水稻条纹病毒与水稻蛋白质互作研究

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分类号：S481+.1密级：公开论文编号：2012022148贵州大学2015届硕士研究生学位论文水稻条纹病毒与水稻蛋白质互作研究学科专业：农药学研究方向：农药毒理、作用机制及抗性导师：陈卓（教授）研究生：陈兵华中国﹒贵州﹒贵阳2015年6月1 目录摘要................................................................................................................................4ABSTRACT...................................................................................................................5缩略词列表....................................................................................................................7前言................................................................................................................................8第一章文献综述........................................................................................................101.1水稻条纹病毒简介............................................................................................101.2.1RdRp............................................................................................................121.2.2P2.................................................................................................................131.2.3Pc2................................................................................................................141.2.4P3.................................................................................................................151.2.5Pc3................................................................................................................161.2.6P4.................................................................................................................161.2.7MP................................................................................................................17第二章研究路线设计................................................................................................192.1研究的目的和意义............................................................................................192.2拟解决的主要问题...........................................................................................192.3研究内容............................................................................................................192.3.1采用YTHS研究互作的思路.....................................................................192.3.2RSV蛋白的各酵母双杂交载体构建........................................................212.3.3构建高质量cDNA文库.............................................................................212.3.4酵母双杂交筛选与RSV蛋白互作的寄主因子........................................222.3.5RSV编码蛋白之间的互作研究.................................................................222.3.6RSV蛋白的互作网络图谱.........................................................................222.4技术路线............................................................................................................22第三章实验与方法....................................................................................................243.1材料....................................................................................................................243.2试剂与仪器........................................................................................................273.3实验方法............................................................................................................253.3.1RSV编码蛋白各基因酵母双杂交载体构建.............................................253.3.2水稻cDNA文库构建和互作蛋白筛选....................................................313.3.3寄主因子与RSV编码蛋白的互作验证....................................................353.3.4RSV编码蛋白互作研究.............................................................................363.3.5网络图谱的绘制.........................................................................................37第四章结果与讨论....................................................................................................384.1构建RSV编码蛋白的酵母双杂交载体.........................................................384.1.1引物设计.....................................................................................................384.1.2构建RSV编码蛋白诱饵载体...................................................................382 4.1.3诱饵质粒的自激活检测.............................................................................394.2水稻cDNA文库构建......................................................................................404.2.1水稻总RNA提取及LD-PR......................................................................404.2.2筛选与RSV编码蛋白互作的水稻蛋白...................................................414.3寄主因子与RSV编码蛋白的互作验证..........................................................484.3.1YTHS验证水稻蛋白与RSV编码蛋白的互作........................................484.3.2BiFC验证水稻蛋白与RSV编码蛋白的互作..........................................514.4RSV编码蛋白之间的互作研究.......................................................................584.4.1YTHS研究RSV编码蛋白之间的互作....................................................584.4.2采用YTHS研究RSV蛋白互作...............................................................594.5绘制RSV互作网络图.....................................................................................604.5.1RSV编码蛋白间互作图谱的建立.............................................................604.5.2RSV编码蛋白与水稻蛋白互作图谱的建立.............................................624.5.3RSV互作网络图谱的绘制.........................................................................624.6讨论....................................................................................................................63第五章结论................................................................................................................655.1结论....................................................................................................................655.2主要创新点........................................................................................................655.3不足之处............................................................................................................65致谢............................................................................................................................66参考文献......................................................................................................................67附录..............................................................................................................................73原创性声明..................................................................................................................743 摘要水稻条纹叶枯病是东亚稻区水稻重要病害之一，对水稻产量构成严重影响。