pm2.5与老年哮喘患者气道炎症和氧化应激反应的关系

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PM2.5与老年哮喘患者气道炎症和氧化应激反应的关系TheRelationshipbetweenPM2.5andAirwayInflammationandOxidativeStressReactioninElderlyPatientswithAsthma作者姓名：杨颖专业名称：内科学指导教师：华树成教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年6月5日 中文摘要PM2.5与老年哮喘患者气道炎症和氧化应激反应的关系目的：本文以老年哮喘患者为主要研究对象，探讨城区以及郊区PM2.5暴露，对不同区域老年哮喘患者气道炎症，以及氧化应激反应各项指标的影响，评估PM2.5在老年哮喘患者气道炎症中的作用，为其预防、治疗和管理提供一点新的思路。方法：在2013年8-9月期间，于吉林大学第一医院呼吸科门诊以及住院部收治的符合老年哮喘诊断的患者（即＞65周岁的患者）中，招募处于支气管哮喘稳定期的患者，按照其居住地不同，随机选择城区组65例，郊区组65例，对各受试者进行下列指标检测，如：肺功能测定、呼出气NO含量测定、血清超氧化物歧化酶（SOD）、血清丙二醛（MDA）含量。所有入组受试者进行为期13周的检测，检测于10~12月每周日上午，我院呼吸科门诊进行。实验期间，受试者可正常应用支气管哮喘维持治疗药物（如：甲基黄嘌呤类、β2受体激动剂、抗胆碱能药物以及其他非常规哮喘控制类药物等）。剔除实验期间出现疾病发作期、实验不耐受等情况的受试者，即城区组剔除18例，郊区组剔除14例，最终统计符合实验要求的受试者为：城区组47例，郊区组51例。根据长春市环境保护局以及吉林大学环境与资源学院提供的2013年10-12月间，长春市十个PM2.5监测点监测到的数据，提取城区与郊区每周PM2.5平均浓度值进行对比，分析城区组与郊区组受试者所检测肺功能指标、呼出气NO含量测定、SOD、MDA、心率、血压、血氧饱和度等。对大气PM2.5周平均值浓度与受试者肺功能指标、呼出气NO含量I 测定、SOD、MDA、心率、血压、血氧饱和度等相关数据进行相关性h分析。结果：（1）与市郊患者相比，市区老年哮喘患者血清MDA水平显著增高（P＜0.05）；心率、血压、血氧饱和度、肺功能、FeNO和SOD水平在两组人群间并无显著差异（P＞0.05）；（2）2013年10～12月期间城区和市郊的PM2.5平均浓度进行比较，结果显示在10.21-10.27、10.28-11.3和11.25-12.1期间长春市城区PM2.5周平均浓度显著高于城郊，差异具有统计学意义（P＜0.05）；（3）相关分析发现：PM2.5水平与受试者的心率、收缩压、舒张压呈正相关（r=0.808，p＜0.001；r=0.662，p＜0.001；r=0.696，p＜0.001），与血氧饱和度呈负相关（r=-0.685，p＜0.001），与FEV1和FEV/FVC呈负相关（r=-0.425，p＜0.05；r=-0.815，p＜0.001），与受试者的FeNO、MDA均呈正相关（r=0.499，p＜0.05；r=0.498，p＜0.05），SOD呈负相关性（r=-0.539，p＜0.05）。结论：（1）高水平PM2.5暴露能够诱发老年哮喘患者体内膜脂的过氧化。（2）大气PM2.5暴露水平升高，可导致患者的心率、血压、炎症水平和氧化应激水平升高。（3）高水平PM2.5暴露会导致患者血液携带氧的能力和肺功能降低。关键词：支气管哮喘，PM2.5，气道炎症，氧化应激II AbstractTheRelationshipbetweenPM2.5andAirwayInflammationandOxidativeStressReactioninElderlyPatientswithAsthmaObjective:Regardingtheelderlypatientswithasthmaasthemainstudysubject,thispaperistoexploretheinfluenceofPM2.5exposureinurbanandsuburbanupontheairwayinflammationdegreeandoxidativestressreactionindexofelderlypatientswithasthmaindifferentareas,bywhichassessingtheimpactofPM2.5onairwayinflammationofelderlypatientswithasthma,providingabrandnewwayforprevention,treatmentandmanagement.Method:Theauthorrecruitedthepatientswithbronchialasthmainstablestageamongtheclinicalandhospitalizedelderlypatients(>65yearsold)diagnosedasasthmaintheDepartmentofRespiratoryoftheFirstHospitalofJilinUniversityfromAugusttoSeptemberin2013.Accordingtodifferentresidentialareas,theauthorselectedrandomlytwogroups:65patientsinurbangroupand65patientsinsuburbangroup,thendetectedthefollowingindicators:lungfunction,FeNOcontent,serumsuperoxidedismutase(SOD)andmalondialdehyde(MDA)content.Allthesubjectsweretestedforcontinuous13weeks.AndtheexaminationsareconductedintheDepartmentofRespiratoryoftheFirstHospitalofJilinUniversityoneverySundaymorningIII ofOctober,NovemberandDecember.Duringtheexperiment,allthesubjectswereonthenormaldoseofbronchialasthmatreatingmedicine(suchas:methylxanthines,beta2adrenergicreceptoragonists,anticholinergictodrugsandothernon-conventionalasthma-controldrugs).Excludingthesubjectswhohappenedtobecaughtinthediseasesstageorwithexperimentalintolerance,thefinalsubjectswhoconformstotheexperimentalrequirementswereasthefollowing:urbangroup(n=47)andsuburbangroup(n=51).AccordingtothestatisticsofOctober,NovemberandDecemberin2013fromthetenPM2.5monitoringpointsinChangChunwhichwasobtainedfromtheChangchunMunicipalEnvironmentalProtectionBureauandtheEnvironmentandResourcesCollegeofJilinUniversity,theauthorextractedandcomparedtheweeklyaveragePM2.5concentrationvaluesintheurbanandsuburban,analysingtheexaminationindexesoflungfunction,FeNOcontent,SOD,MDA,heartrate,bloodpressureandoxygensaturation.ThentheauthormadeacorrelationanalysisonthedataofweeklyaverageconcentrationofPM2.5andtheindexofpulmonaryfunction,MDA,FeNO,SOD,heartrate,bloodpressureandoxygensaturation.Result:(1)Comparedwiththesuburbanelderlypatients,theserumMDAlevelhassignificantlyincreased(p<0.05)intheurbanelderlypatientswithasthma;whiletheheartrate,bloodpressure,oxygensaturation,pulmonaryfunction,IV FeNOlevels,andSODhasnosignificantdifference(p>0.05).