照加1mol/L硫酸2ml），使液体完全浸没根，在37℃下暗保温2h，此后加入硫酸2mL（用以停止反应）。把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯2.5mL，充分研磨（为提出TTF）。把红色提取液移入10ml试管中，并用乙酸乙酯把残渣洗涤4次，使总量为10mL，用分光光度计在波长485nm下比色，以对照作参比测出吸光度，查标准曲线，按下列公式计算，即可求出TTC还原量。四氮唑还原强度（mg/gFW/h）＝四氮唑还原量（mg）/（根重（g）×时间（h））2.4数据统计数据整理采用MicrosoftExcel（Office2003）软件完成；方差分析及差异显著性测验采用DPS7.0数据处理系统[78]完成，采用Duncan's新复极差法进行多重比较及差异显著性分析。12 结果与分析3结果与分析3.1马铃薯脱毒试管苗的耐盐性评价和耐盐临界浓度筛选3.1.1盐胁迫对脱毒试管苗形态指标的影响形态指标可以直观的反映脱毒试管苗发育的状况，马铃薯脱毒试管苗的生长随着盐浓度的升高受到的抑制越来越明显，在50mmol·L-1NaCl时，马铃薯脱毒试管苗茎叶和根的生长受到了轻微的抑制；盐胁迫浓度提高到100~200mmol·L-1时，马铃薯脱毒试管苗茎叶和根系生长都受到严重的抑制，但根所受的抑制小于茎叶所受的抑制；当盐胁迫浓度进一步提高至250mmol·L-1时，马铃薯脱毒试管苗地上部分与地下部分生长基本处于停滞。克新23号在200mmol·L-1NaCl胁迫下不能生长，所以只有0~150mmol·L-1NaCl浓度下的形态指标。3.1.1.1盐胁迫对马铃薯脱毒试管苗株高的影响由图3-1可知，五种马铃薯脱毒试管苗随着NaCl浓度的升高株高都呈现下降的趋势。在50mmol·L-1NaCl时，克新4号和克新18号马铃薯脱毒试管苗株高与对照相比下降幅度相对较小，下降了20.21%和17.97%；克新13号、克新23号和克新25号马铃薯脱毒试管苗株高与对照差异显著，下降幅度较大，为34.42%、41.39%和36.49%。在100mmol·L-1NaCl时，克新4号和克新18号马铃薯脱毒试管苗株高下降幅度较小，下降了49.31%和35.84%；克新13号、克新23和克新25号马铃薯脱毒试管苗株高与对照相比大幅度下降，下降了64.87%、77.53%和74.60%。当NaCl浓度达到150mmol·L-1时，克新18号和克新4号下降幅度较小，分别降低了64.33%和72.76%，其他三个品种都降低幅度达到82.00%以上。当NaCl浓度达到200mmol·L-1时，四种马铃薯脱毒试管苗植株高度基本只剩对照的10%。图3-1NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗株高的变化Figure3-1ThevariationontheplantheightofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress13 东北农业大学农学硕士学位论文3.1.1.2盐胁迫对马铃薯脱毒试管苗茎粗的影响由图3-2可知，五种马铃薯脱毒试管苗随着NaCl浓度的升高茎粗都呈现增粗的趋势。在50mmol·L-1NaCl时，克新18号马铃薯脱毒试管苗茎粗与对照差异不显著，只增加了1.28%；克新13号和克新23号马铃薯脱毒试管苗茎粗与对照差异显著，增加幅度较大，为30.31%和42.24%；克新4号和克新25号分别增加了16.75%和22.05%。在100mmol·L-1NaCl时，克新18号马铃薯脱毒试管苗茎粗增粗幅度最小，只上升了38.56%；克新23号马铃薯脱毒试管苗茎粗与对照相比增加幅度最大，达到110.90%；克新4号、克新13号和克新25号马铃薯脱毒试管苗茎粗增加了50.99%、56.63%和62.43%。当NaCl浓度达到150mmol·L-1时，克新18号上升幅度最小，增粗了49.41%，其他四个品种变化幅度较大，克新4号、克新13号、克新23号和克新25号分别增粗了61.26%、71.18%、118.30%和72.89%。当NaCl浓度达到200mmol·L-1时，四种马铃薯脱毒试管苗茎粗基本达到对照的2倍。图3-2NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗茎粗的变化Figure3-2ThevariationonthebasestemofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress3.1.1.3盐胁迫对马铃薯脱毒试管苗茎叶鲜重的影响由图3-3可知，五种马铃薯脱毒试管苗随着NaCl浓度的升高茎叶鲜重重量都呈现下降的趋势。在50mmol·L-1NaCl时，克新4号马铃薯脱毒试管苗茎叶鲜重与对照差异不显著，只下降了12.56%；克新23号和克新25号马铃薯脱毒试管苗茎叶鲜重与对照差异显著，下降幅度较大，为41.49%和41.56%；克新13号和克新18号分别下降了18.43%和18.21%。在100mmol·L-1NaCl时，克新4号马铃薯脱毒试管苗茎叶鲜重重量下降幅度最小，只下降了16.43%；克新23号和克新25号马铃薯脱毒试管苗茎叶鲜重重量与对照相比下降幅度最大，达到71.23%和62.83%；克新13号和克新18号马铃薯脱毒试管苗茎叶鲜重重量下降了43.36%和43.98%。在150mmol·L-1NaCl时，克新4号降低幅度最小，下降了25.33%，克新23号和克新25号下降幅度较大，分别降低了78.45%和77.59%，克新13号和克新18号下降了67.48%和59.10%。14 结果与分析图3-3NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗茎叶鲜重的变化Figure3-3ThevariationontheshootfreshweighofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress3.1.1.4盐胁迫对马铃薯脱毒试管苗根鲜重的影响由图3-4可知，五种马铃薯脱毒试管苗随着NaCl浓度的升高根鲜重重量都呈现下降的趋势。在50mmol·L-1NaCl时，克新4号马铃薯脱毒试管苗根鲜重重量与对照无明显差异，只下降了6.87%；克新23号马铃薯脱毒试管苗根鲜重重量与对照差异显著，下降幅度较大，为51.24%；克新13号、克新18号和克新25号分别下降了12.99%、8.55%和20.00%。在100mmol·L-1NaCl时，克新4号和克新18号马铃薯脱毒试管苗根鲜重重量下降幅度最小，下降了34.05%和34.22%；克新13、克新23和克新25马铃薯脱毒试管苗根鲜重重量与对照相比下降幅度最大，达到62.77%、80.27%和69.58%。在150mmol·L-1NaCl时，克新4号和克新18号马铃薯脱毒试管苗根鲜重重量下降幅度较小，下降了66.32%和59.00%；克新13号、克新23号和克新25号马铃薯脱毒试管苗根鲜重重量与对照相比下降幅度较大，达到83.98%、88.91%和90.42%。在200mmol·L-1NaCl时，克新4号、克新13号和克新18号马铃薯脱毒试管苗根鲜重重量下降幅度较小，下降了86.46%、93.94%和83.19%。3.1.2盐胁迫对脱毒试管苗生理指标的影响3.1.2.1盐胁迫对马铃薯脱毒试管苗叶绿素含量的影响由图3-5可知，五种马铃薯脱毒试管苗随着NaCl浓度的升高叶绿素含量都呈现下降的趋势。在50mmol·L-1NaCl时，克新18号马铃薯脱毒试管苗叶绿素含量与对照差异不显著，只下降了9.68%；克新23号马铃薯脱毒试管苗叶绿素含量与对照差异显著，下降幅度最大，为39.82%；克新4号、克新13号和克新18号马铃薯脱毒试管苗叶绿素含量分别下降了22.52%、22.57%和28.14%。在100mmol·L-1NaCl时，五种马铃薯脱毒试管苗叶绿素含量都大幅度下降，其中克新4号、克新13号、克新18号和克新25号下降幅度较小，分别下降了42.88%、15 东北农业大学农学硕士学位论文43.00%、43.08%和46.93%；克新23号下降幅度较大，下降了60.33%。在150mmol·L-1NaCl时，除克新18号马铃薯脱毒试管苗叶绿素含量是对照含量的32.61%外，其余四个品种马铃薯脱毒试管苗叶绿素含量基本只剩对照含量的20.0%。当NaCl浓度达到200mmol·L-1时，四种马铃薯脱毒试管苗叶绿素含量基本只剩对照的10%。