迄今，关于其病原—水稻条纹病毒（ricestripevirus,RSV）编码的蛋白与水稻寄主蛋白之间的互作关系以及病毒编码蛋白之间的互作关系尚无系统研究报道。因此，开展RSV互作研究对于研究病毒致病机制具有重要参考价值。本论文采用酵母双杂交（yeasttwo-hybirdsystem,YTHS）和双分子荧光互补（bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC）技术研究RSV编码蛋白与水稻寄主蛋白间的互作以及RSV编码蛋白间的互作，结果表明：第一、RSV编码蛋白可与多个寄主蛋白相互作用。其中，以RdRp为诱饵筛选出的水稻寄主蛋白最多，如：磷酸核酮糖激酶（phosphoribulokinase,chloroplastic-lke,PPKase）、光合系统I中心亚基II（photosystemIreactioncentersubunitII,chloroplastic-like,PSAD2）、细胞分裂素激动蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）、NADH激酶（NADHkinase-like,NADK3）等蛋白；第二、水稻寄主蛋白可与多个RSV蛋白互作。如：1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基（ribulose-1,5bisphosphatecarboxylase/oxygenaselargesubunit,RBCL）几乎与所有RSV蛋白均有互作，NADH脱氢酶与RSVP2、MP均有互作；第三、多个水稻寄主蛋白可与同一病毒蛋白互作。例如：脱落酸受体PYL8-like、翻译起始因子4A均与RSVP2互作，poly(A)结合蛋白、光捕获复合体均与RSVP4互作。并采用BiFC技术进一步验证了植物蛋白与病毒蛋白的互作。RSV编码蛋白之间的互作研究结果表明：RSVRdRp-1、-2、-3、-5、P2、Pc2C、CP、MP均存在自身互作；P2与RdRp-1和-2，P3与RdRp-2，P2与RdRp-5，P2与Pc2C均能双向互作；而P2与RdRp-4、P4、MP；Pc2C与RdRp-1，P2与RdRp-4、P2与P3均只存在单向互作。基于互作研究结果，我们绘制RSV病毒蛋白互作网络图，表明RSVP2是一个很重要的蛋白，可与多个RSV蛋白互作。关键词：水稻条纹病毒；酵母双杂交；双分子荧光互补；互作4 Protein-proteinInteractionsbetweenRicestripevirusandOryzasativaAbstractRicestripediseaseisreportedtocauseseverelossesinricefieldsintemperateregionsofEastAsian.Todate,theinteractionsstudyamongRSVproteinandriceproteinoramongRSVproteinshasbeennotreportedsystematically.So,thereistheimportantvalueonunderstandingthepathogenicmechanismofRSVbystudyingtheirinteractions.Inthiswork,westudiedtheinteractionamongtheproteinscodedby-RSVand-rice,orbetweentheproteinscodedbyRSVusingyeasttwo-hybirdsystem(YTHS)andbimolecularfluorescencecomplementation(BiFC),theresultswereindicatedasfollow:firstly,aproteincodedbyRSVcaninteractwithmanyriceproteins.Forinstance,manyproteinsweresimultaneouslyscreenedagainstRdRpasbait,suchasphosphoribulokinase,chloroplastic-like(PPKase),photosystemIreactioncentersubunitIIchloroplastic-like(PSAD2),mitogen-activatedproteinkinase(MAPK),andNADHkinase-like(NADK3),etal.Secondly,ariceproteincansimultaneouslyinteractwithmanyRSVproteins,suchasribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenaselargesubunit(RBCL)caninteractwithalmostallofproteinscodedbyRSV,NADHdehydrogenasecaninteractwithRSVP2andMP.Lastly,manyriceproteinscaninteractwiththeRSVprotein,suchasabscisicacidreceptorPYL8-likeandtranslationinitiationfactoreIF4AcaninteractwithRSVP2,poly(A)bindingproteinandlightharvestingcomplexmesophyll7caninteractwithRSVP4.Basedonabovethestudies,theinteractionrelationwasfurtherverifiedbyBiFCinN.benthamiana.Inaddition,theresultsbyYTHSindicatedthattheself-interactionofRdRp-1,-2,-3,-5,P2,Pc2C,CPandMPwasconfirmed;thetwo-wayinteractionofP2andRdRp-1,-2,P3andRdRp-2,P2andRdRp-5,P2andPc2Cwasconfirmed;one-way5 interactionofPc2CandRdRp-1,P2andRdRp-4,P2andP4wasalsoconfirmed.Basedonaboveallinteractionresults,wedrawanetworkmapofprotein-proteininteractions,andRSVP2proteinwasdisplayedtobeanimportantprotein,whichcaninteractwithmanyRSVproteins.Keywords:ricestripevirus;yeasttwo-hybirdsystem;bimolecularfluorescencecomplementation;interaction6 缩略词列表英文缩写英文名称中文名称RSVricestripevirus水稻条纹病毒DNA-BDDNAbindingdomainDNA结合结构域ADactivationdomain激活结构域dsRNAdoublestrandRNA双链RNAORFopenreadingframe开放阅读框PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜IPTGisopropyl-β-D-thiogalactopyranoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Kankanamycin卡那霉素PEG3350polyethyleneglycol3350聚乙二醇3350DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯Rubiscoribulose-1,核酮糖-1,5-二磷酸羧化5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase酶/加氧酶RT-PCRreversetranscriptionPCR逆转录PCRRifrifampicin利福平X-Gal5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Beta-D-Gal5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半actopy乳糖苷Ampampicillin氨苄青霉素cDNAcomplementaryDNA互补DNATMVtobaccomosaicvirus烟草花叶病毒GAPDHglyceraldehyde-3-phosphate甘油醛-3-磷酸脱氢酶dehydrogenaseRuBPribulose-1,5-bisphosphate核酮糖-1,5-二磷酸SYSVshallotyellowstripevirus胡葱黄条病毒SMVsoybeanmosaicvirus大豆花叶病毒PPKasephosphoribulokinase磷酸核酮糖激酶+VAG1vacuolarH-ATPasesATP依赖的质子泵CP26chlorophylla/bbindingprotein26叶绿素a/b结合蛋白26NADHDS3NADHdehydrogenasesubunit3NADH脱氢酶亚基3NADK3NADH-Kinase-likeNADK激酶AARPYL8abscisicacidreceptorPYL8-like脱落酸受体eIF4Aeukaryoticinitiationfactor4A翻译起始因子4A7 前言水稻条纹病毒（ricestripevirus,RSV）引起的水稻条纹叶枯病是东亚温带稻区水稻种植中最为重要的病害之一。长期以来，由于缺乏十分有效的防控措施，[1-6]该病害对水稻种植安全构成严重的影响。RSV是纤细病毒属（tenuivirus）的典型成员，为单链RNA（singlestrandRNA,ssRNA）病毒，由4条单链RNA（ssRNA）组成。病毒粒子呈丝状、颗粒状等不规则形状，分散在感病植株细胞质、液泡以及细胞核内。该病毒在植物寄主体内如何与植物寄主互作以及病毒编码蛋白如何通过互作，以便于病毒增殖、移动等，还尚不完全清楚。前期研究中，有国内外学者采用酵母双杂交、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）等互作技术研究RSV与水稻寄主的互作关系。李陪陪报道，水稻等真核生物RDR1参与RSV诱导水稻植株产生大量的vsRNAs，OsRDR1蛋白是水稻抗病毒防御反[7]应所必须的；Zheng等报道，RSVP2蛋白与Fib蛋白互作来完成其侵染与复制[8]；Elena等报道了马铃薯Y病毒与寄主互作网络，为病毒-寄主互作研究提供了[9]很好的研究思路和借鉴作用。虽然前期有关于RSV-寄主互作研究报道，但这些工作仅针对RSV某个蛋白开展互作研究，或者互作研究手段不全面，尚不足以全面解析RSV在水稻体内的互作模式。本研究首次针对RSV全基因组编码蛋白，对RSV编码蛋白中分子量较大的RNA聚合酶（RNAdependent-RNApolymerse,RdRp）采用分段构建策略，构建诱饵载体；同时，构建水稻cDNA文库，采用酵母双杂交技术、双分子荧光互补技术研究RSV7个蛋白与寄主水稻蛋白的互作关系以及RSV7个蛋白的自身互作关系；采用BiFC进行互作蛋白的进一步验证。研究发现与RSV互作的水稻寄主蛋白呈如下特点：第一、RSV编码蛋白可与多个寄主蛋白相互作用。第二、水稻寄主蛋白可与多个RSV蛋白互作。第三、多个水稻寄主蛋白可与同一病毒蛋白互作。RSV编码蛋白之间的互作研究表明：RSVRdRp-1、-2、-3、-5、P2、Pc2C、CP、MP均存在自身互作；P2与RdRp-1和-2，P3与RdRp-2，P2与RdRp-5，P2与Pc2C均能双向互作；而P2与RdRp4、P4、MP；Pc2C与RdRp-1，P2与RdRp-4及P2与P3均只存在单向互作。在此基础上，我们绘制了RSV病毒蛋白互作网络图，定位了每个与RSV互作的蛋白在整个互作网络中的关系及位置。本研究对于今后深入研究8 RSV在水稻体内的生命活动具有重要的意义；同时，对于抗病育种或进行抗病毒药剂的开发也具有一定的参考价值。