(2)ComparingtheaverageconcentrationofPM2.5inurbanandsuburbanareasfromOctobertoDecemberin2013,theauthorfindsthattheaverageconcentrationofPM2.5in10.21-10.27,10.28-11.3and11.25-12.1inurbanareaswassignificantlyhigherthanthatofinsuburbanareas,whichhadastatisticsignificance(p<0.05).(3)ThecorrelationanalysisfindsthatthelevelofPM2.5waspositivelycorrelatedwiththeheartrate,systolicbloodpressure,diastolicbloodpressure(r=0.808,p<0.001;=0.662,p<0.001;r=0.696,p<0.001)andtheFeNOandMDA(r=0.499,p＜0.05;r=0.498,p＜0.05)ofthesubjects,whilewasnegativelywiththeoxygensaturation(r=-0.685.p<0.001),FEV1,FEV/FVC(r=-0.425,p＜0.05;r=-0.815,p<0.001)andtheSOD(r=-0.539,p＜0.05)ofthesubjects.Conclusion:(1)HighlevelofPM2.5couldinducelipidperoxidationwithintheelderlypatientswithasthma.(2)TheelevatinglevelofPM2.5exposurecouldcausehigherlevelofheartrate,bloodpressure,inflammationandoxidativestresswithintheelderlypatientswithasthma.(3)HighlevelofPM2.5exposurecouldweakenthebloodabilityofcarryingoxygenandthepulmonaryfunctionoftheelderlypatientswithasthma.V Keywords:PM2.5，bronchialasthma，airwayinflammation，oxidativestressVI 目录第1章绪论.................................................................................................11.1引言........................................................................................................11.2大气细颗粒物概述以及危害................................................................21.2.1大气颗粒物概述............................................................................21.2.2PM2.5对人类的危害....................................................................51.3中国PM2.5污染现状和特点..............................................................61.3.1中国PM2.5污染现状及变化趋势................................................61.3.2中国PM2.5污染特点....................................................................81.4研究区域概况以及疾病相关性分析...................................................91.4.1长春地区细颗粒物污染现状.........................................................91.4.2与疾病相关性分析........................................................................111.5PM2.5暴露与老年哮喘关系的研究进展..........................................161.5.1哮喘概述.....................................................................................161.5.2老年哮喘患者的特殊性.............................................................161.5.3PM2.5暴露与老年哮喘.............................................................171.6总结与展望.........................................................................................18第2章资料和方法.......................................................................................192.1主要仪器及试剂....................................................................................192.1.1主要仪器.........................................................................................192.1.2主要试剂.........................................................................................20VII 2.2研究对象.............................................................................................202.3资料收集和样本采集...........................................................................212.3.1资料收集.........................................................................................212.3.2样本采集.........................................................................................232.4临床检测和实验室检测.......................................................................242.4.1临床指标检测.................................................................................242.4.2实验室指标检测.............................................................................242.5数据处理与分析...................................................................................27第3章结果...................................................................................................283.1研究对象基本情况...............