图3-4NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗根鲜重的变化Figure3-4ThevariationontherootfreshweightofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress图3-5NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗叶绿素的变化Figure3-5ThevariationonthechlorophyllcontentsofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress3.1.2.2盐胁迫对马铃薯脯氨酸含量的影响由图3-6可知，5种马铃薯脱毒试管苗脯氨酸含量50~200mmol·L-1NaCl胁迫下的脯氨酸含量均高于对照，但每个品种的增长幅度与峰值各不相同，除克新23号马铃薯脱毒试管苗随着NaCl浓度的升高脯氨酸含量都呈现逐渐上升趋势外，其他四个品种马铃薯脱毒试管苗随着NaCl浓度的升高脯氨酸含量呈现先升高后降低的趋势。当NaCl浓度为50mmol·L-1时，克新4号、克新13号、克新18号和克新25号与对照差异不明显，分别升高了7.45%、10.32%、2.95%16 结果与分析和8.69%，但克新23号的脯氨酸含量与对照存在明显性差异，升高了53.14%。当NaCl浓度达到100mmol·L-1时，克新25号马铃薯脱毒试管苗脯氨酸含量达到最大值，比对照升高了31.25%；当NaCl浓度达到150mmol·L-1时，克新4号、克新13号和克新18号马铃薯脱毒试管苗脯氨酸含量达到最大值，分别比对照升高了25.12%、49.99%和15.02%。在0~200mmol·L-1NaCl浓度下，克新4号、克新18号和克新25号马铃薯脱毒试管苗脯氨酸含量变化幅度比较小，克新13号变化幅度比较大，而克新23号变化幅度最大。在每个NaCl浓度下，马铃薯脱毒试管苗脯氨酸含量大小均表现为克新18号>克新13号>克新4号>克新25号。图3-6NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗脯氨酸的变化Figure3-6ThevariationonoheprolinecontentsofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress3.1.2.3盐胁迫对马铃薯可溶性蛋白含量的影响由图3-7可知，随NaCl浓度的升高，五种马铃薯脱毒试管苗呈现逐渐下降趋势。当NaCl浓度为50mmol·L-1时，克新4号与对照无明显差异，只下降了3.91%，而克新13号、克新18号、克新23号和克新25号与对照相比都产生明显差异，分别下降了22.86%、20.61%、31.53%和32.29%。当NaCl浓度为100mmol·L-1时，克新13号和克新18号与对照相比分别下降幅度较小，下降了33.08%和31.02%；克新25号下降幅度较大，下降了60.05%；克新4号和克新23号下降了43.79%和44.69%。当NaCl浓度为150mmol·L-1时，克新18号的可溶性蛋白含量下降幅度最小，下降了48.96%，其他四个品种下降幅度较大。当NaCl浓度为200mmol·L-1时，克新18号的可溶性蛋白含量下降幅度最小，下降了75.37%，其他三个品种下降幅度较大。3.1.2.4盐胁迫对马铃薯可溶性糖含量的影响由图3-8可知，随着NaCl浓度的升高，5种马铃薯脱毒试管苗的可溶性糖含量呈现先上升后下降的变化；克新4号、克新18马铃薯脱毒试管苗可溶性糖含量在50mmol·L-1NaCl时达到最大值，而克新13号、克新23号和克新25号马铃薯脱毒试管苗可溶性糖含量在100mmol·L-1NaCl时达到最大值。当NaCl浓度为50mmol·L-1时，克新25号与对照无明显差异，只升高了4.77%，而克新13号和克新23号与对照存在明显差异，升高了33.68%和24.34%，而克新4号和克新18号升高了10.29%和12.99%。当NaCl浓度为100mmol·L-1时，克新4号和克新18号与对照差异不17 东北农业大学农学硕士学位论文大，只下降了3.07%和15.32%；克新23号和克新25号与对照相比差异不大，只升高了28.73%和10.56%；克新13号与对照存在明显差异，升高了62.35%。当NaCl浓度为150mmol·L-1时，克新18号与对照相比下降幅度较小，只下降了27.23%，克新25号与对照相比下降幅度较大，下降了46.38%，克新4号、克新13和克新23分别下降了32.19%、36.88%和34.61%。当NaCl浓度为200mmol·L-1时，克新18号的可溶性蛋白含量与对照相比下降幅度较小，下降了37.47%，其他三个品种下降幅度较大，分别下降了56.30%、52.63%和62.39%。3-7NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗可溶性蛋白的变化Figure3-7ThevariationonthesolubleproteincontentsofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress图3-8NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗可溶性糖的变化Figure3-8ThevariationonthesolublesugarcontentsofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress3.1.2.5盐胁迫对马铃薯脱毒试管苗SOD活性的影响由图3-9可知，随着NaCl浓度的升高，5种马铃薯脱毒试管苗的SOD活性呈现先逐渐下降后迅速下降的变化。当NaCl浓度为50mmol·L-1时，5种马铃薯脱毒试管苗的SOD活性克新13号和克新18号与对照无明显差异，分别下降了10.47%和2.23%，而克新23号与对照相比存在18 结果与分析显著下差异，下降了14.23%，克新4号和克新25号下降了7.22%和10.06%。当NaCl浓度为100mmol·L-1时，克新4号、克新18号与对照差异不明显，下降了11.16%和6.91%；克新13号、克新23号和克新25号与对照相比差异明显，下降了24.44%、23.47%和21.78%。当NaCl浓度为150mmol·L-1时，克新18号与对照无明显差异，只下降了15.66%；其他品种下降幅度较大，分别下降了25.91%、49.33%、38.08%和37.73%。图3-9NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗SOD活性的变化Figure3-9ThevariationontheSODactivityofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress3.1.2.6盐胁迫对马铃薯脱毒试管苗POD活性的影响由图3-10可知，随着NaCl浓度的升高，除克新23号的POD活性呈现逐渐上升趋势外，4种马铃薯脱毒试管苗的POD活性呈现先上升后下降的变化趋势，克新4号、克新18号马铃薯脱毒试管苗POD活性在50mmol·L-1NaCl时达到最大值，克新13号、克新25号马铃薯脱毒试管苗POD活性在100mmol·L-1NaCl时达到最大值。当NaCl浓度为50mmol·L-1时，克新4号、克新18号和克新23号马铃薯脱毒试管苗的SOD活性含量对照差异不明显，上升了1.75%、8.90%和7.38%，而克新4和克新13与对照相比上升了36.23%和27.53%。当NaCl浓度为100mmol·L-1时，克新23号与对照差异不明显，上升了14.14%；克新13号与克新25号对照差异明显，上升了84.39%和50.38%，克新4号和克新18号与对照差异不明显，下降了12.01%和4.12%。当NaCl浓度为150mmol·L-1时，克新4号和克新18号与对照存在明显性差异，下降了23.50%和36.53%；克新13号与对照存在明显性差异，上升了75.36%，克新23号和克新25号与对照不存在明显性差异，上升了30.92%和18.48%。当NaCl浓度为200mmol·L-1时，克新13号和克新25号与对照不存在明显性差异，下降了15.72%和1.23%；克新4号和克新18号与对照存在明显性差异，下降了59.31%和63.49%。19 东北农业大学农学硕士学位论文图3-10NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗POD活性的变化Figure3-10ThevariationonthePODactivityofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress3.1.2.7盐胁迫对马铃薯根系活力的影响由图3-11可知，5个马铃薯品种脱毒试管苗根系活力变化趋势相似，均随NaCl胁迫浓度增加逐渐降低，但不同马铃薯品种下降的幅度不同。当NaCl浓度为50mmol·L-1时，克新18号的根系活力与对照相比下降幅度较小，分别下降了13.6%，而其他四个品种下降幅度较大，分别下降了20.17%、26.39%、26.89%和23.60%。