9 第一章文献综述1.1水稻条纹病毒简介RSV是纤细病毒属（tenuivirus）的代表成员，纤细病毒1983年首次被确认[10]为植物病毒的一个组，到1993年才定名为纤细病毒属，病毒粒子呈丝状、颗粒状等不规则形状，分散在感病植株细胞质、液泡以及细胞核内，并归入无包膜的单链RNA（singlestrandRNA,ssRNA）病毒中。RSV由介体灰飞虱（LaodelphaxstriatellusFallen）以持久性方式经卵传播，RSV是一个多组分RNA病毒，具有独特的基因组结构和编码策略，其基因组由4条单链RNA（ssRNA）组成，分子量从大到小分别命名为RNA1、RNA2、RNA3和RNA4；RNA1通过负义编码策略编码一个337kDa的依赖RNA的RNA聚合酶，而其它三个组份均采用双[11-15]义编码策略。分别在其毒义链与毒义互补链近5'端各有一个开放阅读框（openreadingframe,ORF），各自编码一个蛋白，执行不同的功能。RNA2正义链编码一个非结构蛋白P2，负义链编码一个非结构蛋白Pc2，早前研究推测，可[16]能参与运动或病毒介体识别，随后发现P2可能是一个沉默抑制子；RNA3正[17]义链编码一个P3蛋白，具有沉默抑制子活性，负义链编码一个Pc3蛋白，是病毒粒子的外壳蛋白；RNA4正义链编码一个P4蛋白，是病毒粒子的病害特异[18]性蛋白，能引起植物发病，负义链编码一个MP蛋白，是病毒粒子的运动蛋白（图1-1）。RNA1P222.7kDaRdRp337.0kDaRNA2Pc294.0kDaP323.8kDaRNA3P420.5kDaCP35.1kDaRNA4MP32.4kDa图1-1RSV基因组结构Fig1-1ThegenomestructureofRSV10 灰飞虱传播的水稻条纹病毒主要侵染水稻，也可侵染麦类和玉米等禾本科植物。水稻感染RSV病毒后导致水稻条纹叶枯病害的发生。水稻感染初期，幼嫩的新叶叶脉上可见点状褪绿黄白斑，随后整个叶片黄白斑连成线，病斑扩展与叶脉平行形成黄绿相间的条纹，往往造成水稻心叶褪绿、捻转、并弧圈状下垂、植株矮化、严重时心叶枯死。抽穗期各类型稻均不枯心，但病株出现枯孕穗或穗小畸形，不结实或结实很少，产量较低等症状（图1-2）。图1-2RSV在水稻上不同时期典型症状Fig1-2ThetypicalsymptomofricecausedbyRSVduingdifferenttimesRSV主要由介体昆虫传播，灰飞虱是传播RSV的主要传播媒介。灰飞虱属[19]于同翅目飞虱科。灰飞虱取食感病植株后便可带毒，病毒在其体内能够大量增殖。RSV在灰飞虱体内越冬，5月份灰飞虱第一代成虫迁飞到早稻田、单季稻秧田取食后，RSV经灰飞虱卵传给水稻等禾本科作物，形成第一个发病高峰。随第一代灰飞虱繁殖，RSV经灰飞虱卵传给下一代灰飞虱，产生下一个发病高峰期。到9月下旬第五代灰飞虱成虫又迁飞到小麦或田间杂草上越冬，完成RSV的侵染循环。病毒要完成侵染循环，需要靠介体昆虫的协助，病毒-介体间密切的相互关系越来越受到科研工作者的关注。许多研究表明，病毒-介体间相互关系也是蛋白-蛋白间的互作关系。Liang等在灰飞虱唾液腺和中肠的上皮细胞同时检测到RSVSP和Pc2蛋白的存在，以独特的纤维质状的电子质不透明（fibrillar[20]electronicopaque,FEO）内含体形式存在。RSV病毒蛋白独特的存在形式有助于对昆虫的识别作用。最新研究发现，RSV在褐飞虱体内的积累量是受RSV的核糖核蛋白与昆虫体内的HiPVVP1蛋白相互作用调控的，HiPVVP1促进了RSV[21]在昆虫体内的积累。11 1.2水稻条纹病毒编码蛋白功能RSV病毒粒子可以编码七种蛋白，根据病毒蛋白的分子大小及编码框所在基因组链的属性，依次将七种不同功能蛋白命名为RdRp、P2、Pc2、P3、CP、P4和MP。1.2.1RdRpRdRp也被称为pc1，全长8970个核苷酸，是基因组中最大的一个区段，编[22]码一个由2919个氨基酸组成的多肽，分子量为337kDa的蛋白。Toriyama首次于1986年发现并提纯了RSV病毒粒子，并检测到RdRp活性的存在。其活性主要来自病毒的两个结构蛋白：一个是相对分子质量为35kDa的外壳蛋白（coatprotein,CP），另一个是相对分子质量为230kDa的蛋白，推测其为病毒的复制酶[23]蛋白Pol（replicaseproteinPol）。其蛋白存在三个保守的结构域，N端OTU-like结构域、DUF3770及Bunya-RdRp结构域。其中OTU-like蛋白酶家族是去泛素化酶家族中的一大类。该类蛋白酶可通过去泛素化作用，在病毒-寄主互作过程中起重要作用。研究表明RSVpc1蛋白N端部分可能参与病毒RdRp的成熟过[24]程及与宿主的互作过程中。孟媛采用Mating法从水稻cDNA文库筛选到水稻光捕获叶绿素a/b结合蛋白（chlorophylla/bbindingprotein,LHCP）、翻译延伸因子II（translationelongationfactorII,eIF2）与RSVRdRp蛋白N端OTU-like蛋白[25]互作。双分子荧光互补实验进一步证明了OTU-like蛋白与水稻LHCP存在强烈互作。病毒诱导基因沉默（virus-inducedgenesilencing,VIGS）技术下调LHCP基因的表达可引发明显的褪绿症状。RSVRdRp与同属病毒的RNA依赖的RNA聚合酶同源性很高，同时还与亲缘关系较远的布尼亚病毒科中少数成员也有一定的同源性。进一步对该属成员RdRp的氨基酸序列分析，表明该蛋白包含1350-1950区段的保守氨基酸序列及6个RdRp特征序列，而且在氨基酸N端1531-1552区段包含一个典型的亮氨酸[26]拉链模式结构：L-X6-L-X6-L-X6-L，这一拉链式结构已被证实具有结合RNA[27]活性，与聚合酶采用加帽机制实现转录过程的要求是相一致的，此研究也因此成为pc1编码蛋白是RSV的RdRp的一个充分证据。分析日本RSVT分离物12 vcRNA1编码蛋白的核苷酸序列，从理论上得知，它应该包含8757个碱基，蛋白分子质量接近337kDa；但此分离物获得的分子量与蛋白SDS-PAGE检测复制酶蛋白分子量（230kDa）差异较大，这种差异性表明在不同病毒系统中，不同病毒复制酶可能经历多种翻译修饰。在病毒侵染循环过程中，病毒增殖是病毒的一个重要环节，所以病毒入侵寄主细胞后，先翻译出复制所需要的复制酶，再与寄主的一种或多种寄主蛋白相互作用组成复制酶复合体。目前有关RSVRdRp与寄主蛋白的互作研究相对较少，可能是蛋白本身较大，不利于开展研究。但是从该蛋白的功能上看，就不难想象它对病毒是至关重要的。本课题组研究发现，RSVRdRp的N端与水稻热激蛋白HSP70互作，两者间的互作是RSV完成侵染所必须的。热休克蛋白70（heatshock70,HSP70）是一种高度保守的分子伴侣蛋白，普遍参与生物体胞内多种生命过程。有研究报道，植物HSP70参与多种病毒的复制过程，可协助某些病毒进行胞间运动，在病毒的侵染循环中起到重要的作用。姜珊珊通过双分子荧光互补技术和免疫共沉淀等多种技术发现，水稻HSP70（OryzasativaHSP70,OsHSP70）和NbHSP70都可与RSVRdRp的N端[28]进行互作。蛋白亚细胞定位表明，两种寄主HSP70的亚细胞定位情况与RSVRdRp能够共定位，在病毒侵染情况下，并不能引起两者蛋白定位的明显改变。而RSVMP，CP不能与HSP70发生直接的互作。定量分析感染RSV的水稻与本氏烟胞质中HSP70蛋白表达情况。结果发现，HSP70表达量均发生上调，热激处理本氏烟增强RSV侵染，增加RSVRNAs的积累量。系统沉默本氏烟HSP70后，RSV的侵染受到抑制，接种叶与上位叶中的RSVRNAs积累量显著较少，而顶部系统叶中已检测不到RSVRNAs的存在。HSP70特异性化学抑制剂quercetin处理叶片后，RSVRNAs积累量也降低。HSP70可能通过与RSVRdRp互作来影响RSV的复制过程。1.2.2P2RNA2正义链编码的P2蛋白由199个氨基酸构成，分子量大小为22.8kDa。有研究表明，RSV侵染早期的水稻中能检测到P2蛋白，但是其含量比较低。早期研究发现，针对RSV侵染灰飞虱单层细胞培养体系进行分析，结果表明P2蛋白能诱导形成胞间连丝状的管状结构，瞬时表达实验进一步证明了这一功能的13 [29]存在，证实P2蛋白参与了病毒的细胞间运动。刘利华等采用免疫胶体金标记技术和电子投射显微技术对RSV水稻病叶叶肉组织细胞壁进行研究，结果观察[30]到细胞壁中含有CP蛋白，这可能是P2蛋白与CP于胞间连丝进行协同作用。纤细病毒属的另一代表成员水稻草状矮化病毒（ricegrassystuntvirus,RGSV）的P2蛋白能在细胞壁检测到，实现了P2蛋白在亚细胞的定位，进一步明确了PSV[20]P2的运动功能。构建P2反向互补干扰RNA进行转基因实验。结果表明，抑制P2的表达会缓解RSV症状的发生，P2蛋白对于RSV的增殖和后期侵染具有[31]重要的作用。而最近越来越多有关P2蛋白与寄主因子的研究报道，有实验表明，RSVP2与完整水稻果胶酶蛋白（pectinesterase）、Ras相关蛋白（ras-relatedprotein）、胆碱磷酸胞苷酰转移酶（cholinephosphatecytidineacyltransferase）、水稻基因沉默抑制子3（suppressorofgenesilencing3,SGS3）及功能未[32]知蛋白均能互作。水稻的OsSGS3与拟南芥的SGS3具有很高的同源性，证[16]明了P2是一个沉默抑制子。能使感染RSV的水稻及拟南芥SGS3的ta-siRNA同源的5个基因发生上调，也能增加PVX在本氏烟中的积累量。最近有研究表明，RSVP2能与Atcoilin、NbFib2和OsFib2三种不同植物的核指示蛋白互作，[8]进一步实验表明P2与Fib2的共同作用协助RSV完成系统侵染。P2蛋白通过与纤维蛋白的互作，使P2蛋白的核定位发生改变，表明P2可能参与调控核仁功能。1.2.3Pc2RNA2反义链编码的Pc2蛋白由834个氨基酸组成，分子量大小为94kDa。氨基酸序列分析表明Pc2与布尼亚病毒科（bunyaviridae）白蛉热病毒属（phlebovirus）跨膜区G2、G1蛋白前体有相似的氨基酸序列，推测该蛋白可能[33]参与细胞膜融合。Zhao等对成功表达Pc2的昆虫Sf9细胞于低pH下诱导或与RSVCP共表达，结果未观察到细胞膜溶解现象，表明RSV不是只以溶解膜[34]质而进入昆虫细胞的。Pc2氨基酸序列含有36个半胱氨酸（Cys）残基，在纤细病毒属保守区域内只分布着26个Cys残基，达到保守区域的30%左右；对其氨基酸序列分析发现，在蛋白酶加工位点上有一段Ser（381）~Cys（382）序列，如果忽略蛋白加工过14 程糖基化的发生，Pc2蛋白存在被切割成两个蛋白的可能，我们将这两个蛋白分别命名为：Pc2蛋白N端命名为Pc2-N，由381个氨基酸构成，分子量大小为43kDa；而Pc2蛋白C端命名为Pc2-C，由453个氨基酸组成，分子量大小为51[35]kDa。通过对Pc2蛋白融合eGFP实验，证实了两个蛋白的存在，且这两个蛋白在核内表达后均能运输都内质网膜（endoplasmicreticulummembrane,ER）上；进一步的突变实验分析表明，Pc2蛋白包含3个ER定位区域。据此推测，Pc2存在特殊的拓扑异构结构，即在Pc2蛋白内部信号肽上包含有一个裂缝区域及两[36]个跨膜区域。最近有研究报道Pc2作为一个非结构蛋白，可能参与胞内高尔基体依赖的分泌系统。1.2.4P3RNA3正义链编码的P3蛋白由211个氨基酸构成，分子量大小为23.9kDa。RSVP3是一个具有沉默抑制子功能的非结构蛋白。其氨基酸序列与同属的水稻白叶病毒（ricehojablancavirus,RHBV）P3蛋白同源性高达43%。RHBVP3是一个沉默抑制子早前得以证实。进一步的蛋白-核酸结合实验发现，P3蛋白在C段154~194aa之间存在结合单链和双链siRNA的活性位点，通过以非特异结合dsRNA/siRNA的方式阻止其进入RISC，保护mRNA不被降解，实现沉默抑制[37]的功能。P3蛋白C端倾向于碱性，主要形成ß-折叠片层；相反P3蛋白N端呈酸性，倾向于形成ɑ-螺旋。这些特征与真核生物转录因子相似，但定位实验表明其只存在于细胞质，不能于核内行驶转录因子功能。WesternBlot实验发现，P3蛋白能够在带毒虫体内、病毒粒子和病叶中被检测到，推测其可能参与病毒[38]的复制过程。有研究证实，转P3蛋白的水稻、烟草阳性植株均未表现出生长发育上的异常，但在本氏烟中利用PVX病毒载体过表达P3蛋白，导致PVX症[39]状加重，说明P3蛋白可以增强PVX的致病性，但并不是致病决定因子。越来越多的研究报道，P3蛋白与寄主因子和介体蛋白存在相互作用，如P3蛋白与水稻亚硫酸氧化酶（ricesulfiteoxidase,OsSO）、水稻核糖体蛋白L4、完整水稻UBA/TS-N域包含蛋白(UBA/TS-Ndomaincontainingprotein)、水稻SGS3蛋白及3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)[40]蛋白互作，也与灰飞虱体内的一个蛋白酶系统的亚基RPN3及（ribosomal15 [32]proteinL4,RPL4）互作。1.2.5Pc3RNA3负义链编码的CP蛋白由322个氨基酸组成，分子量大小为35kDa。Pc3是RSV外壳蛋白（coatprotein,CP），也被称为N蛋白（nucleocapsidprotein）。应用免疫胶体金电镜技术检测RSV侵染的不同时期病叶CP，发现其含量丰富，以可溶性成份均匀分布于病株细胞质及叶绿体。RSV病毒粒子外层是由CP蛋白包裹而成，其病毒粒子要完成侵入寄主细胞，需要CP蛋白参与介体的识别及传播过程。