................................................................283.2大气PM2.5监测结果........................................................................283.3市区和市郊患者各项指标的差异.......................................................293.4大气PM2.5水平与老年哮喘患者各项指标的关系.........................34第4章讨论...................................................................................................41第5章结论...................................................................................................44参考文献...........................................................................................................45作者简介及在学期间所取得的科研成果.......................................................56致谢...........................................................................................................57VIII 英文缩略词英文缩写英文全称中文全称ACSAmericancancersociety美国癌症协会AQIairqualityindex空气质量指数COPDchronicobstructive慢性阻塞性肺疾病pulmonarydiseaseEPOEosinophilperoxidase嗜酸性粒细胞过氧化物FeNOexhalednitricoxide呼出气一氧化氮FEV1forcedexpiratoryvolumein一秒钟用力呼气量onesecondFVCforcedvitalcapacity用力肺活量IPinhalableparticles可吸入颗粒物MDAMalondialdehyde丙二醛PDGFplateletderived血小板生长因子growthfactorPM0.1ultrafineparticles超细颗粒物PM2.5fineparticlematter细颗粒物SODSuperoxideDismutase超氧化物歧化酶TGFtransforminggrowthfactors产生转化生长因子TSPTotalsuspendedparticulate总悬浮颗粒ECElementalcarbon元素碳OCOrganiccarbon有机碳PAHspolycyclicaromatic多环芳烃hydrocarbonIX PMFPositiveMatrix正定矩阵因子分析法FaetoranalysTNF-αTumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子CRPHypersensitivityC-超敏C-反应蛋白reactiveproteinMBPMajorbasicprotein主要碱性蛋白EPOPeroxidase过氧化物酶ECPEosinophilcationicprotein嗜酸细胞阳离子蛋白EDNEosinophilDerived嗜酸性粒细胞神经毒素NeurotoxinLTBLeukotriene-B白三烯BMMPMatrixmetalloproteinases基质金属蛋白PAFplateletactivatingfactor血小板活化因子TGF-αtransforminggrowth转化生长因子-αfactors--αTGF-βtransforminggrowth转化生长因子-βfactors--βDNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸SPSSStatisticPackageforSocial统计分析软件SciencePUFApolyunsaturatedfattyacid多不饱和脂肪酸X 第1章绪论1.1引言在空气动力学中，将等效直径小于或等于2.5μm的颗粒物称之为细颗粒物（fineparticlematter，PM2.5）。PM2.5可长时间悬浮于空气中，是造成大气灰霾的主要污染物质。大气PM2.5因其具有粒径小、比表面积大、空中停留时间长、传播距离远等特点，可含有或吸附重金属、有毒气体、多环芳烃、细菌病毒等多种有害物质，可进入支气管和肺泡并最终进入血液，严重的危害了人体的健康，这些病理性损害主要集中于呼吸系统和心血管系统当中。其中大气PM2.5吸附的亚硝胺类化合物、多环芳烃等对人体危害较大，具有一定的致病作用[1]。PM2.5来源复杂，在我国大致上可以分为自然界来源与人类日常行为活动来源。造成雾霾天气的PM2.5大部分来自于人类日常行为活动。如炭粒子燃烧后产物、生活厨房油烟、露天烧烤、废弃物燃烧等。研究报告显示，不同地区PM2.5主要成分组成差异性也较为明显。近几年，我国由PM2.5造成的雾霾事件，给人们的生活带来了巨大灾难，从而受到人们的普遍关注，也使我国对PM2.5的相关研究也更加深入。不同的大气颗粒物会对机体产生不同程度的损伤，PM2.5对人类健康的威胁主要针对于呼吸系统与循环系统。有报道显示，PM10.0以下可进入鼻腔，PM7.0以下可进入咽喉，而PM2.5则可进入机体气道内，随气道平滑肌运动，深达至肺泡并沉积，长时间沉着会通过肺泡直至肺间质细胞内，进入人体血液循环之中，对人体造成极为严重的伤害[2]。迄今为1 止，大气环境中有上百种颗粒物已被鉴定为具有危害人体健康的能力[3-8]。PM2.5之于呼吸系统疾病的危害而言，PM2.5长期暴露会致使肺功能下降，使人易患慢性支气管炎，慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病，更有甚者会直接威胁到生命；大气PM2.5短期暴露将诱发急性肺部疾病，如上下呼吸道感染、急性气管炎、支气管哮喘急性发作等。目前PM2.5与呼吸道炎症与氧化应激相关性的临床类文献，多集中于国内外儿童哮喘的研究[9-10]。加之，我国目前针对细颗粒物系统监测尚未完善，尚无雾霾或PM2.5导致人体相关疾病的流行病学调查。长春地区，属于PM2.5中重度污染地区，急待进行相关实验室分析以及流行病学调查，提供PM2.5对人群健康影响的基础数据。基于上述问题，我们以吉大一院呼吸内科门诊以及住院部收治的老年哮喘患者为主要研究对象，设计一项前瞻性随机临床研究，旨在进一步探讨环境PM2.5对老年呼吸系统慢性疾病患者发病的影响，进而为更好的评估老年哮喘患者的气道炎症和氧化应激反应，在PM2.5超标环境下，更好的为此类患者做到疾病的预防等提供一些新思路。1.2大气细颗粒物概述以及危害1.2.1大气颗粒物概述按照大气颗粒物的空气动力学等效直径，可将颗粒物划分为四类：（1）直径≤100μm的颗粒物归类为总悬浮微粒（totalsuspendedparticulate，TSP）；（2）直径≤10.0μm的颗粒物归类为PM10，又称可吸入颗粒物（inhalableparticles，IP）；（3）直径≤2.5μm的颗粒物归类为细颗粒物（PM2.5）；（4）直径≤2.5μm的颗粒物归类为超细颗粒物（ultrafineparticles，PM0.1）。TSP、PM10、PM2.5三者来源基本相同，具有一定的同源性和相2 似性。其中，一般的大气颗粒物污染中PM2.5约占PM10的60%～70%；在我国，PM2.5已成为各大城市大气的首要污染物[11]。北京地区PM2.5约占PM10的55%[12]；黄石城区PM2.5超标率为50.00%，高出TSP、PM10指标[13]；PM2.5在PM10中所占比例越大，造成的环境污染情况就会越重[14]；PM2.5相较于PM10，更具有环境杀伤性[15]。近几年，大气污染的问题日益严重，受到人们的广泛关注，PM2.5与雾霾天气的发生有着重要的联系，是雾霾发生的重要因素之一[16-19]。具体事件：2010年度美国驻华大使馆PM2.5监测数据爆表；北京、南京、东北绝大地区频现重度雾霾污染现象；京津冀、长江三角洲、珠江三角洲等工业较发达地区，雾霾出现频次、严重程度最为严重，上述地区年均出现雾霾污染天数可超过100d，更有个别城市如：北京、河北多地超过200d；2013年度我国平均29.9d达雾霾预警，成52年来最高污染强度[20]。许多学者对大气PM2.5污染物的化学组成及其来源做了大量研究发现：大气PM2.5污染物来源分布具有一定的地域性，与人民的行为习惯，当地的生活特点，经济发展情况等都有一定的关联。