当NaCl浓度达到100mmol·L-1时，克新4号、克新13号和克新18号的根系活力下降幅度较小，与对照相比分别降低了52.46%、54.44%和44.32%；克新23号和克新25号根系活力下降幅度较大，下降了67.76%和62.12%。当NaCl浓度达到150mmol·L-1时，克新13号和克新18号的根系活力下降幅度较小，与对照相比分别降低了69.71%和62.08%；克新4号、克新23号和克新25号根系活力下降幅度较大，分别下降了76.50%、85.89%和84.00%。当NaCl浓度达到200mmol·L-1时，克新4号、克新13号和克新18号分别下降了91.37%、92.21%和81.59%。图3-11NaCl胁迫下马铃薯脱毒试管苗根系活力的变化Figure3-11ThevariationontherootgrowthactivityofinvitroplantletsofpotatounderdifferentconcentrationsofNaClstress20 结果与分析3.1.3耐盐临界浓度的筛选马铃薯品种脱毒试管苗克新18号和克新23号，在不同培养基上植株生长状况差异极显著。在100mmol·L-1NaCl培养基上，克新18号脱毒试管苗与对照相比存在明显差异，但植株各个部分生长正常，克新23号脱毒试管苗与对照相比存在极明显差异，植株各个部分生长极其缓慢；在150mmol·L-1NaCl培养基上，克新18号叶芽可以再生，但其生长速度缓慢，根的生成量相对较少，而克新23号叶芽可以再生，但其生长速度极其缓慢，根的生成量很少；在200mmol·L-1NaCl培养基上各个品种生长差异极为显著，克新18号根的生成量很少，但生的叶芽也能正常生长，完成植株再生过程，而克新23号再此浓度下根与新的腋芽都不再生长，并且老叶呈现黄绿色。在150mmol·L-1NaCl培养基上既可以保证植株存活，又能表现出不同品种耐盐碱能力的差异。因此，本试验所选取的耐盐临界浓度为：150mmo·L-1lNaCl。表3-1不同浓度盐处理对马铃薯脱毒试管苗生长的影响Table3-1Impactonthegrowthofpotatoplantletstreatedwithdifferentsaltconcentrations品种部位100mmol·L-1NaCl150mmol·L-1NaCl200mmol·L-1NaCl根比较多比较少少量绿色，但有少量花叶绿色绿色克新18号叶有，生长速度特别新生腋芽有，生长速度慢有，生长速度慢慢根比较少少量无叶绿色，但有少量花叶黄绿黄绿克新23号可生长，但显著慢于对新生腋芽有，生长速度极慢无照3.2耐盐无性系筛选体系的建立3.2.1薯块愈伤组织诱导3.2.1.1不同光质对愈伤组织的影响愈伤组织培养选取马铃薯的微型薯作为外植体，切成适当大小组织块接种到配好的每1L含1mlZT和4mlIAA的培养基中。将切好的薯块暗培养2天。每个品种分成4组，分别放在暖光、冷光、红白光和红蓝光下进行培养，观察愈伤组织的诱导和生长情况。五个马铃薯品种的薯块产生愈伤组织，且诱导率均在85%以上，愈伤组织呈现浅绿色、乳白色、黄绿色、淡黄色、绿色。接种7d左右有个别的薯块边缘卷曲并开始出现细胞增生膨大，11d后愈伤就可敷满材料表面。五个马铃薯品种的薯块在同一培养基诱导所产生的愈伤21 东北农业大学农学硕士学位论文组织的数量及质量也有所不同。克新13号产生的愈伤组织主要围绕在薯块周边。克新18号产生的愈伤组织呈绿色，愈伤量最大，并且愈伤组织长势旺盛，生长较快，表面形成小突起，质地较致密，色泽鲜艳。克新25号产生愈伤组织，但愈伤组织量偏少，生长较缓慢，缺乏光泽。表3-2马铃薯薯块在光处理中产生的愈伤组织Table3-2Callusformationonpiecesofthepotatointhetreatmentoflight愈伤组织颜色和再生植株品种光接种数愈伤量诱导率（%）形状诱导率（%）热光4292.80.00冷光4297.6浅绿色，小2.38克新4号++红白光4292.8突起0.00红蓝光3994.90.00热光4887.50.00乳白色，晶冷光4893.80.00克新13号+体状，较疏红白光4891.30.00松红蓝光4891.30.00热光46872.17冷光4693.5绿色，6.52克新18号+++红白光4695.7小突起6.52红蓝光4693.52.17热光4292.87.14黄绿色，有冷光4297.64.76克新23号+++白霜，大突红白光3585.75.71起红蓝光3591.40.00热光3585.70.00淡黄色，有冷光3694.40.00克新25号+白霜，较疏红白光3691.70.00松红蓝光3691.70.00注：“+”越多表示产生愈伤组织的量越多。3.2.1.2不同部位对愈伤组织诱导耐盐无性系脱毒试管苗的影响由表3-3可知，切割微型薯木质部对愈伤组织诱导成苗率高于切割微型薯髓部对愈伤组织诱导成苗率，且存在显著性差异。22 结果与分析表3-3不同部位对愈伤组织诱导耐盐无性系脱毒试管苗的影响Table3-3Effectofdifferentpartsonthesaltresistantclonesofcallus品种部位愈伤数出苗数髓部400克新4号皮层部361髓部360克新13号皮层部360髓部662克新18号皮层部606髓部601克新23号皮层部565髓部420克新25号皮层部4803.2.2耐盐再生植株的诱导将薯块恢复绿色并有颗粒状胚性愈伤的薯块转至含有150、200、250mmol·L-1NaCl的愈伤诱导培养基上培养，直至再生植株长至1~2cm（图3-12）。3.2.3耐盐再生植株的初步筛选将再生植株经过MS培养基继代一次，转接在含有100mmol·L-1NaCl的MS培养基上进行初步筛选，淘汰生长速度慢、生根能力差的再生植株。在250mmol·L-1NaCl浓度下，五个品种马铃薯的愈伤组织在热光、冷光、红白光和红蓝光处理下都没有出现不定芽分化（既没有再生植株生长）。在200mmol·L-1NaCl浓度下，克新4号的愈伤组织在冷光处理下出现不定芽分化，耐盐无性系材料命名为克新4-1-200号；克新18号的愈伤组织在冷光、红白和红蓝光下出现不定芽分化，耐盐无性系材料命名为克新18-1-200号、克新18-2-200号、克新18-3号-200号和克新18-4-200号。在150mmol·L-1NaCl浓度下，克新18号的愈伤组织在暖光、红白光和冷光下出现不定芽分化，耐盐无性系材料命名为克新18-1-150号、克新18-2-150号、克新18-3-150号、克新18-4-150号。克新23号的愈伤组织在冷光、暖光和红白光下出现不定芽分化，耐盐无性系材料命名为克新23-1-150号、克新23-2-150号、克新23-3-150号、克新23-4-150号、克新23-5-150号和克新23-6-150号（图3-13）。23 东北农业大学农学硕士学位论文ABA：克新4号和克新23号的愈伤组织在盐胁迫下形成的诱导植株；B：克新18号的愈伤组织在盐胁迫下形成的诱导植株A:TheplantsinducedbycallusundersaltstressinthecallusofKenxin4andKenxin23;B:TheplantsinducedbycallusundersaltstressinthecallusofKenxin4图3-12愈伤组织在盐胁迫下的诱导植株Figure3-12Callusplantinducedbysaltstress3.3耐盐无性系材料耐盐性的评价3.3.1耐盐无性系的材料选择根据耐盐无性系材料的株高和生长情况（图3-13），选择耐盐无性系克新4-1-200号（以下简称克新4-1号）、克新18-1-150号（以下简称克新18-1号）、克新18-3-200号（以下简称克新18-3号）和克新23-3-150号（以下简称克新23-3号），对耐盐无性系材料进行形态和生理指标测定，并评价其耐盐性。24 结果与分析ABA：克新18号的愈伤组织在150mmol·L-1和200mmol·L-1NaCl形成的耐盐无性系材料；B：克新23号的愈伤组织在150mmol·L-1NaCl耐盐无性系材料A:ThesaltresistantclonesofthecallusoftheKexin18in150mmol·L-1and200mmol·L-1NaCl;B:ThesaltresistantclonesofthecallusoftheKexin23in150mmol·L-1NaCl图3-13耐盐无性系材料Figure3-13SaltresistantclonematerialsFigure3-14Selectionofsaltresistantclonesmaterials3.3.2盐胁迫下耐盐无性系材料的形态指标在250mmol·L-1NaCl条件下，脱毒试管苗基本无法正常生长(除克新18-3号)，因此其他3个品种的形态指标测定时取样只有0～200mmol·L-1NaCl条件下的脱毒试管苗。