研究发现，CP蛋白C端（201~322aa）可以非特异结合病毒核酸，实[41]现对病毒粒子的包裹和组装。CP基因在RSV侵染水稻的各时期均能稳定表达，因此CP常作为实验室检测RSV病毒积累量的重要指标。通常将检测RSV的引物和探针设计在CP基因的保守区域，在核酸水平检测病毒的积累量，其结果比其它方法更可靠。也有研究发现转CP基因水稻能抵抗病毒的侵染和传播，设计RNA干扰载体沉默RSV-CP基因，转基因植株的抗性与CP同源的sRNA[42]表达量直接相关。而研究也发现，CP蛋白与病毒其它蛋白和介体存在多种互作。如CP与灰飞虱体内核糖体蛋白L18（ribosmalproteinL18e,RPL18e）和表[43]皮蛋白基因（cuticularprotein,CPR）互作，RSVCP分别与RSVP4和RSVMP能够相互结合，协助病毒运动及致病。1.2.6P4RNA4正义链编码的P4蛋白由178个氨基酸组成，分子量大小为20.5kDa。P4广泛分布于水稻细胞的液泡、细胞核、叶绿体、细胞质以及昆虫介体的组织[44]中，是RSV病毒的非结构蛋白。主要以包涵体形式聚集分布于RSV侵染的水稻和灰飞虱细胞质中。在RSV侵染不同时期水稻中，P4蛋白以不定形的内含体和针状结构在病株中大量聚集，决定了植株的症状表现，因此，推测该蛋白为[45]RSV病毒的病害特异蛋白（disease-specificprotein,SP），也是致病相关蛋白。[46]有研究报道，P4可能参与病毒与介体昆虫最初的识别。16 1.2.7MPRNA4负义链编码的Pc4蛋白由286个氨基酸组成，分子量大小为32.5kDa。Melcher研究发现，Pc4蛋白与植物病毒30kDa蛋白家族中的移动蛋白结构相似，并证实了Pc4蛋白的运动性，将该蛋白定义为运动蛋白（movementprotein,MP）[47]。将RSVMP分别克隆到马铃薯X病毒（potatovirusX,PVX）运动功能缺失突变体及TMV突变体中，两种病毒均能在烟草中系统扩散，引起叶片坏死。研究结果表明，RSVMP不仅能协助病毒运动，而且还可能有致病性。采用系统丙氨酸扫描突变法对RSVMP蛋白区段致病性进行研究。结果表明，MP蛋白K（122）~D（258）区段与细胞间运动相关；且ER（201~202）、ER（170~171）、ELD（256~258）、EFE（218~220）、ED（170~171）及D（135）突变区段胞间运动不能恢复，却能长距离运动功能；而KGR（122~124）突变区段胞间运动及长距离运动功能丧失；DD（17~18）和RK（32~33）突变区段表现出坏死症状[48]的强烈消减；D（17）~K（33）突变区段与叶片坏死相关。而我们实验室研究表明，RSVMP跨膜区段106~123aa是其定位到胞间连丝（plasmodesmus,PD）和恢复运动缺失型PVX突变体（PVX-GFP△P25）的运动性是必需的，而定位到叶绿体不是必需的。MP蛋白N端73个氨基酸是其定位到叶绿体所必需的。丙氨酸扫描突变体分析及体外结合实验表明，MP定位到PD上对运动功能的发挥是关键的，具有核酸结合能力和其它未知的特性共同行驶MP运动功能，实现[49]病毒间细胞运动。目前，许多研究表明，RSVMP同样与多种寄主蛋白存在相互作用。Lu等采用酵母双杂交筛选到MP与水稻I型DnaJ蛋白和水稻小的热激[50]蛋白（hostshockprotein,Hsp）互作，免疫共沉淀进一步证明了它们的互作。1.3酵母双杂交技术YTHS技术是Fields和Song于1989年根据真核生物基因转录调控的原理建[51]立的。酵母等真核生物起始基因转录需要反式转录激活因子的参与。酵母转录因子Gal4在结构上是组件式的。包含DNA结合结构域（DNA-bindingdomain,BD）和转录激活结构域（activationdomain,AD）。这些因子在功能上往往是相互独立的，DNA-BD结构域和AD结构域单独作用都不能激活转录反应。只有当它17 们在空间上相互靠近时，才表现出完整的Gal4转录因子活性，激活Gal1上游激活序列（upstreamactivatingsequence,USA）下游的启动子，启动子从而起始下游基因的转录，激活报告基因的表达，合成酵母生长所必需的各种氨基酸。YTHS酵母菌株特定报告基因（如：HIS3、ADE2、MEL1和LacZ等）的表达使酵母菌能在特定的缺陷培养基上生长，同时报告基因MEL1或LacZ的表达使X-ɑ-Gal显蓝。利用YTHS可以检测已知蛋白间的相互作用，确定蛋白相互作用的重要活性位点或结构域，检测蛋白质二聚体的形成以及从cDNA文库中筛选与已知[52]蛋白相互作用的未知蛋白。相对于其它真核细胞，酵母生长速度快，易于操作。因此，YTHS相对于其它技术具有独特的优势。可以筛选新的与已知蛋白作用的蛋白，快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用。具有以下优点:第一，显色反应在真核细胞内进行，融合蛋白更有可能正确折叠和进行翻译后修饰，在一定程度上反映了细胞内的真实情况；第二，互作蛋白相互作用信号是在融合基因表达后，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤；第三，cDNA文库构建可选择不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料，能分析细胞核、细胞浆及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白；第四，检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间微弱的或短暂的相互作用。虽然YTHS有其明显的优势，但是也存在一定的缺陷，假阳性和假阴性是YTHS普遍存在的。因此，两蛋白之间的互作往往还需要其它手段来进一步证明。如金属螯合色谱的方法、GSTpulldown实验以及免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)等方法。尽管YTHS存在其明显缺陷，但过去二十年中结合其它方法鉴定了许多植物寄主蛋白与病毒蛋白的互作关系，大大加速了病毒蛋白功能的研究及病毒致病机制的研究。当前，YTHS技术仍然是研究蛋白-蛋白相互作用的有效手段。18 第二章研究路线设计2.1研究的目的和意义RSV是东亚稻区水稻种植中最为重要的病毒之一，由该病毒引起的水稻条纹叶枯病对水稻产量构成极大的影响。迄今，关于RSV与水稻寄主的互作机制研究尚不全面和透彻。本研究拟采用YTHS和BiFC两种技术研究RSV与水稻寄主蛋白和RSV编码蛋白间的互作关系，并绘制RSV互作网络图，为深入研究RSV的致病机制以及病毒在水稻寄主体内的增殖等生命机制提供参考。2.2拟解决的主要问题1）系统解决RSV编码蛋白与水稻蛋白的互作研究。在前期研究中，针对RSV某个或几个蛋白互作关系进行研究，尚无系统开展RSV互作研究工作的报道，尤其是RSVRdRp。而本研究首次针对RSV7个蛋白与水稻蛋白和RSV蛋白之间的互作研究。2）系统绘制RSV病毒蛋白间及RSV与水稻蛋白间互作网络图谱。采用生物信息学绘制病毒与植物寄主蛋白以及病毒自身编码蛋白之间的互作网络图谱对于研究RSV蛋白与水稻寄主蛋白的互作关系具有重要的作用，对于深入理解病毒在植物寄主体内的生命活动具有重要的参考价值。2.3研究内容2.3.1采用YTHS研究互作的思路2.3.1.1互作方法的选择采用YTHS系统筛选互作蛋白有共转法和酵母接合法（yeastmating）。针对共转法，构建的cDNA文库不需要预先转化到酵母细胞内，借助高分子化合物聚乙二醇（PEG）3350介导的热激转化，就能够促使酵母细胞处于完全感受状态。线性化的鲑鱼精DNA可保护外源质粒免遭DNA酶降解，同时协助环形质粒DNA进入酵母细胞。共转法的优势是可选择cDNA文库，其缺点为热激转化效率低，造成没有或少量克隆生长。由于酵母自身的转化效率就要比细菌低4个数量级左右，Bendixen等人通过利用酵母接合型的原理，实现了转化的高效率，从而有利于互作蛋白的筛选，但其缺点为不能插入cDNA文库作为载体，只能19 通过体外构建载体再转化。基于此，本研究采用共转法筛选与RSV编码蛋白互作的水稻蛋白，RSV编码蛋白的12个诱饵质粒每一个诱饵至少筛选了2次，而至少构建了10个较高质量的cDNA文库用于蛋白筛选实验。2.3.1.2互作严格度的选择从严格度的筛选条件分类，互作蛋白的鉴定分为高度严格筛选、中度严格筛选和低度严格筛选（图2-1）。这三种条件筛选理论上对于两个互作蛋白是不存在差异的，酵母菌都能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-gal平板上生长且显蓝。但是在实际的试验中，直接将酵母菌涂布到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp高度严格的营养缺陷平板上培养，酵母菌往往因面临较高的缺陷压力而限制了一些互作强度较弱或者暂时性互作的酵母生长。导致筛选过程中遗漏了一些互作较弱的蛋白。因此，为了筛选较多的互作蛋白，本研究将严格度设定为中等严格度。2.3.1.3自激活试验YTHS技术是一种直接用于检测细胞内蛋白-蛋白相互作用的灵敏度很高的遗传学新方法。该系统利用酵母体内特殊的GAL4转录调控因子，把待检测存在相互作用的两个蛋白质（A、B）的编码基因分别与GAL4的DNA结合结构域（DNA-bindingdomain,BD）和转录激活结构域（transcriptionactivationdomain,AD）融合，通过下游报告基因的表达与否，筛选出存在相互作用的蛋白质。如果单纯将A-BD诱饵基因转化到酵母细胞中时，由于缺少AD结构域而不能启动下游报告基因的表达。但是如果转录基因本身具有转录因子活性，就会直接激活下游报告基因的表达。如果存在这种情况，那么酵母双杂交实验将会出现大量假阳性结果。为避免这种情况，在筛库之前有必要进行诱饵蛋白的自激活检测。20 [53]图2-13种不同严格度筛选互作蛋白Fig2-1Threestringencywaysforselectinginteractionproteins2.3.2RSV蛋白的各酵母双杂交载体构建采用常规分子克隆技术分别构建酵母双杂交诱饵载体（pGBKT7）和猎物载体（pGADT7）。根据已发表的RSV基因组全序列设计引物，用于PCR扩增RSV病毒编码7个蛋白的12个基因序列或片段。RSVRdRp分为5段构建，分别命名为RSVRdRp-1、-2、-3、-4和-5，NSvc2分为C端Pc2-C和N端Pc2-N，RNA3和RNA4各自2个蛋白—P3、CP和P4、MP。分别构建酵母双杂交12个诱饵载体：pGBKT7-RdRp1、pGBKT7-RdRp2、pGBKT7-RdRp3、pGBKT7-RdRp4、pGBKT7-RdRp5、pGBKT7-P2、pGBKT7-Pc2C、pGBKT7-Pc2N、pGBKT7-P3、pGBKT7-CP、pGBKT7-P4、pGBKT7-MP；12个猎物载体：pGADT7-RdRp1、pGADT7-RdRp2、pGADT7-RdRp3、pGADT7-RdRp4、pGADT7-RdRp5、pGADT7-P2、pGADT7-Pc2C、pGADT7-Pc2N、pGADT7-P3、pGADT7-CP、pGADT7-P4、pGADT7-MP。2.3.3构建高质量cDNA文库采用Trizol法提取健康日本晴水稻总RNA，SMART技术反转合成单链cDNA，再用梯度PCR合成cDNA，即为用于酵母双杂交的cDNA文库。21 2.3.4酵母双杂交筛选与RSV蛋白互作的寄主因子采用共转法进行酵母双杂交文库蛋白的互作筛选，分别用12个诱饵蛋白pGBKT7-RdRp1、pGBKT7-RdRp2、pGBKT7-RdRp3、pGBKT7-RdRp4、pGBKT7-RdRp5、pGBKT7-P2、pGBKT7-Pc2C、pGBKT7-Pc2N、pGBKT7-P3、pGBKT7-CP、pGBKT7-P4和pGBKT7-MP与cDNA文库共转化酵母感受态细胞。采用SD/-Leu-Trp-Ade营养缺陷筛选，采用显色底物X-ɑ-gal检测报告基因，以此判定蛋白的互作情况（即，互作蛋白酵母显示蓝色）。在此基础上，对互作阳性结果，挑选菌落至SD液体培养基培养，再转接到四缺（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-gal）平板，30℃培养，观察其是否能正常生长且显蓝，显蓝提示两蛋白间存在互作。2.3.5RSV编码蛋白之间的互作研究用12个RSV编码蛋白诱饵载体和猎物载体共转化酵母菌株Y2HGlod，共计转化168个组合。共转化产物首先涂布二缺（SD/-Trp/-Leu）平板，30℃培养2~3d，挑取克隆到二缺（SD/-Trp/-Leu）液体培养基中震荡培养1~2d，将混浊菌液稀释成四个浓度梯度后点10μL到四缺（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-gal）平板，于30℃培养3~5d，观察是否有酵母菌落生长以及菌落是否显蓝。2.3.6RSV蛋白的互作网络图谱根据Blast在线比对结果，查找互作水稻蛋白名称，对蛋白进行基因注释、功能分析。2.4技术路线22 图2-2RSV互作研究技术路线Fig2-2TechnicalrouteofinteractionstudyaboutRSV23 第三章实验与方法3.1材料3.1.1水稻与烟草材料健康日本晴水稻（OryzasativaL.japonica.cv.Nipponbare）种子及携带RSV的日本晴水稻由本实验室保存。水稻种子经催芽后播种于土壤至三叶一期时备用。