固本化瘀通络法对高糖环境下足细胞自噬的干预及其机制研究

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1、ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine（基础医学院）二○一八届硕士研究生学位论文固本化瘀通络法对高糖环境下足细胞自噬的干预及其机制研究TheInterventionandMechanismofTheGubenHuayuTongluoDecoctiononAutophagyinPodocytesunderHighGlucose研究生姓名：马程功指导教师：马跃荣教授学科专业：病理学与病理生理学二○一八年五月学位论文固本化瘀通络法对高糖环境下足细胞自噬的干预及其机制研究InterventionandmechanismofThe

2、GubenHuayuTongluoDecoctiononautophagyinpodocytesunderhighglucoseenvironment马程功指导教师姓名：马跃荣教授申请学位级别：硕士专业名称：病理学与病理生理学论文提交时间：2018年4月论文答辩时间：2018年5月二○一八年五月成都中医药大学硕士学位论文摘要研究背景：我国有过亿糖尿病患者，其中有近三分之一会出现糖尿病肾病，但目前还没有针对该病特异性的药物和疗法，常规的临床治疗都只能缓解症状，延缓进展至终末期肾病的时间，并不能从根本上预防和逆转病程。目前，相关研究已证明该病实为一种足细胞病，足细胞损伤的程度

3、是预测糖尿病肾病进展的重要指标；维持足细胞的形态和恢复足细胞的功能正常，抑制或减轻足细胞的损伤是防治糖尿病肾病、控制蛋白尿的重要环节和关键措施。固本化瘀通络合剂是治疗糖尿病肾病的临床有效方剂，前期的临床研究证明该方能有效改善糖尿病肾病患者的临床症状，可以减轻尿中白蛋白的出现；体外实验也提示该方能够改善高糖所引起的足细胞形态学异常，降低凋亡率。然而固本化瘀通络合剂防治糖尿病肾病的具体机制还不明确。结合近年来细胞自噬在足细胞损伤中发挥重要作用的相关报道，我们推测调控足细胞自噬或是固本化瘀通络合剂发挥疗效的重要途径。为此，本研究拟运用高糖刺激足细胞株构建体外细胞模型，并制备正常

4、大鼠血清及固本化瘀通络合剂含药血清进行干预，观察固本化瘀通络合剂对高糖环境下足细胞损伤和自噬的影响，为该方治疗糖尿病肾病提供亚细胞层面的微观病理学证据。研究方法：1.选取清洁级雄性SD大鼠制备固本化瘀通络合剂含药血清及空白大鼠血清。2.培养MPC细胞，并分为对照组、高糖组和中药组，前两组使用空白大鼠血清进行干预，第三组则使用固本化瘀通络合剂含药血清，三组均在干预24、48、72小时后进行后续实验。3.倒置相差显微镜下观察各组足细胞的形态学改变。4.mRFP-GFP-LC3荧光双标腺病毒转染检测各组足细胞自噬流。5.免疫荧光检测各组足细胞P62蛋白表达水平。6.Wester

5、n-Blot检测各组足细胞自噬相关蛋白LC3、P62、Atg12-Atg5、Atg7以及Sirt1的表达情况。1成都中医药大学硕士学位论文7.RT-PCR检测各组足细胞自噬相关基因lc3b、p62、atg5、atg7、atg12以及sirt1mRNA的表达情况。研究结果：1.形态学观察：高糖组的足细胞在三个时间点均出现较明显的形态异常，包括细胞皱缩、足突回缩或消失、细胞间黏附性降低，甚至部分细胞脱落、死亡等，这种变化在24小时出现，并随着与高糖共培养的时间延长变得愈加明显；中药组的细胞形态较高糖组有所改善，更为接近正常组。2.mRFP-GFP-LC3荧光双标：与对照组相比

6、，高糖组足细胞内红色荧光斑点与黄色荧光斑点数量在三个时间点均明显减少；中药组足细胞内两色荧光斑点的数量较高糖组明显增多。3.P62免疫荧光检测：与对照组相比，高糖组足细胞内绿色荧光斑点数量在三个时间点均明显增多；中药组足细胞内绿色荧光斑点的数量较高糖组明显减少。4.Western-Blot检测：与对照组相比，高糖组足细胞LC3-Ⅱ、Atg12-Atg5、Atg7及Sirt1、p-Sirt1蛋白的表达量以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值在三个时间点明显减少，P62蛋白的表达量明显增加；中药组足细胞LC3-Ⅱ、Atg12-Atg5、Atg7及Sirt1、p-Sirt1蛋白的表达

7、量以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值较高糖组明显增加，P62蛋白的表达量明显减少。5.RT-PCR检测：与对照组相比，高糖组足细胞lc3b、atg5、atg7、atg12以及sirt1mRNA的表达量在三个时间点显著减少，p62mRNA的表达量显著增加；中药组足细胞lc3b、atg5、atg7、atg12以及sirt1mRNA的表达量较高糖组显著增加，p62mRNA的表达量显著减少。结论：1.固本化瘀通络合剂能够改善高糖环境下足细胞形态异常，减轻高糖诱导的足细胞损伤。2.固本化瘀通络合剂能够改善高糖环境下足细胞LC3、P62、A