以0mmol·L-1NaCl的耐盐无性系材料为对照。3.3.2.1盐胁迫下对耐盐无性系材料株高的影响由表3-4可知，4个耐盐无性系材料随着NaCl浓度的升高株高都呈现下降的趋势。在25 东北农业大学农学硕士学位论文0mmol·L-1NaCl时，克新23-3号的植株高度与与其他三份材料存在显著性差异。在临界盐浓度150mmol·L-1NaCl下，四份耐盐无性系材料存在明显差异，克新18-3号的株高与对照相比下降幅度较小，下降了60.82%；克新23-3号的植株高度与对照相比下降幅度较大，下降了87.90%，克新4-1号和克新18-1与各自对照相比下降了69.52%和72.91%。在200mmol·L-1NaCl时，四份耐盐无性系材料存在明显差异，分别下降了85.26%、87.23%、81.16%和88.25%。表3-4不同浓度NaCl处理下耐盐无性系材料的株高的方差分析Table3-4VarianceanalysisofdifferentNaClconcentrationsontheplantheightofsalttolerantclonesNaCl耐盐无性系材料（cm）(mmol/L)克新4-1号克新18-1号克新18-3号克新23-3号010.04a9.71a10.67a5.87b1503.06b2.63c4.18a0.71d2001.48b1.24c2.01a0.69d2500.00b0.00b0.33a0.00b3.3.2.2盐胁迫下对耐盐无性系材料茎粗的影响由表3-5可知，4个耐盐无性系材料随着NaCl浓度的升高茎粗都呈现增粗的趋势。在0mmol·L-1NaCl时，克新23-3号的植株茎粗与与其他三份材料存在显著性差异。在临界盐浓度150mmol·L-1NaCl下，四份耐盐无性系材料存在明显差异，克新18-3号的茎粗与对照相比增粗幅度较小，增粗了68.29%；克新23-3的植株茎粗与对照相比增粗幅度较大，增粗了195.24%，克新4-1号和克新18-1号与各自对照相比增粗了73.81%和94.19%。在200mmol·L-1NaCl时，四份耐盐无性系材料存在明显差异，分别增粗了105.95%、112.79%、100.00%和242.86%。表3-5不同浓度NaCl处理下耐盐无性系材料的茎粗的方差分析Table3-5VarianceanalysisofdifferentNaClconcentrationsonthebasestemofsalttolerantclonesNaCl耐盐无性系材料（mm)(mmol/L)克新4-1号克新18-1号克新18-3号克新23-3号00.084a0.086a0.082a0.063b1500.146c0.167b0.138d0.186a2000.173b0.183b0.164c0.216a2500.000b0.000b0.184a0.000b3.3.2.3盐胁迫下对耐盐无性系材料茎叶鲜重的影响由表3-6可知，四种耐盐无性系材料随着NaCl浓度的升高茎叶鲜重都呈现下降的趋势。在0mmol·L-1NaCl时，克新4-1号和克新23-3号的植株茎叶鲜重与其他两个耐盐材料存在明显差异。在临界盐浓度150mmol·L-1NaCl下，四个耐盐无性系材料存在显著差异，克新4-126 结果与分析号与对照相比下降幅度较小，下降了25.27%；耐盐无性系材料克新23-3号的茎叶鲜重与对照下降幅度较大，下降了80.76%；克新18-1号和克新18-3号的茎叶鲜重下降了57.47%和55.72%。在200mmol·L-1NaCl时，四个耐盐无性系材料存在显著差异，克新4-1号与对照相比下降幅度较小，下降了66.67%；耐盐无性系材料克新23-3号的茎叶鲜重与对照下降幅度较大，下降了86.86%；克新18-1号和克新18-3号的茎叶鲜重下降了77.72%和76.56%。表3-6不同浓度NaCl处理下耐盐无性系材料的茎叶鲜重的方差分析Table3-6VarianceanalysisofdifferentNaClconcentrationsontheshootfreshweightofsalttolerantclonesNaCl耐盐无性系材料(g)(mmol/L)克新4-1号克新18-1号克新18-3号克新23-3号01.128c2.210b2.773a0.951c1500.843c0.940b1.128a0.183d2000.376c0.491b0.651a0.125d2500.000b0.000b0.183a0.000b3.3.2.4盐胁迫下对耐盐无性系材料根鲜重的影响由表3-7可知，四种耐盐无性系材料随着NaCl浓度的升高根鲜重都呈现下降的趋势。在0mmol·L-1NaCl时，克新18-1号和克新18-3号的植株根鲜重与其他两个耐盐材料存在明显差异。在临界盐浓度150mmol·L-1NaCl下，四个耐盐无性系材料存在显著差异，耐盐无性系材料克新18-3号与对照相比下降幅度较小，下降了62.20%；耐盐无性系材料克新23-3号的根鲜重与对照相比下降幅度较大，下降了81.33%；克新4-1号和克新18-1号分别下降了69.94%和70.25%。在200mmol·L-1NaCl时，四个耐盐无性系材料存在显著差异，四个耐盐无性系材料与各自对照相比下降了87.95%、88.25%、85.29%和89.53%。表3-7不同浓度NaCl处理下耐盐无性系材料的根鲜重的方差分析Table3-7VarianceanalysisofdifferentNaClconcentrationsontherootfreshweightofSalttolerantclonesNaCl耐盐无性系材料(g)(mmol/L)克新4-1号克新18-1号克新18-3号克新23-3号00.805b1.200a1.217a0.573c1500.242c0.357b0.460a0.107d2000.097bc0.141ab0.179a0.060c3.3.3盐胁迫下耐盐无性系材料的生理指标在250mmol·L-1NaCl条件下，脱毒试管苗无法正常生长，因此生理指标测定时取样只有0～200mmol·L-1NaCl条件下的脱毒试管苗。27 东北农业大学农学硕士学位论文3.3.3.1盐胁迫下对耐盐无性系材料叶绿素含量的影响由图3-15可知，四个耐盐无性系材料随着NaCl浓度的升高叶绿素含量都呈现下降的趋势。在0mmol·L-1NaCl时，克新4-1号与克新23-3号的叶绿素含量存在显著性差异。在临界浓度150mmol·L-1NaCl处理下，耐盐无性系材料克新18-3号与其他三个耐盐无性系存在显著性差异；克新18-3号与对照相比下降幅度较小，下降了43.99%，其他三个耐盐无性系与各自对照相比下降幅度较大，分别下降了61.83%、62.20%和72.36%。在200mmol·L-1NaCl胁迫下，克新4-1号和克新18-3与其他两个耐盐无性系相比存在显著性差异；克新4-1号和克新18-3号的叶绿素含量与各自对照下降幅度较小，下降了79.56%和78.55%，克新18-1号和克新23-3号，与各自对照下降幅度较大，下降了86.91%和87.18%。图3-15NaCl胁迫下耐盐无性系材料的叶绿素变化Figure3-15ThevariationunderNaClstressonchlorophyllcontentsofsalttolerantclones3.3.3.2盐胁迫下对耐盐无性系材料脯氨酸含量的影响由图3-16可知，四个耐盐无性系材料随着NaCl浓度的升高脯氨酸含量都呈现逐渐上升的趋势。在0mmol·L-1NaCl时，耐盐无性系克新18-3的脯氨酸含量与其他三个耐盐无性系材料存在显著性差异。在临界浓度150mmol·L-1的NaCl处理下，四个耐盐无性系材料的脯氨酸含量不存在显著性差异，克新18-3号的脯氨酸与对照相比增加幅度较小，上升了30.56%；其他三个材料上升幅度较大，增加了55.80%、59.42%和61.28%。在200mmol·L-1NaCl胁迫下，耐盐无性系材料克新18-1号和克新18-3号与其他两个材料的脯氨酸含量存在显著性差异；克新4-1号和克新18-3与各自对照相比增加幅度较小，分别上升了80.23%和73.27%；克新18-1号和克新23-3号升高了121.59%和96.71%。28 结果与分析图3-16NaCl胁迫下耐盐无性系材料脯氨酸的变化Figure3-16ThevariationunderNaClstressonprolinecontentsofsalttolerantclones3.3.3.3盐胁迫下对耐盐无性系材料可溶性蛋白的影响由图3-17可知，四个耐盐无性系材料随着NaCl浓度的升高可溶性蛋白的含量呈现逐渐下降趋势。在0mmol·L-1NaCl时，耐盐无性系材料克新18-1号和克新18-3号的可溶性蛋白含量与其他两个材料存在显著性差异。在临界浓度150mmol·L-1的NaCl处理下，耐盐无性系材料克新18-1号和克新18-3号的可溶性蛋白含量与其他两个材料存在显著性差异；耐盐无性系材料克新18-3号与对照相比下降幅度较小，下降了25.78%；克新23-3号与对照相比下降幅度较大，与对照相比下降了61.15%，克新4-1号和克新18-1号分别下降了44.87%和41.23%。