本氏烟草（NicotianaBenthamiana）由实验室保存，播种于营养土生长至二片小叶发出后移栽于25℃温室中。3.1.2菌株与载体质粒大肠杆菌（Escherichiacoli）TG1菌株、大肠杆菌Trans1-T1菌株、大肠杆菌DH5ɑ菌株、大肠杆菌XL10-gold菌株购自PhagePharmacia公司；pGEM-T载体购自Promega公司。酵母菌株—Y2HGlod和AH109，质粒—pGBKT7-53、pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-Lam和pGADT7-Rec购自Clontech公司。农杆菌C58C1菌株和根瘤农杆菌EHA105由实验室保存，BiFC载体质粒由赵晋平博士提供。3.2试剂和仪器3.2.1试剂QIAquickGelPurificationKit购自QIAGEN公司；T4DNALigase、SVTMminiprepsDNAPurificationSystem、pGEM-Tvector购自Promega公司；LATaq、TMEXTaq、各种限制性内切酶、RibonucleaseH（RNaseH）、RibonucleaseInhibitor、AMVReverseTranscriptase、DNALigationKitver.2、DL2000Plus购自TAKARATMTM公司；GeneRμLer1kbDNALadder购自MBI公司；Trizol、SuperScriptⅡRNase-TMHReverseTranscriptase、MMLV购自Invitrogen公司。BDAdvantage2PCRKit、24 MatchmakerGAL4Two-Hybridsystem3、X-α-gal及-Ura、-TrpDOSupplement、-LeuDOSupplement、-Leu/-TrpDOSupplement、-His/-Leu/-TrpDOSupplement、-Ade/-His/-Leu/-TrpDOSupplement、MinimalSDBase购自Clontech公司产品。Tryptone、Peptone-Y、YeastExtract、IPTG、X-Gal、Tris、组氨酸（L-Histidine）等为BBI进口分装；氨苄青霉素（Ampicillin）、卡那霉素（Kanamycin）以及腺嘌呤（adenine）等常用抗生素为Amersco产品；DMF、NaCl、ß-巯基乙醇、DMSO等常用生化试剂购自上海生工生物工程有限公司，均为分析纯进口产品分装。引物合成及测序于杭州铂尚生物技术有限公司、杭州擎科生物技术有限公司、上海生工生物工程有限公司和上海英骏生物技术有限公司完成。3.2.2仪器核酸蛋白浓度测定分光光度计Biophotometer、梯度PCR仪（MastercyclerGradient）以及小型台式离心机（Centrifμge5415D、5417R）购自德国eppendorf公司产品；BECKMAN大型卧式高速离心机（J2-HSCentrifμge）；GILSON移液器（PIPETMAN）；卧式超速离心机（SORVALLΜLTRA80）；Bio-rad电泳仪（GIBCOBRLModel4001,Model250）和LifeTechnologies；Thermolyne振荡器（MixerType37600）；SANYO公司超低温冰箱（-40℃、-70℃）；德国Zeiss公司共聚焦激光扫描显微镜（ZeissLSM510）（浙江大学）；德国ependorf的核酸蛋白测定仪（GeneQuantpro）。以及其它常用小型仪器如摇床、水浴锅、超净工作台等均为国产仪器。3.3实验方法3.3.1RSV编码蛋白各基因酵母双杂交载体构建3.3.1.1RNA的提取1、无RNase处理技术主要用于抽提RNA以及有关RNA操作的实验中，包括抽提水稻总RNA、烟草总RNA、mRNA合成以及cDNA合成。处理RNase有两种方法，一种是用0.1%DEPC水浸泡48h后高压灭菌；另一种是用工作浓度为1μg/mL蛋白酶K25 处理。后者因为简便安全而逐渐取代前者。具体操作如下：配制RNA裂解试剂：直接用灭菌的双蒸水配制，最后，加入蛋白酶K至终浓度1μg/mL。轻轻混匀，室温放置15min后即可。枪头及离心管去除RNase：将枪头及离心管清洗干净，放入预先混好的含1μg/mL蛋白酶K的双蒸水，彻底浸入。室温放置30min，连水一起高压灭菌。弃水后，烘干即可。RNase-Free水：直接在超纯水中加入蛋白酶K至终浓度1μg/mL，轻轻混匀，室温放置3~4h后，灭菌处理即可。蛋白酶K的残留对相关实验没有可见的影响。2、植物总RNA抽提采用Trizol法从病毒侵染的叶片及健康叶片中提取植物总RNA。操作如下：1）将约100mg新鲜叶片迅速在液氮中研磨成粉末，然后迅速加入1mLTrizol（以下操作以加入1mLTrizol试剂为标准）。2）研磨后转接到2mL离心管中，振荡5s，冰上放置5min。4℃，12,000rpm离心5min。3）小心吸取上清到新的离心管中，加入1/5体积氯仿，用力摇15s，冰上放置5min。4℃，12,000rpm离心15min。4）底层为有机氯仿相，中层为白色蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入另一新的离心管（注意不要吸入白色蛋白层），加入0.5mL氯仿，振荡混匀，冰上放置5min。4℃，12,000rpm离心20min。5）将上清小心转移到新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，-70℃沉淀至少2h。4℃12,000rpm离心20min，弃上清。6）加入1mL预冷的75％乙醇（RNase-Free），用枪头吹打并击碎白色RNA沉淀。4℃12,000rpm离心5min。7）重复步骤6一次，以彻底洗净盐份。8）弃上清，将乙醇吸干后，倒扣干燥10min，加入20~50μLRNase-Free水溶解。提取过程中要勤换手套并戴口罩，以免RNA降解。9）RNA样品OD值测定。吸取1μLRNA溶液加入到99μLRNase-Free水中，用紫外分光光度计测定230nm、260nm和280nm的OD值，记录三个数值26 大小。RNA浓度＝OD260×核酸稀释倍数×40/1000（μg/μL）去除蛋白指标：OD260/OD280≥1.8去除盐分指标：OD260/OD230≥2.010）RNA电泳检测。取1~2μLRNA样品，配制1%琼脂糖凝胶电泳检测。电压调制最大300V，电泳5~8min，EB染色，成像观察RNA质量。3.3.1.2逆转录以提取的水稻或烟草总RNA为模板，M4-T（5'-GTTTTCCCAGTCACGAC(T)15-3'）为引物逆转录合成cDNA第一链。20μL逆转录体系为：组分体积（μL）模板RNA(含RNA10ng~1.2μg)10.5下游起始引物(100μmol/L)2.02+10×反应缓冲液（Mgplus）4.010mmol/LdNTPs2.0RNasin(40U/μL)0.5AMV(200U/μL)1.0反应总体积20.042℃合成90min，75℃，20min后，取出放入-30℃冰箱保存。3.3.1.3PCR扩增TM本论文水稻基因组序列扩增主要采用TaKaRa公司的LATaqPCRsystem，50μL反应体系成分如下：27 组分体积（μL）TM2+10×LATaqbuffer（Mgplus）5.0dNTPmixture(各2.5mmol/L)7.0上游引物(10μmol)2.0下游引物(10μmol)2.0cDNA2.0H2O31.5LATaqDNApolymerase0.5反应总体积50.0检测采用TaKaRa公司的EXTaqDNA聚合酶体系，反应体系如下：组分体积（μL）2+10×EXTaqbuffer（Mgplus）2.5dNTPmixture(各2.5mmol/L)2.0上游引物(10μmol)1.0下游引物(10μmol)1.0cDNA1.0H2O18.4EXTaqDNApolymerase0.1反应总体积25.0PCR程序设置：94℃预变性3min，94℃变性30s，进行扩增30~35个循环，每轮循环包括94℃变性3min、退火30s（根据计算的Tm值和实际操作进行相应调整）和72℃延伸1~2min（根据目的片段长度计算延伸时间，通常合成1kb大小需要1min）。循环结束后72℃延伸反应10min以确保获得全长产物。PCR扩增产物跑1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测。28 3.3.1.4DNA片段切胶回收50μLPCR产物全部电泳后切下大小一致的目的条带，用QIAquickGelExtractionKit（QIAGEN）回收纯化试剂盒回收产物，具体方法如下：1）将切下的目的胶条置2mL离心管中，加入450μLBufferQG，将离心管放入50℃水浴10min，每隔几分钟混匀一次；2）取出后加入150μL异丙醇，混匀后吸到吸附柱中过柱，14,000rpm离心30s；3）弃滤液，加入700μLBufferPE冲洗吸附柱，14,000rpm离心30s；4）重复步骤3一次；5）弃滤液，14,000rpm离心2min以彻底弃除吸附柱上残留的BufferPE；6）加30μL灭菌水于柱中心，14,000rpm离心1min，DNA产物-30℃保存。3.3.1.5T-A连接当用LATaqDNA聚合酶（不包括某些产生平端的聚合酶）进行PCR扩增时，产物DNA的3'末端会自动加上一个游离的A碱基，pGEM-Tvector（Promega）载体5'端带有一个与之配对的T碱基，可与PCR产物直接连接。连接体系如下，4℃连接过夜，连接产物直接转化大肠杆菌。组分体积（μL）2×ligasebuffer5.0PCR产物(切胶纯化)3.0pGEM-Tvector1.0T4DNA连接酶1.0反应总体积10.03.3.1.6转化和筛选1）将10μL连接产物全部加到50μL感受态细胞中，冰上放置30min；2）42℃水浴中热激90s，立即转移至冰上冷却2min；3）加入890μL预冷的无抗LB培养液（每升含10gTryptone，5gYeastExtract，10gNaCl，pH7.0），37℃摇床200rpm培养1h；29 4）5,000rpm，离心2min，全部菌体涂布于含氨卞青霉素（50~100mg/mL）的LB平板上（液体LB培养基中添加1.5%琼脂粉，预先涂布X-gal和IPTG）。37℃过夜培养（10~14h）；5）挑取白色单克隆于1mL的LB液体培养基中（含氨卞青霉素50~100mg/mL），37℃摇床200rpm培养6~8h；3.3.1.7抽提质粒采用SVminiprepsDNAPurificationSystem试剂盒（Promega）法，抽提质粒经双酶切鉴定。1）收集6mL菌液于离心管，5,000rpm离心2min，弃上清液；2）加入250μLCellResuspensionSolution悬浮菌体，涡旋3min；3）加入250μLCellLysisSolution，颠倒混匀；4）加入10μL碱性磷酸酶颠倒混匀，室温放置5min；5）加入350μLNeutralizationSolution，颠倒混匀，14,000rpm离心10min；6）取上清液（约850μL）于SpinColumn，14,000rpm离心30s，弃滤液；7）向SpinColumn加入750μLWashSolution，14,000rpm离心30s，弃滤液；8）加入250μLWashSolution于SpinColumn，14,000rpm离心2min，弃滤液；9）将SpinColum移至1.5mL离心管中，第一次加入50μL无RNase水，14,000rpm离心1min，再加入30μL无RNase水，14,000rpm离心1min。纯化的质粒于-30℃保存备用。3.3.1.8酶切鉴定采用两种酶进行酶切，选择两种适当的限制性内切酶，用同种酶酶切载有目的基因的质粒和载体质粒，于37℃水浴中酶切1~4h。电泳检测并切胶纯化酶切产物。30 组分体积（μL）质粒16.02+10×fastbuffer（Mgplus）2.0限制性内切酶11.0限制性内切酶21.0反应总体积20.03.3.1.9测序和比对分析PCR鉴定为阳性克隆菌液送上海英骏生物技术有限公司、杭州铂尚生物技术有限公司及杭州擎科生物技术有限公司测序。序列分析主要采用DNAMAN、Primer等软件包。序列的Pairwise比较采用RESearch软件，蛋白序列比较采用PILEUP软件。3.3.2水稻cDNA文库构建和互作蛋白筛选3.3.2.1水稻cDNA文库构建1、第一链cDNA合成采用Trizol法抽提水稻总RNA。采用SMART（SwitchingMechanismAt5'endofRNATranscript）技术进行cDNA合成。1）向0.25mL的RNaseFree离心管中加入：组分体积（μL）RNA6.0CDSIIIprimer(10μmol)2.0反应总体积8.02）混匀后75℃保温2min，立即置于冰上冷却2min。3）再依次加入以下成分：31 组分体积（μL）2+5×buffer（Mgplus）4.0DTT（20mmol/L）2.0dNTPmix（10mmol/L）2.0-SuperScriptTMⅡRNaseHReverseTranscriptase2.0反应总体积18.0轻轻混匀后，PCR仪上42℃，10min。4）立即取出，冰上放置2min，加入2μLSMARTⅢ，PCR仪上42℃，60min。5）75℃，10min终止反应。结束后，取出置于冰上2min后，加入1μLRNaseH（2unit），37℃，20min。