早期的流行病学研究表明，PM2.5化学组成复杂，基本可以分为三大类：无机元素，主要为无机金属元素；含碳及碳的化合物，包括元素碳（Elementalcarbon，EC）、有机碳（Organiccarbon，OC）、烃类、电解质包括：阳离子：Na+、K+、NH4+等，阴离子：Cl-、NO3-、SO42-等。LarsonT等[21]应用正定矩阵因子分析法（PositiveMatrixFaetoranalys，PMF）模型得出美国华盛顿PM2.5来源主要有：植物燃烧、移动排放源、二次硫酸盐、富含氯源、地壳物质等。ZhengM等[22]人通过有机溶剂萃取化合3 物示踪剂法分析出，美国东南部PM2.5来源，结果主要有：木柴燃烧物，柴油机排气，餐饮附属产物，汽车尾气，及少量天然气燃烧物，植物碎屑，道路扬尘等。XavierQuerol等[23]对西班牙巴塞罗纳的大气PM2.5污染进行了来源解析，结果表明75%大气PM2.5污染出自于人为活动。JongbaeHeo等[24]人应用PMF模型对洛杉矶盆地两个采样点的大气PM2.5样品进行来源解析得到5个不同种类的来源。我国PM2.5的来源大致来说可以分为2类，主要是自然来源和人为活动来源。自然来源如：大风扬尘，森林火灾、海盐漂浮物、花粉、细菌、真菌等。人为活动来源为：人类在生产、生活过程中产生的各类炭黑粒子、道路交通、建筑工地、生活厨房油烟、露天烧烤、废弃物燃烧等。不同地区PM2.5组成差异性较大，且与人们的生活工作习惯等密不可分。针对PM2.5污染的评价标准方面，国外相对国内较早，国外对PM2.5的研究多集中于2000年以后。2006年美国关于PM2.5浓度衡量标准提出了严格的上限要求。各国针对大气细颗粒物的危害制定了相应的空气质量控制标准。我国PM2.5研究的历史相对较短，起步相对较晚的特点，与欧美国家差距较大，但近几年，随着人们对空气环境质量认识的不断深入，国内对PM2.5的研究也日益增多。我国借鉴了国外许多优秀的经验，逐渐对PM2.5有了较为深刻的认识，对PM2.5的控制要求也逐渐严格，形成了世界范围内的监控标准。2012年，我国新颁布的《环境空气质量标准》（GB3095-2012），就PM2.5首次提出了浓度限制标准，并对大气PM2.5污染细化到具体的标准值，这类大气PM2.5污染标准值是我国下定大力4 气治理环境污染的决心，但相较国际标准而言，标准值仍相对较为宽松，仍有进步完善的空间。因此，伴随着大气PM2.5污染标准值的发布，我国许多城市都已开展了城市大气PM2.5质量浓度、污染特征、分布特征、健康危害等诸多方面的各项研究工作[25-27]。肖致美等[28]得出：宁波市大气PM2.5污染的来源为城市扬尘埃、煤烟灰尘、机动车尾气尘埃、二次硝酸盐、二次硫酸盐以及二次有机碳。郭琳等[29]人应用因子分析法得出：南昌市夏季大气PM2.5主要来源于多环芳烃（polycyclicaromatichydrocarbon，PAHs）；刘彦飞等[30]人指出哈尔滨大气PM2.5污染中人为因素以及工业化程度占有较高比例。1.2.2PM2.5对人类的危害PM2.5的主要危害有：PM2.5可吸收或反射太阳辐射，对可见光有吸收和散射作用，致使城市能见度降低等，加大城市交通安全隐患，此外，PM2.5还会参与局部水循环中，降低农作物产量[31]。此外，PM2.5会对人类的生活环境构成极大威胁。健康危害方面，PM2.5粒直径较小，可吸附具有不同理化性质的有害物质，经呼吸道进入支气管、肺泡等组织器官中，对人体的健康构成极大危害[32-35]。一些较早的国外相关报道如下：Linares等[36]3对西班牙马德里市的调查研究表明，大气中PM2.5每增加10μg/m，儿童患病率就会增加1.03%。一些由美国癌症协会提供的研究数据显示，PM2.5浓度升高会促使导致各类疾病的死亡率增加[37]。PopelII等[38]在排除了饮食、饮酒、吸烟、职业因素等因素后，对17年间，50万居住在大城5 市的成年人的详细资料得出，空气中的PM2.5每升高10μg/m3，肺心病死亡率增加6个百分点、全死因死亡率就会增加4个百分点、肺癌死亡率危险性增加8个百分点。钱孝琳等[39]对国内外1995～2003年公开发表的关于大气PM2.5污染与居民每日死亡关系的流行病学文献进行了Meta-分3析，结果表明大气PM2.5浓度每升高100μg/m，居民死亡率增加12.07个百分点。刘金一[40]分析了杭州市大气污染与健康效应时间序列的关系，得出：随着大气污染物SO2、NO2、PM10浓度的增加，当地居民呼吸系统疾病、循环系统疾病住院人数有相应加大，因大气污染物死亡的人数也有增多趋势。赵珂等[41]在西安大气PM2.5与城区居民死亡率的研究中指出，呼吸系统疾病和循环系统疾病等死亡率会随着大气PM2.5污染浓度的增加而升高。早期的动物实验表明，PM2.5会随血液进入大鼠免疫系统，对大鼠肝脏、肾脏产生一定程度的损伤。郭翔等[42]针对广州、东莞、深圳及肇庆地区PM2.5对大鼠肺泡巨噬细胞毒性作用的研究得出，随着染毒剂量的增加，大鼠巨噬细胞损伤程度加大。总之，大气PM2.5污染对机体的危害是不容小觑的。1.3中国PM2.5污染现状和特点1.3.1中国PM2.5污染现状及变化趋势我国处于社会主义初级阶段，长期以工业、农业等经济发展为主体的多种发展模式，环境本身污染、自净的动态平衡被人们打破，导致了污染物已大大超过了环境本身的自净能力，经年累月由自然因素以及人为因素等向环境排放的有害物质，成为破坏我国乃至地球环境的元凶首恶，现而6 今，环境对机体健康构成的危害也已成为了人们老生常谈的话题。了解中国环境PM2.5污染现状，首先由环境污染物入手，目前主要的污染物主要为：颗粒物、氧化剂、碳氧化物、氮氧化物、卤化物、硫化物、碳氢化合物、放射性物质等。自2016年度起我国实施的最新的《环境大气质量标准（GB3095-2012）》指出：环境大气中一些污染物质，如：臭氧、总悬浮颗粒物、PM10、PM2.5、一氧化碳、二氧化氮、二氧化硫、氮氧化物、铅和苯并芘等规定了浓度限值，这些规定还明确指出，环境大气中部分重金属（镉、汞、砷、六价铬和氟化物）参考浓度限值[43-44]。从全国大气污染总体变化趋势上来讲，中国大气PM2.5污染变化趋势与我国国民经济发展情况相关，即：我国大气PM2.5重点污染区域主要集中于经济持续高速增长的较发达地区，中国快速工业化进程，逐渐向城镇化过度、重污染常态化趋势等特点。导致中国大气PM2.5污染加剧，雾霾现象频发，更深层次的原因则是我国工业化快速进程，城镇化大幅推进所积累的环境问题。2013年，对74座城市的全国PM2.5实时监测显示，空气质量达标城市仅占4.1%。监测结果可以得出：京津冀地区、长江三角洲区域、珠江三角洲地带是大气污染相对较重区域，其中尤以京津冀区域污染最重[43,45,46]。大气PM2.5污染最为严重的十大城市，包含了中国中西部省份及发达地区，年均浓度几乎为国家标准的3倍甚至是3倍以上。2013年，西安、郑州、武汉、成都、乌鲁木齐、合肥、太原等城市污染情况稍有好转，但仍旧不能乐观，PM2.5年均浓度仍达到国家标准两倍以上。种种数据均表明，中国PM2.5污染现状及变化趋势相当严峻。7 1.3.2中国PM2.5污染特点当前，中国多地区处于复合型污染，这些重点区域重雾霾污染的演变特点分析表明，中国大气PM2.5污染特点可变现为：浓度超标趋于常态化；重污染频率增加次数明显，持续时间延长明显；污染具有区域性等特点。PM2.5浓度居高不下根本原因是大气污染物排放的持续增加是导致大气中的颗粒物。首先，大气中PM2.5浓度超标趋于常态化，即大气中PM2.5浓度基本处于超出国家现行的指标的范围，随着相对应地区的雾霾天气也呈常态变化，就我国现而今实施的对大气PM2.5长时间监测结果上来看，PM2.5持续浓度高结果以具有常态性。尤其是针对近一些年来，我国小范围内的固定城市和城市群区域，不断出现大气PM2.5重度污染（即大气PM2.5日3平均浓度＞150μg/m）天气。其次，我国大多数城市PM2.5污染还可呈现出：大气PM2.5重污染频率增加次数明显，持续时间延长明显等特点。相关报道如下：2013年1月京津冀共计发生5次重霾污染，其中有2次时间均超过6d，更有个别3城区监测点PM2.5瞬时浓度近1000μg/m。2014年2月，京津冀地带再次连续出现重污染以及严重污染，污染持续超过一周时间。这几次较大的环境污染过程，均创下了大气中PM2.5浓度最高，以及持续时间最长的历史记录，令人扼腕。同时，大气PM2.5污染往往都有区域特征，与PM2.5密切相关的雾霾天也存在着同样的区域性特点，尤其是京津冀地区、长江三角洲区域、珠江三角洲地带。2013年1月份，我国中东部地区就连续出现了灰霾天8 气，覆盖范围波及17个省、市、自治区、直辖市，影响人口约6亿余，涵盖约1/4的国土面积。2014年2月，我国中东部发生雾霾后污染面积约143万平方公里的土地，约占我国国土面积的1/7[47]。