在200mmol·L-1NaCl胁迫下，耐盐无性系材料克新18-1号和克新18-3号的可溶性蛋白含量与其他两个材料存在显著性差异；四个耐盐无性系材料与各自对照相比下降了78.32%、66.39%、54.45%和80.25%。图3-17NaCl胁迫下耐盐无性系材料可溶性蛋白的变化Figure3-17ThevariationunderNaClstressonsolubleproteincontentsofsalttolerantclones29 东北农业大学农学硕士学位论文3.3.3.4盐胁迫下对耐盐无性系材料可溶性糖含量的影响由图3-18可知，四个耐盐无性系材料随NaCl浓度的升高可溶性糖含量呈现下降趋势。在0mmol·L-1NaCl时，耐盐无性系材料克新4-1号的可溶性糖含量与其他三个材料存在显著性差异。在临界浓度150mmol·L-1的NaCl处理下，耐盐无性系材料克新4-1号和克新18-3号的可溶性糖的含量与其他两个材料存在显著性差异，耐盐无性系材料克新18-3号与对照相比下降幅度较小，下降了17.73%；耐盐无性系材料克新4-1号和克新18-1号与对照相比下降幅度较大，分别下降了37.18%和38.96%；克新23-3与对照相比下降了24.51%。在200mmol·L-1NaCl胁迫下，耐盐无性系材料克新18-3号的可溶性糖的含量与其他三个材料存在显著性差异；四个耐盐无性系材料与各自对照相比下降了57.07%、45.63%、36.33%和43.23%。图3-18NaCl胁迫下耐盐无性系材料可溶性糖的变化Figure3-18ThevariationunderNaClstressonsolublesugercontentsofsalttolerantclones3.3.3.5盐胁迫下对耐盐无性系材料SOD活性的影响由图3-19可知，四个耐盐无性系材料随盐胁迫的加强而SOD活性呈下降趋势。在0mmol·L-1NaCl时，耐盐材料克新23-3号的SOD活性与其他三个材料存在显著性差异。在临界浓度150mmol·L-1的NaCl处理下，耐盐无性系材料克新18-3号和克新23-3号的SOD活性与其他两个材料存在显著性差异，耐盐无性系材料克新18-3号与对照相比下降幅度较小，下降了5.31%；耐盐无性系材料克新23-3号与对照相比下降幅度较大，分别下降了28.66%；克新4-1号和克新18-1号与对照相比分别下降了14.59%和12.77%。在200mmol·L-1NaCl胁迫下，耐盐无性系材料克新18-1号和克新18-3号与其他两个材料存在显著性差异；盐无性系材料克新18-1号和克新18-3号与对照相比下降幅度较小，分别下降了25.78%和20.33%；耐盐无性系材料克新23-3号与对照相比下降幅度较大，分别下降了66.05%；克新4-1号下降了36.85%。30 结果与分析图3-19NaCl胁迫下耐盐无性系材料SOD的变化Figure3-19ThevariationunderNaClstressonSODactivityofsalttolerantclones3.3.3.6盐胁迫下对耐盐无性系材料POD活性的影响由图3-20可知，四个耐盐无性系材料随NaCl浓度的升高POD活性呈现先升高后下降趋势。在0mmol·L-1NaCl时，耐盐材料克新23-3号的SOD活性与其他三个材料存在显著性差异。在临界浓度150mmol·L-1的NaCl处理下，耐盐材料克新23-3号的SOD活性与其他三个材料存在显著性差异；克新4-1号和克新18-1号与各自对照上升幅度较小，分别上升了15.45%和13.49%；克新18-3号和克新23-3号与各自对照相比增加幅度较大，增加了33.38%和36.98%。在200mmol·L-1NaCl胁迫下，耐盐材料克新23-3号的SOD活性与其他三个材料存在显著性差异，克新23-3号与各自对照下降幅度较小，下降了12.08%；克新4-1号、克新18-1号和克新18-3号与各自对照相比增加幅度较大，分别增加了43.23%、51.90%和30.08%。图3-20NaCl胁迫下耐盐无性系材料POD的变化Figure3-20ThevariationunderNaClstressonPODactivityofsalttolerantclones3.3.3.7盐胁迫下对耐盐无性系材料根系活力的影响由图3-21可知，四个耐盐无性系材料随着NaCl浓度的升高根系活力都呈现下降的趋势。31 东北农业大学农学硕士学位论文在0mmol·L-1NaCl时，四个耐盐无性系材料的根系活力存在显著性差异。在临界浓度150mmol·L-1的NaCl处理下，耐盐无性系材料克新18-3号的根系活力与其他三个材料存在明显差异，克新4-1号和克新18-3号的根系活力与各自对照相比下降幅度较小，分别下降了53.09%和50.90%，克新18-1号和克新23-3号与各自对照相比下降幅度较大，分别下降了67.51%和68.87%。在200mmol·L-1NaCl胁迫下，克新4-1号和克新18-3号与各自对照相比下降幅度较小，分别下降了77.31%和73.41%；克新23-3号与对照相比下降幅度较大，下降了95.36%；克新18-3号下降了85.26%。图3-21NaCl胁迫下耐盐无性系材料根系活力的变化Figure3-21ThevariationunderNaClstressonrootactivityofsalttolerantclones32 讨论4讨论4.1盐胁迫对马铃薯形态指标的影响生长抑制是植物在盐胁迫下最普遍和最重要的反应[79]。本试验虽对株高、茎粗、茎叶鲜重和主根长等形态指标进行了研究。但研究发现，马铃薯植株各项形态指标对盐胁迫反应都是极为敏感，除茎粗是随着盐胁迫的加强呈现增粗趋势外，其他形态指标呈现下降趋势。证明了马铃薯是盐胁迫敏感型作物。当细胞代谢和生长受阻，生长速度变慢，但植株（被处理的）仍然存活。综合4个指标来看，盐胁迫对马铃薯脱毒试管苗茎粗影响最为严重，5个耐盐性不同的品种的茎粗都加粗，并且每个品种与处理均达到极显著水平。其次为株高，盐胁迫对5个品种马铃薯脱毒试管苗影响很大，只是克新18号和克新4号下降幅度小。这与王新伟[41]对两个品种克新12号、特鲁和张俊莲等[5]对品种大西洋的研究结果是一致的，但其灵敏度尚需进一步试验。4.2盐胁迫对马铃薯生理指标的影响植物细胞色素整个体系（盐胁迫下）遭到破坏，叶绿素含量下降，影响了色素蛋白复合体的功能，叶绿体对光能的吸收变弱（即叶肉细胞光合活性下降）[80]。研究发现，马铃薯植株叶绿素对盐胁迫反应极为敏感。因此，植株的叶绿素含量是可以作为反应指标之一（马铃薯盐逆境）。长时间高盐浓度胁迫下，马铃薯脱毒试管苗叶片叶绿素含量显著低于对照，各个处理之间差异显著。这与张景云等[81]研究二倍体脱毒试管苗、张俊莲等[5]研究品种大西洋得到的结论一致。并且宋尚文[82]对三个桑树品种进行研究、过晓明等人[83]对5个甘薯品种研究、崔兴国[84]对白车轴草的研究和轰晶等人[85]对5种绿化植物五叶地锦、扶芳藤、爬山虎、南蛇藤与金银花进行研究都得到以下结论：随着盐胁迫强度增加而植物叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素降低。出现这种情况可能是由于盐胁迫激活叶绿素酶使得叶绿素被降解的结果。本研究还发现，脱毒试管苗的耐盐性与叶绿素下降幅度呈负相关。渗透调节是植物适应盐胁迫的基本特征之一。盐胁迫下，细胞内积累一些物质，如脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖、可溶性蛋白质等，以调节细胞内的渗透势，维持水分平衡，还可以保护细胞内许多重要代谢活动所需的酶类活性[86]。脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量变化是植物适应盐胁迫的显著特征。本研究结果表明，随着NaCl浓度的增加，马铃薯体内脯氨酸得到大量积累，有利于减缓盐胁迫的伤害，植株叶片中脯氨酸含量增加高于对照。五种马铃薯脱毒试管苗在150mmol·L-1和200mmol·L-1NaCl时，脯氨酸含量出现显著下降，但依然高于对照，处理28d后细胞代谢和生长严重受阻，脯氨酸合成受到影响，其含量反而下降。此时，植株表现生长缓慢或停止，甚至死亡。在同一盐浓度处理下，马铃薯脱毒试管苗脯氨酸含量大小均表现为克新18号>克新13号>克新4号>克新25号，克新23号变化幅度过大，无法与其他四个品种一起衡量。在100mmol·L-1NaCl处理下，克新4号、克新18号马铃薯脱毒试管苗细胞33 东北农业大学农学硕士学位论文内可溶性糖含量开始下降，而克新13号、克新23号和克新25号马铃薯脱毒试管苗在100mmol·L-1NaCl时细胞内可溶性糖含量下降，这可能是呼吸作用的增强和光合作用的衰竭所致。