2、LDPCR合成和扩增dscDNA往0.25mLEP管中加入：组分体积（μL）无菌去离子水80.02+10×LAPCRbufferⅡ（Mgplus）10.02.5mMdNTPmixture2.05'PCRprimer(10μmol)2.03'PCRprimer(10μmol)2.0cDNA第一链2.0TaKaRaLATaq2.0反应总体积100.0混匀后按以下程序进行PCR反应：94℃3min94℃30s55℃30s26cycles72℃1min72℃10min32 PCR程序结束后，取5μL电泳检测dscDNA质量。3.3.2.2互作蛋白筛选1、酵母菌株的活化用细丝蘸取-70℃保存的酵母甘油菌株—Y2HGold或AH109于YPDA平板上划线，30℃培养3~5d。2、酵母感受态细胞制备（LiAc法）1）从YPDA平板上挑取酵母单克隆（<4周，直径2~3mm），接种到3mLYPDA液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养8~12h。2）取5μL酵母菌液转接到50mLYPDA液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养至OD600达到0.3（约16~20h）。3）室温下8,000rpm离心5min。4）弃上清，将菌体重悬于100mLYPDA液体培养基中于30℃继续振荡培养至OD600达到0.5（约3~5h）。5）室温下8,000rpm离心5min。6）弃上清，将菌体重悬于40mL无菌去离子水中，洗涤酵母菌体一次，再用1.1×TE/LiAc溶液洗涤一次菌体。7）室温下8,000rpm离心5min。8）弃上清，用适量1.1×TE/LiAc溶液将菌体重悬，以备进行下一步实验。注意：制备的酵母感受态细胞应立即用于转化。通常冰上放置若干小时不会明显影响转化效率。3、水稻dscDNA和SmaI酶切后的pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y2HGold1）往预冷的10mL离心管中依次加入20μL水稻dscDNA，10μLSmaI单酶切的pGADT7-Rec（0.5μg/μL）回收产物，10μL酵母诱饵质粒及20μLHerringTestesCarrierDNA（用前沸水中变性10min，立即插于冰上备用）。2）加入600μL酵母感受态细胞，轻轻混匀。3）再加入2.5mL新配制的PEG/LiAc溶液，轻轻混匀。4）30℃水浴45min，每15min混匀一次。5）取出，加入160μLDMSO，混匀后42℃水浴20min，每10min混匀一次。33 6）8,000rpm离心5min，弃上清，菌体重悬于2mLYPDPLUS液体培养基，30℃振荡培养1~2h。7）8,000rpm离心5min，弃上清。将菌体重悬于1~2mL灭菌水中。8）每板涂200μL菌液，涂布约5块SD/-Trp/-Leu/-Ade平板。30℃倒置培养至酵母菌落出现，约需3~6d。4、互作蛋白筛选挑取直径≥1mm的酵母单克隆于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液体培养基中，30℃震荡培养2~5d至菌液浑浊。用文库通用引物5'和3'PCR检测互作蛋白基因片段大小。阳性克隆于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-Gal四缺平板显色检测，30℃培养2~7d，统计显色时间及颜色深浅。5、酵母质粒抽提Lyticase法提取酵母质粒步骤如下：1）互作阳性克隆酵母菌液转接到盛有3mL培养液的摇菌管中，30℃，230rpm培养3~5d。2）收集2mL酵母菌液，6,000rpm离心5min，弃掉上清液，剧烈振荡，使菌体重悬于50μL剩余培养液中。3）加入10μLLyticase溶液（5U/μL），充分混匀，37℃振荡30~60min。4）加入10μL20％的SDS溶液，涡旋振荡1min。5）放入-20℃冰箱冻融一次，再次涡旋，确保菌体完全裂解。6）加入130μLpH7.0的TE缓冲液和200μL酚氯仿:异戊醇（25:24:1），高速振荡0.5min。7）13,000rpm离心10min。8）小心转移上清到新的离心管中，加入8μL10mol/L的醋酸铵溶液和500μL无水乙醇，混匀，-70℃放置1h。9）13,000rpm离心10min。10）弃上清，沉淀溶于20μL无菌去离子水中。6、酵母质粒大肠杆菌细胞1）取2~5μL抽提的酵母质粒，加入到25μL大肠杆菌TransT1感受态细胞中，冰上静置30min。34 2）42℃热激90s，冰上静置2min。3）加入890μL无抗的LB液体培养基，37℃，220rpm培养1.5h，4）5,000rpm离心2min，菌体全部涂布到含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养10~17h。5）分别挑取4个克隆到1mL含氨苄青霉素的液体培养基中，37℃，220rpm震荡培养3~4h，引物5'和3'PCR检测克隆大小。6）阳性克隆取200μL菌液送公司测序。7、互作蛋白生物信息学分析测序结果于NCBI数据库中比对水稻的基因序列，确定该蛋白的名称，获得该蛋白的全长序列和基因登入号。3.3.3寄主因子与RSV编码蛋白的互作验证根据Blast比对蛋白序列，确定互作寄主蛋白名称，NCBI上找目标蛋白全序列设计引物构建酵母载体pGADT7-R（R：互作水稻蛋白）。1、水稻cDNA合成1）参照Trizal试剂盒抽提水稻RNA，反转为cDNA。2）用特异引物从cDNA文库扩增目的基因片段，采用以下体系：组分体积（μL）2+10×LATaqTMbuffer（Mgplus）5.0dNTPmixture(各2.5mmol/L)7.0上游引物(10μmol)2.0下游引物(10μmol)2.0cDNA0.5H2O33.0LATaqDNApolymerase0.5反应总体积50.03）切胶纯化目的片段，连接pGEM-T载体。4）转化大肠杆菌DH5ɑ，涂布含100mg/mL氨苄青霉素LB固体平板。5）挑选克隆于1mLLB液体中培养4~5h，PCR检测阳性克隆并送测序。35 6）抽提插入目的基因pGEM-T载体质粒，相同两种酶切质粒与载体。组分体积（μL）质粒7.02+10×buffer（Mgplus）2.0限制性内切酶11.0限制性内切酶21.0ddH2O10.0反应总体积20.07）连接目的基因与载体组分体积（μL）2+2×highligasebuffer（Mgplus）7.5PCR产物（切胶纯化）6.0pGEM-Tvector1.5T4DNA连接酶1.0反应总体积15.08）转化大肠杆菌XL10Glod，涂布含100mg/mL氨苄青霉素LB固体平板。9）挑取单克隆，PCR扩增检测目的基因，鉴定为阳性克隆并送测序。10）Blast比对序列正确后，抽提质粒。3.3.4RSV编码蛋白互作研究3.3.4.1RSV编码蛋白互作1、构建酵母双杂交载体以RSV侵染的水稻cDNA为模板，用RSV蛋白基因特异引物扩增目的片段。经胶回收纯化目的片段，用限制性内切酶双酶切连有目的片段的pGEM-T载体，并用同样限制性内切酶双酶切酵母载体pGBKT7和pGADT7，目的片度分别与酵母载体连接（DNALigationKitver.2，16℃连接过夜），连接产物转化大肠杆菌36 DH5ɑ感受态细胞。筛选阳性克隆，进行PCR检测及测序鉴定。2、共转化酵母菌株Y2HGold（LiAc法适用于小量操作）挑取直径为2~3mm的Y2HGold单克隆至3mL液体YPD培养基中，用枪头将菌体打散，30℃，250rpm过夜培养；吸取1mL过夜培养菌液转接到10~15mL新配制的YPD液体培养基中，30℃，250rpm继续培养2~3h至OD600值为0.4~0.6；将菌液在室温下5000rpm离心5min。弃上清，用1×TE缓冲液或去离子水菌体（注意：菌体要重悬充分），再用1×TE/LiAc重悬菌体一次；最后向重悬菌体加入适量新配制的1×TE/LiAc中（感受态细胞应立即使用，否则置冰上2~3h内使用，不能长期保存。在1.5mL离心管中加入RSV编码蛋白的两个基因酵母载体（一个为pGBKT7载体重组质粒，一个为pGADT7重组质粒）各0.1μg，再依次加入20μL鲑精DNA（0.1mg）和100μL酵母感受态细胞，振荡混匀；再加入600μLPEG/LiAc溶液，高速振荡10s混匀；混合物置于30℃，250rpm振荡培养60min；取出加入70μLDMSO，轻轻颠倒混匀后，42℃水浴15min，冰上静置2min；室温8,000rpm离心5min后，弃上清，沉淀重悬于灭菌水中；将酵母均匀涂布于二缺（SD/-Trp/-Leu）固体平板上，30℃倒置培养2~3d菌落出现。3、蛋白互作验证挑取二缺平板（SD/-Trp/-Leu）上生长至直径为2~3mm的多个单克隆于1mL四缺液体培养基中震荡培养1~2d至菌液变混浊，将混浊液分别稀释成四个溶度-1-2-3梯度（原液、10、10、10），取5~10μL稀释液分别点样到预先画好格子的四缺固体培养基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal）上，培养3~5d观察显色情况，若长出蓝色菌落则两蛋白间存在相互作用，若没有菌落生长或菌落不显蓝，则两蛋白间不存在相互作用。3.3.5网络图谱的绘制NCBI上获得所有互作蛋白基因序列和氨基酸序列，将氨基酸序列输入到STRING软件中，分别获得与RSV各编码蛋白互作的子网络，然后再根据将所有蛋白输入到软件中，将各子网络通过互作蛋白连接形成复杂的网络图。网络图标注各蛋白的名称，再将RSV各编码蛋白间的互作关系绘制成网络图。37 第四章结果与讨论4.1构建RSV编码蛋白的酵母双杂交载体4.1.1引物设计根据已发表的RSV浙江分离物基因组全序列，设计RSV编码的7个蛋白引物（表4-1），用于诱饵载体pGBKT7的构建。由于RSV编码蛋白RdRp全长8760bp，不利于载体构建，所以根据保守结构域氨基酸的位置将RdRp分为5段，分别命名为RdRp-1、-2、-3、-4、-5。同时，根据相关文献，Pc2蛋白可能是裂解[34]为2个蛋白来发挥其功能，故根据其可能的裂解位点将其分为Pc2-C和Pc2-N。表4-1构建RSV编码蛋白12个诱饵载体所用引物Table4-1PrimersusedtoconstructtwelvebaitvectorsofRSVprotein引物名称核苷酸序列（5'-3'）限制性内切酶基因长度(bp)pGBKT7-RdRp1(+)GCATATGATGACGACACCACCTCTCGNdeI1446pGBKT7-RdRp1(-)GGGATCCTTACTCATAGATCTCAGCATTTGBamHIpGBKT7-RdRp2(+)GCATATGATGGAGATCTATGAGGCTGTTGNdeI1530pGBKT7-RdRp2(-)GGGATCCTTATAGCTCGGTGGCAAGATCBamHIpGBKT7-RdRp3(+)GGGATCCATATGGAAGGCTTTGTAABamHI2484pGBKT7-RdRp3(-)GCTGCAGTTACGTACGGCAATCCAAACPstIpGBKT7-RdRp4(+)GCATATGATGGTTTGGATTGCCTGTACGACNdeIpGBKT7-RdRp4(-)GGGATCCTTAAGTGTTCTCCTTCATTAGCTGBamHI1752pGBKT7-RdRp5(+)GGGATCCGTATGCAGCTAATGAAGGAGAACACBamHIpGBKT7-RdRp5(-)GCTCGAGTTATCAGAAATCGAACTTATGGTCTXholI1617pGBKT7-P4(+)GAATTCATGCAAGACGTACAAAGGACAGTEcoRI537pGBKT7-P4(-)GGATCCCTATGTCTTGTGTAGAAGAGGTTGBamHIpGBKT7-MP(+)GAATTCATGGCTTTGTCTCGACTTTTGTEcoRI861pGBKT7-MP(-)GGATCCCATGATGACAGAAACTTCAGATBamHI说明：部分载体由实验室保存。4.1.2构建RSV编码蛋白诱饵载体以感染RSV水稻cDNA为模板，用表4-1中的引物PCR扩增RSV各基因，获得与预期大小一致的目的片段（图4-1）。回收纯化各基因产物，与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5ɑ，PCR及测序验证后抽纯质粒，用表4-1中相应38 的限制性内切酶酶切并与同样酶切pGBKT7载体连接，转化大肠杆菌DH5ɑ后PCR检测后测序验证，获得RSV编码蛋白的部分诱饵载体质粒。分别为pGBKT7-RdRp1、pGBKT7-RdRp2、pGBKT7-RdRp3、pGBKT7-RdRp4、pGBKT7-RdRp5、pGBKT7-P4和pGBKT7-MP。图4-1PCR分段扩增RSVRdRp产物Fig4-1ThesegmentsofPCRproductofRdRpM:2kbPlusDNAladder;泳道1~5分别为RdRp-1、-2、-3、-4、-54.1.3诱饵质粒的自激活检测将构建的12个RSV诱饵载体质粒单独转化酵母Y2HGold细胞，将酵母菌体涂布到单缺（SD/-Trp）平板上培养2~3d，分别挑取平板上大于2mm的克隆于1mL单缺（SD/-Trp）液体培养基中震荡培养1~2d至菌液混浊。将混浊的菌-1-2-3液分别稀释成四个不同的浓度梯度（原液、10、10、10），各吸取10μL菌液点样到单缺（SD/-Trp/X-ɑ-gal）平板，放置于30℃培养箱中培养2~3d后，观察酵母菌落的生长及显色情况。结果发现所有诱饵蛋白均能在（SD/-Trp/X-ɑ-gal）平板上正常生长却不能显蓝（图4-2），说明所转化的酵母细胞没有表达ɑ-半乳糖苷酶不能分解X-ɑ-gal，即诱饵蛋白无自激活作用。