1.4研究区域概况以及疾病相关性分析1.4.1长春地区细颗粒物污染现状长春市为吉林省的省会城市，位于东北地区的中心，总面积20604平方公里，属于副省级城市，是我国十五座副省级城市之一；长春市与哈尔滨市、吉林市、四平市、松原市等城市相接壤，地处东经124°18’～127°05’；北纬43°05’～45°15’，地处北温带大陆性季风气候区，属于北半球中纬度北温带，四季分明，干湿相宜，降水自东向西递减，气温自东向西递增；同时，长春市有着我国最大的汽车制造集团——中国第一汽车集团，是我国最早的汽车工业城市，也是我国重要的工业基础城市之一；长春市人口众多，截至2008年5月，长春市所属的六大主城区、四大开发区的总人口数为487.6万（四环路以内），其中三环以内在籍人口数为368万，包括外来和流动人口总人口近千万。独特的地理位置、长足的经济发展、巨大的人口压力，都对长春市的自然环境造成的不小的压力。按照我国环境3监测部门规律大气PM2.5国家标准线：24h平均浓度75μg/m，年均浓3度35μg/m来对比计算，根据长春市环境监测中心站提供的监测数据显3示：2013年长春地区大气PM2.5浓度年平均值约为72.2μg/m。长春地区大气PM2.5年均浓度直接超出了国家指导的标准至近2倍多。王菊等[48]人研究指出长春市的PM2.5、PM10以及TSP污染之间9 具有同源性、相似性。PM2.5仍旧是城市的主要污染物。对长春市PM2.5月平均浓度变化趋势分析结果表明长春市10个监测点的月均值走势一致，季节性明显。具体为：冬季（主要包含供暖季），1月、10月、11月、12月大气PM2.5浓度值要远远大于其他月份，这其中，1月份大气PM2.53浓度月平均值最高，高峰时大气PM2.5浓度可持续达到200μg/m以上；夏季相对偏低，6～9月为大气PM2.5浓度值较低时节，7月份达到最低。这种季节性差异可能与冬季北方城市供暖季燃煤量大大增加，排放到大气污染物中，PM2.5的排放量也随之增加，同时由于纬度关系，长春地区冬季易出现逆温天气，风力较小，不利于污染物的扩散等。仅在2013年度长春市10个大气自动采样监测站的PM2.5年平均浓度污染程度进行排序，结果由高到低依次为劳动公园、客车厂、食品厂、经开环卫处、高新管委会、岱山公园、邮电学院、儿童公园、甩湾子、净月公园。净月公3园的大气PM2.5年均浓度最低，为56.8μg/m，其次为甩湾子，大气PM2.53年均浓度为64.8μg/m，而劳动公园浓度最高，大气PM2.5年均浓度为379.9μg/m，其他采样监测处年均浓度差异较小。总体来看，10个采样监测3处的年均浓度均处于较高水平，均超过了国家制定的35μg/m的标准线。长春市内9个采样点的监测记录结果显示，净月公园监测处全年PM2.5浓度总超标85d，其余8个采样监测处全年超标的天数达100d以上。其中，经开环卫处达到144天，约占全年的40%。2013年间长春市内10个采样监测处大气PM2.5变化规律为：1月、10月和12月超标天数较高，具体记录数据：1月份超标天数最多，净月公园采样监测处超标为22天，其余所有采样监测处PM2.5超标天数达到甚至是超过2510 天；12月份超标天数基本在20天以上，污染情况严重。而6～9月的污染情况较轻，其中9月份各采样监测处超标天数均在5天以下，7月和9月部分采样监测处超标天数甚至达到0天。长春市PM2.5年均值超过国家标准近2倍，9个采样监测处（除净月公园外），其他８个采样监测处的日均值超标天数均超过100d，且呈现出明显的季节性变化，冬季污染情况最为严重，个别月份超标天数达25天以上，而夏季污染较轻。总体来看，长春地区大气PM2.5污染情况不容乐观，部分地区PM2.5浓度较高，污染情况较为严重[49]。1.4.2与疾病相关性分析研究证实，PM2.5暴露可导致心肺疾病的发生与死亡率的增加，90年代末相类似的报道指出：PM2.5粒径较小，传播距离较远，可吸附更多的机会致病菌、机物与、重金属，易累及呼吸系统、心血管系统致病。对于PM2.5与疾病的相关性研究，我国明显滞后与国外发达国家，近年来，我国一些学者逐渐开始进行大气颗粒物与疾病相关性的分析研究。但是，目前研究的研究成果仍然相对较少。经口吸入的PM2.5可于人体内沉着，长期对人体蛋白质和脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid，DNA）等产生危害，导致呼吸系统、循环系统、免疫系统、神经系统、内分泌系统等[50-55][56-60]疾病。在我国PM2.5对人体最大的危害主要针对呼吸系统方面和心血管系统方面[61-64]。1.4.2.1PM2.5与循环系统疾病循环系统疾病均为慢性的、进行性疾病，伴随整个生命周期。世界范11 围内，循环系统疾病是最常见的疾病与死亡元凶之一。心血管疾病的发病因素与环境、基因等因素交互作用[65]。空气污染可损害人类健康，尤其是对易感人群健康的损害尤为严重。近年来，大量的流行病学调查及毒理学实验研究得出：颗粒物与心血管疾病的发病率、住院率和死亡率存在着一定的关联，并受到世界范围内的关注。目前已有的研究结论为：短期提高环境颗粒物浓度水平可引起心律不齐、恶化心力衰竭，引发急性动脉粥样硬化/缺血性心血管并发症等加重急性心血管系统疾病的发生。全球范围内的一项关于颗粒物暴露所致急性健康问题流行病学的研究指出：日均颗粒物浓度与心血管发病率、门诊就医率、患者死亡率及心血管功能损伤程度等情况均存在直接或者间接的影响[66]3。例如，有项研究表明：24小时内PM10每增加10μg/m，心血管的死亡率在短期内增加0.31%[67]。大气细颗粒物与柴油尾气可降低心律变异性、削弱机体内皮功能[66]。此外，颗粒物暴露还与动脉粥样硬化、心肌缺血、微血管血栓形成都存在一定的相关性。PM2.5通过呼吸道进入体后，随血液进入心脏内，心脏、胸主动脉及全身毒性中与自主神经系统系统会产生一系列氧化应激反应，致使组织血管内皮功能紊乱等。整个过程伴随着肺部炎症反复刺激肺脏内迷走神经，使得自主神经功能紊乱，造成心脏受累；作为炎症的副产物，炎症介质会随颗粒物一起作用于心脏产生直接作用；PM2.5混入血液中，至血液粘稠度上升，流动速度减缓，造成脂质、脱落细胞沉积与心血管内膜上，使血管变窄，形成血栓，很大程度上诱发心血管系统疾病。毒理学研究在分子层面上表明，颗粒物对系统炎症和血栓的形成具有一定影响，形成如凝12 血因子、细胞因子、肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α），超敏C-反应蛋白（CRP）等生物标志物，此类因子可参与动脉粥样硬化的病理生理过程。在对血管体外暴露柴油尾气的研究表明，体外暴露柴油尾气可诱使机体生成超氧自由基，抑制NO调节血管舒张的功能。目前研究已提示，炎症与血脂水平可共同诱发、加速动脉的硬化过程。同时，PM2.5急性暴露诱发的炎症反应致动脉粥样硬化，硬化斑块较为脆弱，易破裂，可生成血栓并发症；反之，血液易于凝固再次形成血栓，加重急性心脑血管发生机率。颗粒物对循环系统的损伤可能存在以下几种途径：肺和(或)全身性炎症反应、血液高凝固性、心脏自主功能下降及动脉粥样硬化的加速进展等[68]。动脉壁轻度慢性炎症可形成血栓和动脉粥样硬化症[69]。PM2.5沉积在气道诱发全身性炎症反应和（或）来自肺部受体直接反射可能会影响自主神经对心血管系统的调控。心肌缺血和（或）发生了改变的心肌细胞离子通道均可能参与诱发心脏损伤[70]。多数研究显示PM2.5可诱发全身性炎症反应、心律失常、血液高凝固性、心血管损伤等。大气PM2.5暴露致心血管损伤还与肺部或（以及）全身性的炎症反应、氧化应激反应，加速心血管动脉粥样硬化进展。我国各地区关于雾霾天气污染下的PM2.5与循环系统疾病研究成果主要有：董凤鸣等[71]研究北京海淀区PM2.5浓度升高，在一定程度上增加了因循环系统疾病死亡的患者人数，医院心血管系统类疾病患者会随着大气PM2.5污染增加而增多；刘芳盈等[72]对燃煤PM2.5可造成血管内皮细胞毒性等报道十分明确的阐述了PM2.5直接与循环系统有关。13 1.4.2.2PM2.5与呼吸系统疾病与循环系统相比，PM2.5作用于呼吸系统更直接，损伤程度更大，尤其是短时间高浓度PM2.5暴露情况下。众多研究都表明，PM2.5对人肺上皮细胞具有一定的毒性作用。丁晓洁[73]的实验表明：PM2.5可以显著影响人支气管上皮细胞中DNA甲基化，造成人支气管上皮细胞差异性表达。其他学者研究还发现，大气PM2.5长期暴露会对人类肺组织上皮细胞活性具有一定的抑制作用，并对人支气管上皮细胞发生一定程度的损伤[74-75]。贾玉巧等[76]人通过实验证实：PM2.5对人肺纤维细胞毒性以及存活率的影响。PM2.5造成的雾霾天气对临床患者的流行病学调查数据显示：在对哈尔滨市PM2.5污染水平对人群呼吸系统疾病影响的研究中发现：PM2.5日均浓度的增大会导致哈尔滨市第二医院呼吸内科门诊就诊率的增加[77]。PM2.5可直接引起呼吸道损伤，造成各类呼吸系统疾病。主要致病机制可分为：炎症损伤；氧化应激损伤；致癌毒性等方面。具体为：PM2.5刺激肺泡巨噬细胞、II型肺泡上皮细胞，进而引起气道局部免疫力水平降低，肺上皮细胞纤维化等。