植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，其含量的高低是了解植物体总代谢的一个重要指标[87]。本试验中，随着盐浓度的增加，五个马铃薯脱毒试管苗可溶性蛋白含量均逐渐降低，这与王宝山等[88]对沙枣的研究得到的结论基本一致。在逆境胁迫下，植物体内产生的过剩超氧阴离子O2-可使酶失活，膜脂被氧化，核酸缺失，甚至引起突变，如果盐胁迫长时间存在，则剩余O2-将会破坏膜结构，导致包括酶活性在内的生理活动受到抑制[89]。因此，植物御盐胁迫的另一途径是活性氧代谢。本试验结果表明，五个品种马铃薯脱毒试管苗的POD活性在盐处理下因品种不同呈现不同的规律。除克新23号的POD活性呈现逐渐上升趋势外，4种马铃薯脱毒试管苗的POD活性呈现先上升后下降的变化趋势，克新4号、克新18号马铃薯脱毒试管苗POD活性在50mmol·L-1NaCl时达到最大值，克新13号、克新25号马铃薯脱毒试管苗POD活性在100mmol·L-1NaCl时达到最大值。随着盐浓度的升高五种马铃薯脱毒苗SOD活性呈波动式下降，这可能是由于机体受害严重，蛋白质合成受到抑制，酶失活加剧等原因而使SOD活性下降。此结论与包云飞等[90]对品种中薯3号和中薯5号的研究得到的结论基本一致。根系活力是衡量植物根系抗御逆境能力大小的重要生理指标。盐胁迫下，植物根系最早感受逆境胁迫信号，并产生相应的生理反应[91]，并且根系活力直接影响地上部分的生长、营养状况及产量水平以及抗逆能力，但盐胁迫常导致植物根系生长受抑制。因此，植物的根系活力是可以作为马铃薯盐逆境反应指标之一。随盐浓度的升高根系活力呈下降趋势，这与张瑞玖[48]研究马铃薯紫花白得到的结论一致。本研究还发现，不同品种根系活力下降的幅度不同，并且脱毒试管苗的耐盐性与根系活力下降幅度呈负相关。4.3五个品种耐盐性评价植物耐盐性是一个受多基因控制的极为复杂的反应过程，不同植物的耐盐机理不尽相同，适应的盐临界点也大相径庭[92]。对于植物耐盐性评价，不同学者所用方法不同。在植物耐盐性研究上应用较多的是根据各个指标变化率的大小进行打分，在各种指标中均以盐伤害症状最轻的品种得分最高，依次类推，最后把各个指标得分进行相加，得到各自最终的耐盐性得分，并根据总分高低进行耐盐性排序。五个品种马铃薯脱毒试管苗的株高、根鲜重、叶绿素含量和根系活力的下降幅度由小到大为：克新18号<克新4号<克新13号<克新25号<克新23号，茎叶鲜重的下降幅度由小到大为：克新4号<克新18号<克新13号<克新25号<克新23号，茎粗的上升幅度由小到大为：克新18号<克新4号<克新13号<克新25号<克新23号。4.4耐盐临界浓度的筛选盐胁迫对植物最直接影响就是阻碍生长，形态指标常用来衡量植物的耐盐能力[93]，可供34 讨论研究者们更直观的比较材料处理前后的变化以进行评价。孙小芳等[94]认为筛选浓度会影响指标在筛选材料间差异的大小，筛选压过大或过小都使材料间的差异不表现，高方远等[95]认为合适的筛选压能够使相关指标在材料间的变异幅度和变异系数较大，易获得较好的筛选效果。马铃薯品种脱毒试管苗克新18号和克新23号在100mmol·L-1、150mmol·L-1和200mmol·L-1NaCl胁迫下，比较根、叶和新腋芽的生长情况，筛选出最适耐盐临界浓度为：150mmo·L-1lNaCl。4.5耐盐无性系筛选体系本研究首次对马铃薯微型薯的愈伤培养体系进行优化并对耐盐愈伤组织进行离体筛选。李娟[96]以费乌瑞它、东农303、下波帝、鄂1号4个马铃薯品种的叶片和茎段作为外植体进行诱导愈伤组织，卢翠华[97]等釆用6-BA和NAA配合对马铃薯极早熟品种东农303脱毒试管苗茎段进行再生体系的筛选，叶彦[98]用三个品种马铃薯京丰、紫花白、中心8的脱毒试管苗的茎段和叶片进行耐盐变异系的选择，王宪[99]和晁祥健[100]以二倍体脱毒试管苗的茎段和叶片进行再生体系的筛选。光作为一种物理因子已广泛地应用于植物组织培养过程中的形态发生、生长控制、光形态建成的研究，并且光可提高愈伤组织生长。崔堂兵等[101]不同光质光对植物愈伤组织的生长、分化、代谢与基因表达等也有一定程度的影响。郭君丽等[102]在研究光质对怀山药零余子愈伤组织分化影响时指出蓝光分化率最高，红光和白光次之，绿光和黄光较低，黑暗最差。梁钾贤等[103]研究得到红光对甘蔗愈伤组织的诱导分化出苗有明显的促进作用，白光次之，而蓝光最差，愈伤组织的继代次数越少，光质的影响越显著。本试验得出在冷光和红白光下的愈伤组织的诱导率稍高于其他两个光质下的。获得耐盐愈伤组织的途径一般有两类方法，一是将外植体直接接种到含盐培养基上诱导耐盐愈伤组织。二是将普通的愈伤组织转移到盐浓度恒定或逐次递增的培养基上，通过多次继代，选出稳定生长的愈伤组织。本试验只用了后一种方法都得到了耐盐愈伤组织，它们可能是外植体细胞在脱分化或愈伤组织生长过程中产生的变异。Nbaors[104]等认为在盐胁迫下条件下能否产生耐盐的突变体，与盐浓度和筛选的时间有关。在低水平的选择压力下可形成生理适应性细胞，不利于突变细胞的产生。选择压力必须达到足以抑制绝大多数细胞分裂和生长的程度，在含盐培养基中正常细胞几乎不能生长、分裂的情况下，才有可能筛选出突变的细胞。本试验结果表明，直接高盐胁迫下筛选到的耐盐植株才有可能是真正的耐盐突变体。所以要想筛选到真正的耐盐突变体必须提高NaCI的浓度和盐胁迫时间。但较长的胁迫时间又容易导致不定芽的分化发生困难，难以得到再生植株，这可能是马铃薯耐盐突变体筛选的技术难点所在。周荣仁[54]等选择350mmol/LNaCl对烟草进行离体筛选，张建华等[105]对番茄耐盐体细胞变异系在培养基中添加了150mmol/L和225mmol/L的NaCl进行离体筛选，韦小敏等[106]附加了150mmol/L的NaCl对玉米耐盐愈伤组织变异系进行筛选。这些研究均表明适宜的盐胁迫浓度对愈伤组织筛选耐盐突变体至关重要。本试验筛选出适宜耐盐愈伤组织形成的NaCl的35 东北农业大学农学硕士学位论文浓度为：150mmol/L和200mmol/L。4.6耐盐无性系耐盐性的评价生长抑制是植物在盐胁迫下最普遍和最重要的反应。本试验针对耐盐无性系材料的株高、茎粗、茎叶鲜重和根鲜重形态指标进行了测定，试验的得出：茎粗的增加幅度大小表现为：克新23-3号>克新18-1号>克新4-1号>克新18-3号，株高和根鲜重的降低幅度大小表现为：克新18-3号<克新4-1号<克新18-1号<克新23-3号，茎叶鲜重的降低幅度大小表现为克新4-1号<克新18-3号<克新18-1号<克新23-3号。四个耐盐无性系材料的叶绿素含量和根系活力随着NaCl浓度的升高都呈现下降的趋势，四份耐盐无性系材料叶绿素和根系活力的下降幅度大小为：克新18-3号<克新4-1号<克新18-1号<克新23-3号。四个耐盐无性系材料脱毒试管苗随着NaCl浓度的升高脯氨酸含量都呈现逐渐上升的趋势。脯氨酸含量大小表现为：克新18-1号>克新18-3号>克新23-3号>克新4-1号。四种耐盐无性系材料在可溶性糖含量和可溶性蛋白含量方面因随NaCl浓度的升高呈现下降趋势，可溶性糖含量大小表现为：克新18-3号>克新4-1号>克新18-1号>克新23-3号，可溶性蛋白含量大小表现为：克新18-3号>克新18-1号>克新4-1号>克新23-3号。四个耐盐无性系材料脱毒试管苗随NaCl浓度的升高SOD活性呈现逐渐下降趋势，SOD活性的变化大小表现为：克新18-3号<克新18-1号<克新4-1号<克新23-3号。四种耐盐无性系材料POD活性随NaCl浓度的升高呈现先升高后下降的趋势，POD活性的变化大小表现为：克新18-3号>克新4-1号>克新18-1号>克新23-3号。36 结论5结论（1）得出盐胁迫对马铃薯试管苗的茎粗影响最大，其次是株高，并且耐盐性差的品种茎叶鲜重和根鲜重变化比耐盐性强的品种茎叶鲜重和根鲜重变化的更加明显。（2）经过生理指标的测定得出：在经过盐胁迫处理后，试管苗的叶绿素含量都下降，而且盐敏感品种的下降幅度要大于耐盐品种；根系活力都呈下降趋势，而且盐敏感品种的下降幅度要大于耐盐品种。（3）采用马铃薯微型薯为外植体，每1L培养基中加入1mLZT和4mLIAA进行愈伤组织培养，诱导率均达到85%，说明此激素配比及浓度适宜耐盐愈伤组织诱导。（4）五种马铃薯脱毒试管苗耐盐性由强到弱顺序为克新18号>克新4号>克新13号>克新25号>克新23号。（5）耐盐无性系材料克新4-1-200号、克新18-1-150号、克新18-3-200号和克新23-3-150号耐盐性由强到弱顺序为克新18-3-200号>克新4-1-200号>克新18-1-150号>克新23-3-150号。37 东北农业大学农学硕士学位论文致谢首先要感谢我的导师石瑛副研究员，试验的设计和论文的撰写都离不开老师的指导，老师渊博的学识，严谨的治学态度、忘我的工作精神和宽厚善良的处世方式都深深的感染了我，为我指明了人生的方向，鼓励着我在今后的工作中也要奋发向上。同时，在论文选题和撰写方面都凝聚着老师的心血，并给予了很多的教诲和指导，在生活中老师的关心和爱护也让我倍感温暖。