因此，这些诱饵载体可以用于后续的筛库实验。39 图4-2RSV编码蛋白12个诱饵质粒自激活检测反应Fig4-2Self-activationresponseoftwelvebaitproteinsofRSV4.2水稻cDNA文库构建4.2.1水稻总RNA提取及LD-PR采用Trizol法提取健康日本晴水稻总RNA，用紫外分光光度计测定RNA的浓度，结果为OD230=0.088，OD260=0.187，OD280=0.100，OD260/OD280=1.86，OD260/OD230=2.12。可得RNA浓度为：0.187×40×500/1000=3.74μg/μL。经1.5%的甲醛变性胶电泳检测RNA质量，由OD260/OD230>2.0，说明RNA盐分已去除干净，而从RNA电泳图上可以看出，水稻总RNA的28S、18S、5S三条带清晰可见，没有出现弥散降解的条带（图4-3A），表明提取的水稻总RNA保持了较好的完整性，可以用于下游文库构建。水稻总RNA经逆转录合成水稻第一链cDNA后，以cDNA为模板进行25μL体系的梯度LD-PCR扩增，设置6个温度梯度（50~60℃），获得cDNA。PCR扩增完成后分别取5μL跑1.5%琼脂糖胶电泳检测质量（图4-3B）。从图上可以看出，双链cDNA呈弥散分布，大小主要集中于0.2~5.0kb之间，而在0.5~1.5kb间最亮，说明合成的双链cDNA质量较高，可以用于互作蛋白的筛选实验。由图4-3可以看出，水稻总RNA28S、18S、5S三条带清晰可见，没有出现弥散降解的条带；dscDNA分布在250~5000bp之间，弥散分布的条带亮度清晰，没有出现模糊不清的条带，说明mRNA包含的遗传信息比较完整，翻译水平上能表达更多蛋白。40 图4-3水稻TotalRNA以及dscDNA扩增产物Fig4-3TotalRNAofriceanddscDNAPCRproduct（A）甲醛变性胶检测RNA;泳道1、2、3均为总RNA。（B）LDPCR扩增dscDNA;M:2kbPlusDNAladder;泳道1~6为不同温度梯度;7~12为不同温度梯度;泳道13、14为相同温度4.2.2筛选与RSV编码蛋白互作的水稻蛋白依次用RSV编码蛋白的12个诱饵载体从水稻cDNA文库中筛选与之互作的寄主因子：分别将pGBKT7-R（R代表：RSV编码蛋白RdRp-1、-2、-3、-4、-5、P2、Pc2-C、Pc2-N、P3、CP、P4、MP）、pGADT7-Rec（Smal单切后的产物）、线性化的鲑鱼精DNA和水稻的双链cDNA共转化酵母Y2HGold感受态细胞，首先将转化产物涂布于SD/-Leu/-Trp/-His平板，30℃培养3~5d后，挑取所有直径≥1mm的单克隆到四缺（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）液体培养基中震荡培养3~5d，培养起来的菌液用3'和5'引物PCR扩增检测片段大小。选取PCR检测中插入片段大于300bp的克隆接种到四缺（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-gal）平板上，30℃培养3~5d，观察并统计酵母菌落的生长状况和颜色变化。将所有在四缺上正常生长且显蓝的候选阳性克隆扩大培养并抽纯质粒，转化大肠杆菌TransT1感受态细胞后送测序。结果如下：1）以RSVRdRp1为诱饵进行筛选，3'和5'PCRPrimer检测插入片段大小为600bp左右（图4-4A），四缺/X-ɑ-gal平板上正常生长且显蓝的有40个克隆（图4-4B）。抽纯质粒并转化大肠杆菌后测序，测序结果经Blast分析比对发现，其中6个是ORF发生移码，4个测序结果片段太小，无法比对，20个比对不到相应蛋白，另外10个克隆分别是如表4-2中所示的蛋白。由图4-4可以看出，PCR扩增检测到的阳性率比较高，阳性克隆片段的大小在300~800bp之间，说明文库的质量相对较好；阳性克隆于四缺板上出现深蓝色和淡蓝色菌落，深蓝色菌落占绝大多数，表明阳病毒蛋白与寄主蛋白互作机率41 比较高，RdRp1与寄主因子的互作比较丰富。图4-4PCR扩增检测阳性克隆以及候选阳性克隆在SD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-gal平板上的显色检测Fig4-4PCRdetectionofpositiveclonesandcoloreddetectionoftheputitivepositiveclonesontheSD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-galplate（A）PCR检测阳性克隆;M:Marker2000Plus;泳道1~24为不同克隆插入片段大小。（B）候选克隆不同显示结果;深蓝色且菌落密,互作较强;浅蓝色且菌落少,互作强弱由表4-2可以看出，RSVRdRp1蛋白与水稻寄主因子VAG1、PSAD2、olfactoryreceptor10AG1、oxidoreductase、dihydroororatedehydrogenase、membraneprotein、CysBfamilytranscriptionalregulator互作较强，而与其它寄主因子互作较弱。表4-2RSV编码蛋白RdRp1互作寄主因子筛选Table4-2ThescreeningofhostfactorsinteractwithRdRp1RdRp编号互作寄主因子RdRp编号互作寄主因子RdRp1-1serine-tRNAligaseRdRp1-11putativeacyl-(acylcarrierprotein)thioesteraseRdRp1-2olfactoryreceptorRdRp1-12glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseRdRp1-3(2Fe-2S)bindingproteinRdRp1-13proteinphosphatase2Ccontainingprotein,expressedRdRp1-4dihydroxyacidRdRp1-14nifU-likeprotein2,chloroplastic-likedehydrataseRdRp1-52-isopropylmalateRdRp1-15putativevacuolarATPsynthasesubunitG1(VAG1)synthaseRdRp1-6oxidoreductaseRdRp1-16photosystemIreactioncentersubunitII,chloroplastic-like(PSAD2)RdRp1-7ubiquitin-likeprotein5RdRp1-17dihydroorotatedehydrogenaseRdRp1-8membraneproteinRdRp1-18Os08g0560900[OryzasativaJaponicaGroup]RdRp1-9hypotheticalproteinRdRp1-19BindingproteindependenttransportersinnermembranecomponentRdRp1-10Os05g0126100RdRp1-20CysBfamilytranscriptionalregulator2）以RSVRdRp2为诱饵进行筛选，3'和5'PCRPrimer检测插入片段大小为700bp左右（图4-5A），四缺/X-ɑ-gal平板上正常生长且显蓝的克隆有69个42 （图4-5B）。抽纯质粒并转化大肠杆菌后测序，测序结果经Blast分析比对发现，其中10个是ORF发生移码，20个测序结果片段太小，无法比对，11个比对不到相应蛋白，另外28个克隆分别是如表4-3中所示的蛋白。由图4-5可以看出，PCR扩增检测到的阳性率很高，阳性克隆片段的大小在300~1000bp之间，说明文库的质量高；阳性克隆于四缺板上出现深蓝色和淡蓝色菌落，深蓝色菌落占绝大多数，表明病毒蛋白与寄主蛋白互作机率高，存在互作差异性，RdRp2与寄主因子的互作很丰富。图4-5PCR扩增检测阳性克隆以及候选阳性克隆在SD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-gal平板上的显色检测Fig4-5PCRdetectionofpositiveclonesandcoloreddetectionoftheputitivepositiveclonesontheSD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-galplate（A）PCR检测阳性克隆;M:Marker2000Plus;泳道1~24为不同克隆插入片段大小。（B）候选克隆不同显示结果,深蓝色且菌落密,互作较强;浅蓝色且菌落少,互作较弱由表4-3可以看出，RSVRdRp2蛋白与水稻寄主因子ClpS3、PLC3、RBCL、VAG1、RPS3、PK12、CP26、MAPK、PLNO2755-superfamily、putativeATP-dependentRNAhelicaseDDX4及putativenucleotidyltransferase互作均较强，与oxidoreductase、TonB-dependentreceptor、ferredoxin、hypotheticalchloroplastRF68、probablemethytransferaseTARBP1isoformX1等蛋白互作均较弱。43 表4-3RSV编码蛋白RdRp2互作寄主因子筛选Table4-3ThescreeningofhostfactorsinteractwithRdRp2RdRp编号互作寄主因子RdRp编号互作寄主因子RdRp2-1RdRp2-15ATP-dependentClpproteasestAR-relatedlipidtransferproteolyticsubunit,putative,expressed(ClpS3）RdRp2-2ribosomalproteinS3(RPS3)RdRp2-16phosphoinositide-specificphospholipaseCRdRp2-3putativeproteinkinaseRdRp2-17transcriptionfactorAP2D23-like(RAP2-7)RdRp2-4bindingprotein-dependentRdRp2-18ribulose-1,5bisphosphatecarboxylase/transpoterinnermembraneoxygenaselargesubunit(RBCL)comment(membraneprotein)RdRp2-5putativenucleotidyltransferaseRdRp2-19mitochondrialATPsynthase6kDasubunitRdRp2-6sulfatasehypotheticalproteinRdRp2-20mitogen-activatedproteinkinase(MAPK)RdRp2-73-oxoacyl-ACPsynthaseRdRp2-21hypotheticalchloroplastRF68RdRp2-8AraCfamilytranscriptionalRdRp2-22putativevacuolarATPsynthasesubunitregulatorG1(VAG1)RdRp2-9lightharvestingcomplexRdRp2-23putativeATP-dependentRNAhelicaseDDX4mesophyll7RdRp2-10hypotheticalproteinRdRp2-24PLNO2929(probableNADHkinase-like)PGTG-15202RdRp2-11tonb-dependentreceptorRdRp2-25probablemethyltransferaseTARBP1isoformRdRp2-12ferredoxinRdRp2-26hypotheticalproteinZEAMMB73(zeamays)RdRp2-13hypotheticalproteinRdRp2-27oxidoreductaseRdRp2-14PLNO2755-superfamilyRdRp2-28hypotheticalprotein(cysteineproteinase2)3）以RSVRdRp3为诱饵进行筛选，有2个菌落显蓝，初步判定这些菌落为候选阳性克隆；3'和5'PCRPrimer检测插入片段大小为600bp。4）以RSVRdRp5为诱饵进行筛选，3'和5'PCRPrimer检测插入片段大小为800bp左右（图4-6A），在四缺/X-ɑ-gal平板上正常生长且显蓝的有30个克隆（图4-6B）。抽纯质粒并转化大肠杆菌后测序，测序结果经Blast分析比对发现，其中6个是ORF发生移码，2个测序结果片段太小，无法比对，5个比对不到相应蛋白，另外17个克隆分别是如表4-4中所示的蛋白。由图4-6可以看出，PCR扩增检测到的阳性率一般，阳性克隆片段的大小在500~1000bp之间，说明文库的质量较好；阳性克隆于四缺板上出现深蓝色和淡蓝色菌落，深蓝色菌落占绝大多数，表明病毒蛋白与寄主蛋白互作机率比较高，存在互作差异性，RdRp5与寄主因子的互作一般。44 图4-6PCR扩增检测阳性克隆以及候选阳性克隆在SD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-gal平板上的显色检测Fig4-6PCRdetectionofpositiveclonesandcoloreddetectionoftheputitivepositiveclonesontheSD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-galplate（A）PCR检测阳性克隆;M:Marker2000Plus;泳道1~24为不同克隆插入片段大小。