致癌毒性可表现在：大气PM2.5毒性作用均可损害机体DNA、染色体等不同水平遗传物质，并且大气PM2.5浓度升高能导致DNA损伤程度增加。近年来肺癌频繁，与PM2.5超标有着直接的因果关系。PM2.5经过气道进入免疫系统后，减少抑癌基因表达，导致基因突变、基因丢失，增加肺癌易感人群。同时，PM2.5可作为载体，携带有害物质进入人体下呼吸道，迫使机体呼吸道上皮细胞、巨噬细胞内的细胞因子（如生长因子）增多，长期反复，会进一步引起细胞周期调节紊乱，不规则分裂增加，致呼吸道组织癌变。大气PM2.5也可机体诱发14 产生活性氧，损伤遗传基因，进而促使支气管上皮细胞突变[78-79,86]。数据显示，当前肺癌发病率已高居各类癌症首位，过去10年间肺癌发病率上升了近27%，同时，我国城市的肺癌发病率明显高于农村[80]。来自北京市公布的信息也表明，近10年间，北京地区肺癌患者约增加了56%，这其中，男性肺癌发病率为77.94/10万，女性为64.63/10万[81]。PM2.5会造成呼吸疾病患者就诊率以及住院率上升，雾霾天气期患者可出现呼吸系统症状，还可以造成慢性呼吸系统疾病的急性发作期，PM2.5浓度升高与呼吸系统疾病患者就诊和住院率成正相关。可使患者出现眼和喉部刺激，诱发鼻塞流涕、急性上呼吸道感染、支气管炎、咳嗽，有的甚至出现呼吸困难、皮疹等，且老年人和儿童患病率明显增加。2009年度，上海市6所大中型医院的流行病学调查数据显示，雾霾天气PM2.53日均浓度每增加34μg/m，呼吸科均门诊人数增加3.2％，儿科日均门诊人数上升1.9％，PM2.5对门诊人数影响的滞后累积效应强于当日效应，在雾霾暴发第6天时门诊人数累积效应达到最大化[82]。PM2.5暴露会增加呼吸疾病患者病死率。西安市大气PM2.5污染与城区居民病死率的研究报告显示，PM2.5与多种呼吸系统，以及呼吸重症病死率呈正相关[6,40]；无独有偶，陈仁杰[5]分析了全国范围内大气污染指3标和居民病死率的数据后发现，当大气PM2.5浓度上升10μg/m时，人群总死亡数上升0.40%；同时，王园园等[83]分析了上海大气污染指标和居民病死率的数据后发现，当大气PM2.5浓度上升10ug/m3时，人群总死亡数上升0.85％；于此相对应的报道，AndrewW.Correia[84]等在对美国特定区域的调查研究得出，PM2.5浓度每降低10μg/m3为患有呼吸系统疾15 病患者的寿命就会随着增加0.35岁（SD=0.16岁，P=0.033）；综上，大气PM2.5暴露会对呼吸疾病患者的病死率造成一定影响。1.5PM2.5暴露与老年哮喘关系的研究进展1.5.1哮喘概述支气管哮喘（bronchialasthma），简称哮喘，属于慢性呼吸系统疾病。哮喘是一种由多种细胞（如：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、平滑肌细胞、支气管上皮细胞等）、细胞因子（如：IL-5因子、IL-3因子、前炎症细胞因子、主要碱性蛋白(Majorbasicprotein，MBP)、过氧化物酶(Peroxidase，EPO)、嗜酸细胞阳离子蛋白(Eosinophilcationicprotein，ECP)、嗜酸性粒细胞神经毒素（EDN）、白三烯B(Leukotriene，LTB)、基质金属蛋白（Matrixmetalloproteinases，MMP）、血小板活化因子(plateletactivatingfactor，PAF)等共同参与的呼吸系统气道慢性炎症性疾病。这种呼吸系统慢性炎症与患者气道高反应有关，气道高敏性可引起患者反复发作的喘息、咳嗽、气急、胸闷等，在夜间和（或）清晨发作时，人体呼吸中枢系统受到抑制，可出现气道痉挛等情况。这些症状通常与肺内广泛多变的可逆性气流受限有关，常可自行缓解或经治疗后缓解。哮喘发病的本质是气道慢性炎症,这种慢性炎症可导致气道反应性增高，从而引起相应的临床症状[85]。1.5.2老年哮喘患者的特殊性老年哮喘患者是年龄在65岁以上的一类特殊群体，近些年来，随着全球气候改变等原因，导致目前老年人哮喘罹患率占哮喘总发病率的16 6~10％之间，呈现逐年上升之趋势。老年哮喘除了包含有支气管哮喘的一般症状，比如：咳嗽、胸闷、气短、反复喘息等外，患者还可伴有支气管平滑肌收缩能力下降，劳力性呼吸困难，同时患者就诊是还可合并如：慢性阻塞性肺疾病（COPD）、心功能减退、肝肾功能降低等其他不同程度的并发症[86]。与普通支气管哮喘相比，老年哮喘患者气道对于PM2.5具有高度敏感性，PM2.5会导致哮喘患者病情急性加重，基于预防医学保护敏感人群不受伤害的原则，以研究哮喘患者患者更有现实意义。1.5.3PM2.5暴露与老年哮喘流行病学研究显示：大气中PM2.5对数浓度(lnPM2.5)每增加1个单位，可引发COPD急性加重期发生率增加1.68倍，呼吸系统疾病症状出现的危险性增加1.79倍[10]。PM2.5环境下老年哮喘气道炎症与氧化应激可表现为：（1）炎症损伤过程：PM2.5粒径小，在大气当中滞留时间长，传播距离远，可造成大范围的空气污染。PM2.5进入气道后，各类有毒细颗粒物会引起肺组织释放炎性因子，激活生理反应，诱发各类炎症。PM2.5可以加速机体分泌血小板生长因子(plateletderivedgrowthfactor，PDGF)，以及增加产生转化生长因子-α、β(transforminggrowthfactors--α、β，TGF-α、β)，间接促进上皮和间质增生，引起气道壁纤维组织增厚，导致增生性炎症发生[87]。（2）氧化损伤过程：由肺部巨噬细胞产生的氧自由基经PM2.5刺激，导致氧化系统与抗氧化系统动态反应失衡，造成细胞组织损伤，可导致基因损伤，基因突变；另外，PM2.5还可以诱导一系列脂质17 氧化性损伤，增加细胞膜破损，减少膜上受体活性，促使血清抗蛋白酶活性降低或消失，细胞膜通透性增加，加速老年哮喘患者气道以及肺部的病[88]。理性损伤1.6总结与展望寻找到治理雾霾的切入点，如何更有效的防治呼吸系统疾病,已成为我国乃至全世界范围内不断探索的新热点。在长春这个工业重度污染的地区，老年哮喘作为慢性呼吸系统常见病、多发病，受大气PM2.5污染作用十分显著。虽然对环境问题老生常谈，但仍有以下问题亟待解决：①患者受环境因素制约；②实验所受干扰因素较多；③操作方法仍旧缺乏统一的标准规范，实验结果容易受诸多因素的影响（渗透压、离心速度、过滤方法等），各实验室的检测结果可比性差；④部分受试者受试结果差或者实验过程中难受情况较差；⑤对重度患者有一定的风险。但随着分子生物学和免疫学等方面的研究逐渐增多，相信气道标志物会逐渐趋于成熟，其在支气管哮喘等呼吸系统疾病中将有更意义。18 第2章资料和方法2.1主要仪器及试剂2.1.1主要仪器实验所需主要仪器，生产厂家，如表2.1表2.1仪器，生产厂家仪器名称生产厂家酶标仪Thermo，美国肺功能检测仪捷斯特，日本高速台式离心机Eppendorf，德国恒温水浴箱贺德实验设备有限公司，中国上海20μL，200μL，1000μL移液器Gilson，法国高压灭菌锅SANYO，日本烘箱恒丰医疗器械有限公司，中国黄石-80℃冰箱SANYO，日本低温保险柜星星，中国浙江制冰仪Scotsman，美国旋涡混合器北京同正生物技术发展公司微量移液器吸头Labcon，美国离心管Eppendorf，德国96孔微孔板建成生物工程研究所，中国南京漩涡混匀器将来实验设备，中国上海19 2.1.2主要试剂实验所需主要试剂名称、生产厂家，如表2.2表2.2试剂名称、生产厂家试剂名称生产厂家血清超氧化物歧化酶（SOD）含量检测试剂盒南京建成血清丙二醛（MAD）含量检测试剂盒南京建成2.2研究对象2013年8~9月间，在吉林大学第一医院呼吸科门诊以及住院部收治的符合老年哮喘诊断的患者（即＞65周岁的患者）中，招募处于支气管哮喘稳定期的患者，按照其居住地不同，分为：城区组65例，郊区组65例。对各受试者进行下列指标检测，如：肺功能测定、呼出气NO含量测定、血清超氧化物歧化酶（SOD）、血清丙二醛（MDA）含量。所有入组受试者进行为期13周的检测，检测于10~12月每周日上午，我院呼吸科门诊进行。各组受试者经我院伦理委员会批准，符合伦理要求，受试者均知情。支气管哮喘患者的入组标准为：①临床症状、检体和实验室检查均符合哮喘诊断标准（稳定期）；②为中国汉族老年人,年龄＞65周岁；③受试个体之间无血缘关系。排除标准为：①同时合并有除呼吸系统疾病以外的其他疾病诊断者；②怀疑或已经诊断为活动性肺结核、肺脓肿等呼吸系统疾病者；③近4周内患有呼吸道感染者，如咽炎、支气管炎、肺炎等；④存在尚未纠正的胸廓脊柱畸形的病人。入组支气管哮喘患者的剔除标准为：①无法随访；②目前吸烟或戒烟20 小于12个月；③避免罹患有：心脑血管系统、血液系统、神经系统、内分泌代谢、血液系统等急慢性疾病；④患肺癌或其他实体器官恶性肿瘤；⑤实验期间出现支气管哮喘急性发作期的受试者。剔除实验期间出现上述情况的受试者，即城区组剔除18例，郊区组剔除14例，最终统计符合实验要求的受试者为：城区组47例，郊区组51例。