在今后的工作和生活中，我一定会不忘老师的教导，努力创造美好的未来！在三年的研究生学习和试验完成的整个过程中，很多老师和同学都给予了我真诚热心的帮助，在这里我特别感谢张丽莉老师在我做实验和写论文过程中对孜孜不倦的教导，同时感谢马铃薯研究室吕文河教授、魏峭嵘老师的无私指导和热心帮助；感谢师妹的付春娜、田洵、黄越、赵媛媛、梁晓丽和师弟祁驰恒、王金明热心帮助；特别感谢同届同学赵雪君、唐宏亮、李志燕、张昕对我的关心与帮助，大家在一起共同上课、共同讨论、共同成长的经历是我终生难忘的美好回忆。正是由于大家的帮助与支持，才使得我能够顺利地完成本论文。最后要特别感谢我的家人，感谢他们在精神上、物质上给予的支持与关心，是他们给了我成长的动力和信心，我要向他们致以最衷心的祝福和敬意。值此论文完成之际，谨向所有关心、支持和帮助过我的老师、同学、朋友和亲人致以最诚挚的谢意！38 参考文献参考文献[1]谷艳芳，丁圣彦，李婷婷，等．盐胁迫对冬小麦幼苗干物质分配和生理生态特性的影响[J]．生态学报，2009，29(2)：840-845．[2]赵可夫．植物抗盐生理[M]．北京：中国科学技术出版社，1993．[3]FlowersTJ．SalinisationandhortieulturalProduetion[J]．SeientiaHortieulturae，1999(78)：1-4．[4]余叔文，汤章城．植物生理与分子生物学(第一版)[M]．北京：科学技术出版社，1998，752-769．[5]张俊莲，陈勇胜，武季玲．盐胁迫下马铃薯耐盐相关生理指标变化的研究[J]．中国马铃薯，2002，6(6)：323-327．[6]江超，夏阳，杨克强．盐胁迫下紫花苜蓿苗期根部生长及生理特性研究[J]．北方园艺，2014(5)：78-82．[7]王保平，董晓燕，董宽虎．盐碱胁迫对紫花苜蓿幼苗生理特性的影响[J]．草地学报，2013，26(6)：1124-1129．[8]罗敏，张荣玉，等．玉米幼苗期耐盐性评价适宜盐浓度的研究[J]．天津农学院学报，2015，22(1)：6-9．[9]沈振荣，杨万仁，徐秀梅．不同盐分胁迫对首着种子萌发的影响[J]．种子，2006，25(4)：34-37．[10]郭彦，张文会．盐胁迫下水稻发芽特性和幼苗耐盐生理基础[J]．安徽农业科学，2006，34(6)：1053-1054．[11]张强．绿优谷对混合盐碱胁迫的生理响应[D]．东北师范大学硕士学位论文，2004．[12]崔众森，张俊莲．马铃薯脱毒试管苗对盐胁迫的生理反应[J]．中国马铃薯，2007，21(l)：1-5．[13]许兴，李树华，惠红霞，等．NaCl胁迫对小麦幼苗生长、叶绿素含量及Na+、Ｋ+吸收的影响[J]．西北植物学报，2002，22(2)：278-284．[14]SmimoffN．Plantresistancetoenvironmentalstress[J]．CurrentPinionBiotech，1998(9)：214-219．[15]补丙军，章文华，刘友良．NaCl对大麦幼苗根系蛋白质和游离氨基酸含量的影响[J]．西北植物学报，1997，17(4)：439-445．[16]梁超，王超．德抗961小麦耐盐生理特性研究[J]．西北植物学报，2006，26(10)：2075-2082．[17]何惠琴，李绍才，孙海龙，等．4种草坪草种耐盐性研究[J]．四川师范大学学报：自然科学版，2010，33(1)：97-101．[18]高战武．紫花苜蓿和燕麦抗盐碱机制研究[D]．东北师范大学博士论文，2011．[19]赵福庚，刘友良．胁迫条件下高等植物体内脯氨酸代谢及调节的研究进展[J]．植物学通报，1999，16(5)：540-546．39 东北农业大学农学硕士学位论文[20]颜宏，石德成．盐碱胁迫对羊草体内脯氨酸及几种有机代谢产物积累的影响[J]．东北师大学报(自然科学版)，2000，32(3)：47-52．[21]陈洁，林栖凤．植物耐盐生理及耐盐机理研究进展[J]．海南大学学报(自然科学版)，2003，21(2)：177-182．[22]张士功，高吉寅，宋景芝．水杨酸和阿斯匹林对盐胁迫下小麦种子萌发的作用[J]．植物生理学通讯，1999，35(1)：29-33．[23]丽锦，张学英，葛会波．果树盐胁迫生理生化特性的研究进展[J]．河北农业大学学报，2003，26(增刊)：41-44．[24]田小磊，吴晓岚，李云．盐胁迫条件下氨基丁酸对玉米幼苗SOD，POD及CAT活性的影响[J]．试验生物学报，2005，38(1)：75-79．[25]LecittJ．Responseofplantstoenvironmentalstresses[M]．1980．[26]HelalM，KochK，MengalK．EffectsofsalinityandPotassiumontheproteintrogenandnitrogenmetabolismbarley[J]．PhysiologiaPlant，1975(35)：310．[27]石德成，盛艳敏．复合盐碱生态条件的人工模拟及其对羊草生长的影响[J]．草业学报，1998．[28]孙静，吕效波，张万正．盐胁迫下小麦过氧化物酶同工酶、全蛋白变化的研究[J]．生物技术，2005，15(3)：27-28．[29]白根本，王沙生，沈听，等．用蛋白电泳分析方法探讨胡杨远缘杂种鉴定及其抗盐性[J]．北京林业大学学报，2000，22(3)：5-7．[30]潘瑞炽，董愚得．植物生理学[M]．北京：高等教育出版社，1995．[31]KennethKT．Agriculturalsalinityassessmentandmanagement[M]．NewYork：AmericanSocietyofCivilEngineers，1990．[32]刘祖祺，张石城．植物抗性生理学[M]．北京：中国农业出版社，1994，222-285．[33]康玉林，常青，田翠萍．马铃薯耐盐试验[J]．土壤肥料，1995(5):15-17.[34]康玉林，张春震．土壤含盐量对马铃薯扦插苗和脱毒小薯的影响[J]．中国马铃薯，1995，9(4)：203-205．[35]康玉林，徐利群，张春震，等．不同盐浓度对马铃薯实生苗的影响[J]．马铃薯杂志，1996，10(1)：17-19．[36]龚家栋．马铃薯不同品种耐盐性差异初步研究[J]．中国沙漠，1996，16(1)：61-66．[37]康玉林，张春震，夏佃仁，等．盐碱地马铃薯品种适应性研究[J]．马铃薯杂志，1997，11(1)：7-10．[38]王新伟．不同盐浓度对马铃薯脱毒试管苗的胁迫效应[J]．马铃薯杂志，1998，12(4)：203-206．[39]王新伟，李照河，栾鸿坤，等．马铃薯高淀粉资源脱毒试管苗抗盐性鉴定[J]．马铃薯杂志，1998，12(1)：15-18．[40]王新伟，徐龙臣，田中艳，等．马铃薯高淀粉资源田间抗盐鉴定[J]．中国蔬菜，1999(1)：25-28．[41]王新伟，滕伟丽，马异泉，等.盐胁迫下马铃薯脱毒苗上网产量及Vc含量的变化[J].东40 参考文献北农业大学学报，2000，31(3)：221-224.[42]尹江，马恢，崔红军．马铃薯亲本材料脱毒试管苗的耐盐性筛选[J]．中国马铃薯，2000，19(1)：13-16．[43]张瑞玖．NaCI胁迫下马铃薯生理生化特性及氮素调控研究[D]．内蒙古农业大学硕士论文，2007：21-23．[44]Zhang，MaftounM．RelativesalttoleranceofPistachiocultivars[J]．JHortSci，1988，63(I)：157-162．[45]Khrais．Haploidhigherplantsforplantbreeding[J]．Z.pflanzensuchtg，1972(67)：19-32．[46]VelasquezenKMH．Haploidsinphysiologicalandbiochemicalresearch[J]．Guelph，1974：339-354．[47]JavadShaterian，FawzyGeorg，etal.Roottoshootcommunicationandincalreticulingeneexpressionandsalt-stresstoleranceingrafteddiploidpotatoclones[J]EnvironmentalandExperimentalBotany，2005(5):323-332.[48]方贯娜，庞淑敏．马铃薯愈伤组织再生体系的研究进展[J]．中国马铃薯，2012，26(5)：307-310．[49]贾晓霞，文国宏．马铃薯新品种陇薯10号再生体系的建立[J]．甘肃农业科技，2013，11，5-8．[50]鲍红春，李小雷．马铃薯品种陇薯5号茎段再生体系的建立[J]．内蒙古农业科技，2014(2)：31-32．[51]朴莲玉．玉米不同外植体愈伤组织诱导及分化的研究[D]．延边大学硕士论文，2013．[52]张霞，张富春．盐生植物盐穗木悬浮细胞系的建立[J]．新疆学报，2013，50(9)：1718-1723．[53]翟风林，曹凤鸣．