2.3资料收集和样本采集2.3.1资料收集（1）关于流行病学资料收集：对所有研究对象采用统一的调查问卷，由经过严格培训的调查员直接询问符合要求的病例（患者或其直系亲属）获得流行病资料。患者所达问题均需一致性达到满意程度，Kappa>0.75。流行病学资料包括：①一般人口学资料：姓名、性别、年龄、居住地等；②病史资料：包含现病史、既往病史、遗传史、传染病接触史、用药及治疗等；③行为方式资料：主动吸烟、被动吸烟、家庭燃料使用情况等。（2）关于PM2.5资料收集：根据长春市环境保护局公示数据，以及吉林大学环境与资源学院提供的2013年10月～2013年12月长春市各监测点的PM2.5周平均浓度。长春市共有10个PM2.5监测点，其中，城区组监测点包括：园林处、劳动公园、客车厂、邮电学院、食品厂；市郊组包括：经开区环卫处、岱山公园、高新区管委会、甩湾子、净月潭等，监测地点分布图，见图2.1。21 图2.1长春市大气PM2.5监测地点分布图根据各监测点实时数据，长春市2013年10~12月间共出现的7次重度雾霾情况，见表2.3。22 表2.32013年10~12月长春出现重度雾霾情况3空气质量指数（AQI）PM2.5（μg/m）日期总体值城区市郊总体值城区市郊2013-10-21（一237.39253.35221.43186.20194.72177.68）2013-10-22（二295.83301.11290.55487.93499.71476.15）2013-11-03（日229.55256.27202.83218.47230.72206.22）2013-11-24（日287.01300.09273.93177.49190.17164.81）2013-12-17（二243.75266.92220.58183.75189.66177.84）2013-12-21（六191.37198.52184.22149.20164.72133.68）2013-12-23（日208.87220.45197.29160.37182.35138.39）2.3.2样本采集经知情同意后，于2013年10月起，分别在每周日上午与我院呼吸科门诊行样品采集工作，采集所有研究对象清晨的非抗凝的静脉血，用于分离血清，即：抽取受试者的空腹静脉血5ml，凝固后离心取血清，并将样23 本置于-80℃冰箱保存。患者采样后统一测定。2.4临床检测和实验室检测各组受试者于2013年10月～2013年12月每周周日上午到吉大一院呼吸科，进行下述临床和实验室指标检测，受试期为13周。2.4.1临床指标检测采用肺功能仪直接测定：（1）测量实验对象的心率、血压和血氧饱和度，并详细询问该周内其各自的呼吸系统症状变化和药物使用情况；（2）肺功能测定；（3）呼出NO气含量测定。2.4.2实验室指标检测（1）血清超氧化物歧化酶：采用黄嘌呤氧化酶法（也称羟胺法，即WST-1法）检测SOD[89]。具体操作步骤如下：将受试者编号后，抽取空腹静脉血5ml，置于非抗凝管凝固管后，采用高速台式离心机，1500r/min离心5min，取上层血清置于EP管内并标记，于-80℃冰箱保存。患者采样后统一测定。按照SOD试剂盒上说明，试剂配制保存如表2.4；SOD检测方法及步骤如表2.5.表2.4SOD测定各试剂配制及保存试剂名称组份规格：96T规格：48T保存试剂一缓冲液15ml×2瓶15ml×2瓶2~8℃保存6个月24 试剂二底物贮备液0.15ml×1支0.07ml×1支2~86℃保存个月试剂三酶贮备液0.3ml×1支0.15ml×1支2~8℃保存6个月试剂四酶稀释液4ml×1瓶2ml×1瓶2~8℃保存6个月注：底物应用液的配制：底物贮备液：缓冲液按1:200的比例混匀配成底物应用液，随用随配，剩余少量试剂可2~8℃保存7天；酶工作液的配制：底物贮备液：缓冲液按1:10的比例混匀配成酶工作液，随用随配，剩余少量试剂可2~8℃保存3天。表2.5SOD检测方法及步骤加样（单位对照孔空白对照孔测定孔测定空白孔：）μl待测样本——2020双蒸水2020——酶工作液20—20—酶稀释液—20—20底物应用液200200200200注：对照、对照空白、测定空白均需混匀，37℃孵育20min，450nm处酶标仪读数。（2）血清丙二醛含量检测：采用硫代巴比妥酸法（即TBA法）检测25 MDA[89]。具体操作步骤如下：将受试者编号后，抽取空腹静脉血5ml，置于非抗凝管凝固管后，采用高速台式离心机，1500r/min离心5min，取上层血清置于EP管内并标记，于-80℃冰箱保存。患者采样后统一测定。按照MDA试剂盒上说明，对MDA检测方法及步骤具体表述，如表2.6表2.6MDA检测方法及步骤样品（单位：空白管标准管测定管对照管ml）10nmol/L标—0.1ml——准品无水乙醇0.1ml———测试样品——0.1ml0.1ml试剂一0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml试剂二3333试剂三111—50%冰醋酸———1注：以上各试验管加入试剂一后，混匀，再行加入试剂二、试剂三50%冰醋酸等操作；将上述个试管使用漩涡混匀器混匀，后分批一次测定，将各需检测的试管口用保鲜薄膜扎紧，并用针头刺一小孔，95℃水浴加热40min，取出后流水冷却，然后4000r/min，离心10min，取上清液，在OD值为532nm26 处，调整光径为1cm，双蒸水调零，测各管吸光光度值。2.5数据处理与分析将流行病学资料和实验结果数字化后录入Excel数据库，采用2SPSS17.0统计软件包进行数据处理与统计分析。计数资料采用χ检验；计量正态分布资料采用t检验；计量非正态分布资料采用秩和检验。两组正态分布资料相关分析采用线性相关分析；非正态分布资料采用秩相关分析。检验水准设为α＝0.05。27 第3章结果3.1研究对象基本情况老年哮喘患者包含47例长春城区人口和51例长春郊区人口。按居住地将哮喘患者分为城区组和郊区组，分别对两组人群的性别和年龄进行统计学分析，结果显示性别和年龄差异在两组人群中均无统计学意义（P＞0.05），见表3.1。这表明两组人群具有可比性。表3.1城区和郊区患者基本情况比较2变量城区患者（n=47）郊区患者（n=51）χ/tP性别（男，n[%]）25（）4723（）510.1600.689年龄（岁）68.180±4.3569.720±5.030.1730.8633.2大气PM2.5监测结果根据收集到的大气PM2.5资料，长春市2013年10～12月共出现7次重度雾霾天气；对2013年10～12月间长春市城区和市郊的PM2.5平均浓度进行比较，结果显示10.21-10.27、10.28-11.3和11.25-12.1期间长春市城区PM2.5周平均浓度显著高于郊区，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图3.1。28 图中，*为P＜0.05，与城区组相比。图3.12013年10~12月长春市大气PM2.5污染情况3.3市区和市郊患者各项指标的差异分别对市区和市郊哮喘患者的各项指标进行比较分析，结果显示与市郊患者相比，市区患者血清MDA水平显著高于市郊患者（P＜0.05）；心率、血压、血氧饱和度、肺功能、FeNO和SOD水平在两组人群间并无显著差异（P＞0.05），见表3.2、图3.2～3.10。29 表3.2市区和市郊患者各项指标比较（）指标市区组市郊组tP心率（次分）/94.73±14.8791.71±13.810.5350.597收缩压（mmHg0.5760.570139.23±11.44136.86±9.46）舒张压（mmHg0.1010.92085.37±4.7385.18±4.64）血氧饱和度（%0.4010.69294.21±4.2093.64±2.90）FEV1（）L62.48±0.1162.63±0.34-0.7540.458FEV1/FVC（%-0.0580.95455.97±8.0356.15±7.53）FeNO（）ppb39.08±15.0434.20±11.500.9290.362SOD（U/ml)23.33±10.3122.19±7.710.3180.753MDA（nm/ml)6.22±1.605.03±1.302.0800.048**：P＜0.05，市区组与市郊组比较30 图3.2城区组与市郊组间心率比较图3.3城区组与市郊组间收缩压比较图3.4城区组与市郊组间舒张压比较31 图3.5城区组与市郊组间血氧饱和度比较图3.6城区组与市郊组间FEV1比较32 图3.7城区组与市郊组间FEV1/FVC比较图3.8城区组与市郊组间FeNO比较图3.9城区组与市郊组间SOD比较33 图3.10城区组与市郊组间MDA比较3.4大气PM2.5水平与老年哮喘患者各项指标的关系对长春市大气PM2.5水平和老年哮喘患者心率、血压、血氧饱和度进行相关分析，结果显示大气PM2.5水平与患者的心率、收缩压、舒张压呈正相关，与血氧饱和度呈负相关（P＜0.05），见表3.3，图3.11～3.14。