植物的耐盐性及其改良[M]．北京：农业出版社，1986．[54]周荣仁，杨燮荣，余叔丈，等．利用组织培养研究植物耐盐机理与筛选耐盐突变体的进展[J]．植物生理学通讯，1989(5)：11-19．[55]MathurAK．IsolationofsodiumchloridetolerantPlantletsofkiakxiaramosissimaunderinvitroeondition[J]．PlantPhysiol，1980(99)：287-313．[56]张永样，何礼远．马铃薯叶盘愈伤组织再生抗青枯病的筛选[J]．马铃薯杂志．1993，7(l)：22-26．[57]StewartCR．EffectofNaClonprolinesynthesisandutilizationinexerisedbarleyleaves[J]．PlantPhsiol．1983(72)：664．[58]陈章，陈启锋．水稻离体培养及其无性系变异的研究[J]．福建农学院学报，1992，21(l)：10-12．[59]ChaleffRS．Isolationofagronomicallyusefulmutantsfromplantcellcultures[J]．Science，1983，676-682．[60]毛桂莲，许兴．枸杞耐盐突变体的筛选及生理生化分析[J]．西北植物学报，2005，25(2)：275-280．[61]LuanYS,ZhangJ,GaoXR,etal.Mutationinducedbyethylmethanesulphonate(EMS),invitroscreeningforsalttoleranceandplantregenerationofsweetpotato[J].PlantCellTissue41 东北农业大学农学硕士学位论文OrganCult,2007,88:77–81．[62]夏英武．作物诱变育种[M]．中国农业出版社，1993．[63]杨青川，卞桂虹，刘德福．植物耐盐遗传性及分子标记研究进展[J]．中国草地．2002，24(2)：59-62．[64]杨可咏，叶和春，陈建林，等．芦苇耐盐变异植株及其细胞学鉴定[J]．植物学报，1994，36(12)：930-933．[65]王翠亭，黄占景，何聪芬，等．PCR、SSCP与测序技术相结合检测小麦耐盐突变体[J]．遗传学报．2012，8(9)：852-855．[66]杜立群，李银心，李宏杰，等．在1/3海水培养基上筛选豆瓣菜耐盐突变体[J]．植物学报，1999，41(6)：633-639．[67]MelchersG．Haploidhigherplantsforplantbreeding[J]．Z.pflanzensuchtg，1972(67)：19-32．[68]ZenkMH．Haploidsinphysiologicalandbiochemicalresearch[J]．Guelph，1974，339-354．[69]郭岩，陈少麟，张耕耘，等．应用细胞工程获得受主效基因控制的水稻耐盐突变系[J]．遗传学报．1997，24(2)：122-126．[70]李洪建．水稻耐盐突变体筛选的研究[J]．沈阳农业大学学报，1990，21(1)：53-59．[71]冯桂荃．水稻成熟胚愈伤组织耐盐突变体的筛选[J]．天津农业科学，1996(2)：6-8．[72]陶晶，秦彩云，姚露贤，等．杨树耐盐性突变体育种的研究进展[J]．吉林林业科技，2000，20(2)：5-8．[73]李合生，孙群．植物生理生化试验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社，2000．[74]邹奇．植物生理学试验指导[M]．北京：中国农业出版社，2000．[75]李仲光．在单一提取系统中同时测定五种植物抗氧化酶[J]．云南师范大学学报，2002(6)：44-47．[76]陈建勋，王晓峰．植物生理学试验指导[M]．北京：华南理工大学出版社，2000：119-122．[77]邹奇，植物生理学试验指导[M]．北京：中国农业出版社，2000．[78]唐启义，冯明光．实用统计分析及计算机处理平台[M]．北京：中国农业出版社，1997：189-192．[79]王宝山．逆境植物生物学[M]．高等教育出版社，2010．[80]杨升，张华新，张丽．植物耐盐生理生化指标及耐盐植物筛选综述[J]．西北林学院学报，2010，25(3)：59-65．[81]朱维琴，吴良欢，陶勤南．氮营养对干旱逆境下水稻体内可溶性渗透调节物质的影响[J]．浙江大学学报，2003，29(5)：479-484．[82]宋尚文，孙明高，吕延良，等．盐胁迫对3个桑树品种幼苗光合特性的影响[J]．西南林学院学报，2010，30(3)：20-23．[83]过晓明，张楠，马代夫，等．盐胁迫对5种甘薯幼苗叶片叶绿素含量和细胞膜透性的影响[J]．江苏农业科学，2010(3)：93-94．[84]崔兴国．盐胁迫对车轴草叶绿素含量及光合特性的影响[J]．黑龙江农业科学，2011(4)：78-79．42 参考文献[85]聂晶，苏伟，曹颖，等．盐胁迫对5种绿化植物叶绿素含量的影响[J]．山东林业科技，2004(3)：17．[86]FarquharCD，SharkeyTD．Stomatalconductanceandphotosynthesis[J]．AnnuRevPlantPhysiol，1982，33：317-345．[87]刘惠芬，高玉葆，张强，等．不同种群羊草幼苗对土壤干旱胁迫的生理生态响应[J]．南开大学学报，2004，37(4)：105-110．[88]王宝山，姚敦义．盐胁迫对沙枣愈伤组织膜透性、膜脂过氧化和SOD活性的影响[J]．河北农业大学学报，1993，16(3)：20-24．[89]汪月霞，孙国荣，王建波，等．Na2CO3与NaCl胁迫下星星草幼苗叶体保护酶活性的比较[J]．草业学报，2007，16(1)：81-86．[90]包云飞，程鹏，熊兴耀，等．马铃薯盐胁迫下生理生化变化研究[J]．马铃薯产业与科技扶贫，2011．[91]CramerGR，LäuchliA，EpsteinE．EffectsofNaClandCaCl2onionactivitiesincomplexnutrientandrootgrowthofcotton[J]．PlantPhysiol，1986，81：792-797．[92]张云起，刘世琦，杨凤娟，等．耐盐西瓜砧木筛选极其耐盐机理的研究[J]．西北农业学报，2003，12(4)：105-108．[93]MunnsR．Comparativephysiologyofsaltandwaterstress[J]．PlantCellEnviron，2002，25：239-250．[94]孙小芳，刘友良．棉花品种耐盐性鉴定指标可靠性的检验[J]．作物学报，2001，27(6)：794-801．[95]高方远，陆贤军，康海岐，等．水稻耐低磷种质的苗期筛选与鉴定[J]．作物学报．2006，32(8)：1151-1155．[96]李娟，程智慧，张国裕．马铃薯叶片髙效再生体系的建立[J]．西北植物报，2004，24(4)：610-614．[97]卢翠华，秦听，武小霞．马铃薯极早熟品种东农303再生体系的筛选[J]．2001，15(4)：280-281．[98]叶彦，缪树华．长期继代培养马铃薯愈伤组织的植株再生[J]．应用与环境生物报，1995，1(1)：26-33．[99]王宪，二倍体马铃薯再生体系建立及耐盐愈伤组织的筛选[D]．东北农业大学硕士论文．2012．[100]晁祥健，杨煜，金黎平，等，二倍体马铃薯高效再生体系的建立[J]．园艺学报，2009，36(1)：109-114．[101]崔堂兵，郭勇，等，提高植物细胞培养法生产次级代谢物产量的方法[J]．植物生理学报，2001，37(5)：479-481．[102]郭君丽，陈明霞，李明军，等．光质和生长物质组合对怀山药零余子脱分化和再分化的影响[J]．河南师范大学学报(自然科学版)，2003，31(2)：99-102．[103]梁钾贤，陈彪光．光质对甘蔗愈伤组织分化出苗的影响[J]．中国糖科，2006(3)：9-12．[104]NaborsMW，GibbsSE，BernsteinCS，etal．NaCl-toleranttobaccoplantsfromcultured43 东北农业大学农学硕士学位论文cells[J]．ZeitschriftfürPflanzenphysiologie，1980，97(1)：13-17．[105]张建华，陈火英，庄天明．番茄耐盐体细胞变异体的离体筛选[J]．西北植物学报，2002，22(2)：257-262．[106]韦小敏，季良越，胡彦民，等．玉米耐盐愈伤组织变异体的筛选初报[J]．河南农业大学学报，2000，34(4)：324-328．44 攻读硕士学位期间发表的学术论文攻读硕士学位期间发表的学术论文[1]周明扬，张丽莉，石瑛．NaCl胁迫对四种马铃薯脱毒试管苗生理特性的影响[J]．贵州农业科学，2015，10．(已接收)45