表3.3大气PM2.5水平与患者心率、血压和血氧饱和度的关系指标rP心率（次分）/0.808＜0.001收缩压（mmHg）0.662＜0.001舒张压（mmHg）0.696＜0.001血氧饱和度（）%-0.685＜0.00134 图3.11大气PM2.5与患者心率的关系图3.12大气PM2.5与患者收缩压的关系35 图3.13大气PM2.5与患者舒张压的关系图3.14大气PM2.5与患者血氧饱和度的关系36 对长春市大气PM2.5水平和老年哮喘患者肺功能进行相关分析，结果显示大气PM2.5水平与患者的肺功能呈负相关（P＜0.05），见表3.4，图3.15～3.16。表3.4大气PM2.5水平与患者肺功能的关系指标rPFEV1（）L-0.4250.031FEV1/FVC（）%-0.815＜0.00137 图3.15大气PM2.5与患者FEV1的关系图3.16大气PM2.5与患者FEV1/FVC的关系38 对长春市大气PM2.5水平和老年哮喘患者气道炎症和氧化应激指标进行相关分析，结果显示大气PM2.5水平与患者的FeNO、MDA均呈正相关，与SOD成负相关性（P＜0.05），见表3.5，图3.17～3.19。表3.5大气PM2.5水平与患者炎症和氧化应激指标的关系指标rPFeNO（）ppb0.4990.010SOD（U/ml)-0.5390.004MDA（nm/ml)0.4980.036图3.17大气PM2.5与患者FeNO的关系39 图3.18大气PM2.5与患者SOD的关系图3.19大气PM2.5与患者MDA的关系40 第4章讨论（1）报道称长春市2013年10～12月间共出现7次重度雾霾天气，根据收集到的大气PM2.5资料，对2013年10～12月间长春市城区和市郊的PM2.5平均浓度进行比较，结果显示10.21-10.27、10.28-11.3和11.25-12.1期间长春市城区PM2.5周平均浓度显著高于郊区，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这项结果可能与长春地区地理及人文因素有关。长春市人口众多，地处高纬度地区，气候严寒，供暖期时，人们的日常行为中能够生成PM2.5的物质，如：煤、石油、秸秆等燃烧作为能源取暖，加重了环境的污染；同时，长春也是我国东北部地区重要的老工业基地，工业占经济比重较大，人们过度依赖传统能源，也是造成大气PM2.5污染，PM2.5爆表的重要方面。（2）在性别、年龄等因素的差异无统计学意义的因素后，分别对市区和市郊老年哮喘患者的各项指标进行比较分析，结果显示与郊区患者相比：心率、血压、血氧饱和度、肺功能、FeNO和SOD水平在两组人群间并无显著差异，不具有统计学意义（P＞0.05）；城区老年哮喘患者MDA测定值水平显著高于市郊患者（P＜0.05）。造成这类现象可能是PM2.5短期暴露后诱发老年哮喘患者体内膜脂的过氧化。具体指标选择及分析原因分析如下：在评定老年哮喘患者病情进展程度的各项指标中，肺功能测定被认作为临床通用的检查手段，FEV1、FEV1/FVC(%)等则是诊断支气管哮喘的标准[90]；呼出NO气含量测定是将哮喘患者气道炎症因子如：上皮细胞、巨噬细胞等产生的生物标志物--NO作为监测对象，对其气道炎41 症水平进行评价[91]；长期临床经验得出：哮喘患者疾病程度与肺功能呈负相关，与FeNO值呈正相关；同时，关于实验室检测指标的分析：MDA、SOD含量变化的主要原理是：机体可经由酶促反应系统、非酶促反应系统产生氧自由基，其中非酶促反应系统可攻击机体生物膜中的多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid，PUFA），导致机体内脂质过氧化作用发生，后形成脂质过氧化物，进而通过链式或链式支链反应，放大了机体内活性氧的作用，引起细胞局部代谢功能障碍甚至是死亡。血清中SOD与MDA是反应人体氧化反应的指标，即：SOD活力可间接反映机体消除氧自由基的能力，MDA可间接反应机体细胞受自由基攻击的严重程度，正常人血清含有足量的SOD，当不受外界因素刺激是，SOD无明显抑制变化，且MDA水平较低[92]。综上所述，老年哮喘患者处于慢性缓解期时，心率、血压、血氧饱和度、肺功能、FeNO水平和SOD含量相对较稳定，但MDA短期含量变化较为明显，为患者体内氧化表现[68,89]。综上所述，本研究显示，PM2.5暴露能够诱发老年哮喘患者体内膜脂的过氧化，而其余气道炎症指标有待进一步验证。（3）在对比长春市大气PM2.5水平和患者心率、血压、血氧饱和度、炎症和氧化应激指标等进行相关分析，结果显示大气PM2.5水平与患者的心率和血压呈正相关，与血氧饱和度呈负相关，与患者的肺功能呈负相关，与患者的FeNO呈正相关，SOD可呈现负相关性，差异具有统计学意义（P＜0.05），与MDA呈正比关系，但结果较不明显。这些研究结果表明：大气PM2.5暴露水平的升高，会造成罹患呼吸系统疾病的患者，其心率、血压、炎症水平和氧化应激水平的显著升高；同时，会造成患者的血氧饱42 和度、肺功能显著降低，可在一定程度上增加住院机会等，这也印证了,AmberH等人[93]报道证实，大气PM2.5污染可导致儿童呼吸系统炎症加重，炎症因子分泌量增加，从而导致哮喘大量急性期发作的一个重要诱因。针对我国长春地区雾霾环境下，呼吸系统疾病的小样本调查，我们可以更加明确，PM2.5严重超标等环境因素的作用会造成患者肺功能下降，气道炎症增加，氧化应激反应增强(如：SOD含量减少，MDA含量增加)等，对患者的健康构成一定程度的威胁。但是MDA作为有即时效应的指标，对于罹患老年哮喘的患者而言，短期变化明显，长期测定则较其他指标相对不灵敏，需要进一步的实验验证。目前临床上主要以肺常规通气功能指标(主要是FEV1,FEV1%预计值)、呼出一氧化氮气(FeNO值)等作为诊断及评价患者病情严重程度的指标，可在一定程度上，客观反应患者对各类药物治疗，如：激素联合β2-受体激动剂治疗反应性、治疗方案调整、患者自我管理等情况[68]。43 第5章结论（1）与市郊患者相比，市区患者暴露于更高的PM2.5水平，且市区患者血清中的MDA水平高于市郊患者。提示高水平PM2.5暴露能够诱发老年哮喘患者体内膜脂的过氧化。（2）大气PM2.5暴露水平升高，可导致患者的心率、血压、炎症水平和氧化应激水平升高。（3）高水平PM2.5暴露会导致患者血液携带氧的能力和肺功能降低。44 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作者简介及在学期间所取得的科研成果杨颖，女，1986年12月出生于山西省大同市，于2012年考入吉林大学白求恩第一医学院，其间2012年9月-2013年1月为专业课学习阶段，2013年1月-2014年3月在吉林大学第一医院呼吸科进行临床学习实践，2013年3月-2015年3月在实验室从事本专业相关课题基础研究。在学期间所取得的科研成果：杨颖，华树成，白晓雪，等.特发性肺纤维化治疗的研究进展[J].中国老年学杂志.2015，35（9）：2559-2561.杨颖，华树成，李丹，等。大气细颗粒物污染与呼吸系统疾病患者气道炎症和氧化应激关系初研究.被中国实用内科学杂志接收，拟2015年10月发表.以第一作者发表《白三烯受体调节剂在老年哮喘患者治疗中的作用》、《普通哮喘与难治性哮喘的临床特征与痰细胞学分类》被2014年全国呼吸科年会收录为书面交流。白晓雪，竭晶，杨颖，等.呼出气一氧化氮在慢性过敏性肺炎诊断中的应用价值[J].中国实验诊断学，2014，18（1）：39-42吕若君，杨颖，白晓雪，等.α2巨球蛋白在老年肺结核患者外周血中的表达及临床意义[J].中国老年学杂志，2014，34（15）：4183-4184.56 致谢本论文从选择课题开始，到完成学位论文为止，均在我的导师--华树成教授悉心指导下完成。华树成老师给予我无微不至的关怀、支持与帮助。华老师身体力行，用自身的品质感染着我，激励着我！我从华老师身上看到了坚持不懈的求知精神，乐观开朗的人生态度，勇于拼搏的工作理念都是我毕生的财富。我的每一点进步、每一份成绩都离不开华老师的帮助。在我以后漫长的人生道路上，我将时刻以华老师为榜样，树立远大志向，不断进取，踏踏实实地走好每一步，在人类的医疗事业中，高瞻远瞩，不断进取，完成属于自己的梦想！同时，本文得以完成，还离不开李丹老师，袁海波老师的教导，周丽婷师姐，等呼吸科众多师姐、同门们的帮助。在实验过程中，李丹老师，袁海波老师参与并指导了我的课题研究，对论文写作等方面也给予我很大帮助。各位同门师姐、师妹们，在我的课题研究以及论文过程中，向我提出了很多宝贵的意见，使我受益良多。时光匆匆而过，转眼间，我的硕士生涯就要结束了。回首往事，我内心久久不能平静，感谢吉林大学白求恩第一医院呼吸内科给我提供了学习和临床实践的机会，感谢全体呼吸科老师，对我的谆谆教导，感谢我的父亲、母亲、家人，在我在外求学的日子里，给予我的无私的关怀，助我顺利完成学业。我将继续努力，绝不辜负父母、家人对我的殷切希望！感谢关心我的老师，亲爱的同学朋友们，是你们的关心要我克服了前进路上一个又一个波折，我会继续努力，在你们的注视中，越飞越高！越走越远！57