（B）候选克隆不同显示结果,深蓝色且菌落密,互作较强;浅蓝色且菌落少,互作较弱由表4-4可以看出，RSVRdRp5蛋白与水稻寄主因子RBCL、rpoC2、PPKase、HARBI1、GBP、elonginC、3-oxoacyl-ACP-synthase互作均较强，与其它寄主因子互作均较弱表4-4RSV编码蛋白RdRp5互作寄主因子筛选Table4-4ThescreeningofhostfactorsinteractwithRdRp5RdRp编号互作寄主因子RdRp编号互作寄主因子RdRp5-1amidase1-likeRdRp5-10beta-1,3-galactosyltransferase5RdRp5-2pupativenucleaseHARBl1-likeRdRp5-11Os11g0707700(HARBI1)RdRp5-3phosphoribulokinase,chloroplastic-RdRp5-12putativeGTP-bindingprotein,havinglike(PPKase)altemativesplicingproducts(GBP)RdRp5-4hypotheticalproteinOs1-19362RdRp5-13skp1-POZsuperfamily(elonginC)RdRp5-5dipeptidylcarboxypeptidaseIIRdRp5-14DDTsuperfamily(hypotheticalproteinOs1-19362)RdRp5-6proteinfraHRdRp5-15fimbrialproteinRdRp5-7acyl-coenzymedehydrogenaseRdRp5-16transposaseRdRp5-8ribulose-1,5bisphosphRdRp5-17putativeDNA-directedRNAatecarboxylase/oxygenasepolymerase'beta'subunitfamilyproteinlargesubunit(RBCL)(rpoC2)RdRp5-93-oxoacyl-ACP-synthase5）以RSVP2为诱饵进行筛选，3'和5'PCRPrimer检测插入片段大小为500bp左右（图4-7A），在四缺/X-ɑ-gal平板上正常生长且显蓝的有70个克隆（图4-7B）。抽纯质粒并转化大肠杆菌后测序，测序结果经Blast分析比对发现，其中10个是ORF发生移码，20个测序结果片段太小，无法比对，10个是同一个蛋白，20个比对不到相应蛋白，另外10个克隆分别是如表4-5中所示的蛋白。45 由图4-7可以看出，PCR扩增检测到的阳性率一般，阳性克隆片段的大小在400~800bp之间，说明文库的质量一般；阳性克隆于四缺板上出现深蓝色和淡蓝色菌落，深蓝色菌落不多，表明病毒蛋白与寄主蛋白互作机率偏低，存在互作差异性，P2与寄主因子的互作一般。图4-7PCR扩增检测以及阳性克隆候选阳性克隆在SD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-gal平板上的显色检测Fig4-7PCRdetectionofpositiveclonesandcoloreddetectionoftheputitivepositiveclonesontheSD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-galplate（A）PCR检测阳性克隆;M:Marker2000Plus;泳道1~24为不同克隆插入片段大小。（B）候选克隆不同显示结果,深蓝色且菌落密,互作较强;浅蓝色且菌落少,互作较弱由表4-5可以看出，RSVP2蛋白与水稻寄主因子AARPYL8、NADHDS3、RBCL、putativeubiquitinprotein2互作均较强，与其它寄主因子互作均较弱。表4-5RSV编码蛋白P2互作寄主因子筛选Table4-5ThescreeningofhostfactorsinteractwithP2P2编号互作寄主因子P2编号互作寄主因子P2-1abscisicacidreceptorPYL8-P2-6NADHdehydrogenasesublike(AARPYL8)unit3(NADHDS3)P2-2ubiquitindomain-containingP2-76-phosphogluconateproteinDSK2b-likeisoformdehydrogenase,decarboxylatingX1(DSK2b)P2-3glycosidehydrolasefamilyprotein47P2-8calcium-dependentproteinkinaseP2-4polyketidecyclaseP2-9putativeubiquitinprotein2P2-5glycosylhydrolasefamilyP2-10ribulose-1,5bisphosphatecarbox38protein,putative,expressed(IML)ylase/oxygenaselargesubunit6）以RSVP3为诱饵进行筛选，3'和5'PCRPrimer检测插入片段大小为550bp左右（图4-8A），在四缺/X-ɑ-gal平板上正常生长且显蓝的有22个克隆（图4-8B）。抽纯质粒并转化大肠杆菌后测序，测序结果经Blast分析比对发现，其中7个是ORF发生移码，3个测序结果片段太小，无法比对，另外12个克隆分别是如表4-6中所示的蛋白。46 由图4-8可以看出，PCR扩增检测到的阳性率较低，阳性克隆片段的大小在400~750bp之间，说明文库的质量一般；深蓝色菌落数较多，P3与寄主因子的互作一般，但可能与几个蛋白互作强烈。图4-8PCR扩增检测阳性克隆以及候选阳性克隆在SD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-gal平板上的显色检测Fig4-8PCRdetectionofpositiveclonesandcoloreddetectionoftheputitivepositiveclonesontheSD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-galplate（A）PCR检测阳性克隆;M:Marker2000Plus;泳道1~20为不同克隆插入片段大小。（B）候选克隆不同显示结果,深蓝色且菌落密,互作较强;浅蓝色且菌落少,互作较弱由表4-6可以看出，RSVP3蛋白与水稻寄主因子eIF4A、RBCL、amidophosphoribosyltransferase互作均较强，与其它寄主因子互作均较弱。表4-6RSV编码蛋白P3互作寄主因子筛选Table4-6ThescreeningofhostfactorsinteractwithP3P3编号互作寄主因子P3编号互作寄主因子P3-1OryzasativaeIF4A-1geneforeukaryoP3-7hypotheticalprotein(metalionticinitiationfactor4A2(eIF4A)bindingprotein,putative,expressed)P3-2HNHendonucleaseP3-8pre-mRNA-splicingfactorSLU7P3-3ribulose-1,5-bisphosphaP3-9growthhormonesecretagoguetecarboxylase/oxygenaselargereceptortype1isoformX2subunit(RBCL)P3-4amidophosphoribosyltransferaseP3-10hypotheticalproteinM569_00228P3-5OryzasativamRNAforputaP3-11glutaminetivephytosulfokinepeptideprecursorphosphoribosylpyrophosphate(psk4gene)amidotransferaseP3-6HMA(heavymetaltransport/P3-122-dehydro-3-deoxyglucosekinasedetoxificationsuperfamilyprotein)7）分别以RSVP4、MP为诱饵进行筛选，3'和5'PCRPrimer检测插入片段大小为600bp左右（图4-9A），四缺/X-ɑ-gal平板上正常生长且显蓝的有20个克隆（图4-9B）。抽纯质粒并转化大肠杆菌后测序，测序结果经Blast分析比对发现，其中5个是ORF发生移码，3个测序结果片段太小，无法比对，另外12个克隆分别是如表4-7中所示的蛋白。47 由图4-9可以看出，PCR扩增检测到的阳性率较高，阳性克隆片段大小在500~1000bp之间，说明文库的质量较高；显蓝色菌落数较多，P4、MP与寄主因子的互作机率高。图4-9PCR扩增检测阳性克隆以及候选阳性克隆在SD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-gal平板上的显色检测Fig4-9PCRdetectionofpositivecloneandcoloreddetectionoftheputitivepositiveclonesontheSD/-Leu/Trp/-His/-Ade/X-ɑ-galplate（A）候选克隆不同显示结果,深蓝色且菌落密,互作较强;浅蓝色且菌落少,互作较弱。（B）PCR检测阳性克隆;M:Marker2000Plus;泳道1~21为不同克隆插入片段大小由表4-7可以看出，RSVP4蛋白与水稻寄主因子PBP、CP26、3-oxoacyl-ACPsynthase互作均较强，与其它寄主因子互作均较弱；RSVMP蛋白与水稻寄主因子RBCL、splicingfactor3Bsubunit1-like，与其它寄主因子互作均较弱。表4-7RSV编码蛋白P4、MP互作寄主因子筛选Table4-7ThescreeningofhostfactorsinteractwithP4andMPP4编号互作寄主因子MP编号互作寄主因子P4-1AraCfamilytranscriptionalregulatorMP-1ribulose-1,5bisphosphatecarboxylase/oxygenaselargesubunit(RBCLl)P4-2putativepoly(A)bindingproteinMP-2putativeDNA-directedRNApolymerase'[OryzasativaJaponicaGroup]beta'subunitfamilyprotein(rpoC2)P4-3lightharvestingcomplexmesophyllMP-3NAD(P)H-quinoneoxidoreductasesubunit7(CP26)3,chloroplastic-like(NADHDS3)P4-43-oxoacyl-ACPsynthaseMP-4splicingfactor3Bsubunit1-likeP4-5membraneproteinMP-5prolineglycinebetainetransporterP4-6putativepoly(A)bindingprotMP-6glucosyltransferaseein[OryzasativaJaponicaGroup]4.3寄主因子与RSV编码蛋白的互作验证4.3.1YTHS验证水稻蛋白与RSV编码蛋白的互作4.3.1.1水稻蛋白全序列根据水稻全基因组核苷酸序列，将测序序列于NCBI上BLAST比对。结果48 表明，与RSV编码蛋白互作的水稻蛋白功能都比较重要，我们选取了10个同源性比较高、功能比较重要的蛋白进行研究。这10个蛋白分别命名为CP26、PPKase、PBP、NADHDS3、VAG1、AARPYL8、NADK3、PK12、FK12、PSAD2。于是根据已发表的水稻基因序列设计特异引物，分别从水稻基因组扩增这10个蛋白，获得全长基因序列（图4-10）。MPSAD2PBPCP26AARPYL8NADK3图4-10PCR扩增水稻基因产物Fig4-10PCRproductsofricegenes4.3.1.2构建完整ORF的水稻蛋白酵母载体根据10个蛋白全长序列，设计如下特异性引物，用于水稻蛋白的基因扩增（表4-8）。PCR扩增获得目的蛋白完整ORF，构建酵母双杂交猎物载体pGADT7-R（R分别代表10个水稻蛋白）。将RSV编码蛋白诱饵载体与水稻蛋白猎物载体共转化酵母菌株Y2HGold。49 表4-8构建水稻10个基因酵母双杂交载体所用引物Table4-8Primersusedtoconstructtwo-hybridvectorsoftengenesofrice引物名称核苷酸序列（5'-3'）限制性内切酶基因长度（bp）pGADT7-Os-NADHDS3(+)TGAATTCATGTTTCTGCTTCACGAATATGAEcoRI360pGADT7-Os-NADHDS3(-)CGGATCCAGACCATTCCAAGGCTCCTTTBamHIpGADT7-Os-AARPYL8(+)TGAATTCATGGTGGAGGTGGGAGGAGEcoRI612pGADT7-Os-AARPYL8(-)CGGATCCCCGGTCGAGGGGCTCGGTTBamHIpGADT7-Os-CP26(+)TGAATTCATGGCGGCGCTCGCCCCGTEcoRI477pGADT7-Os-CP26(-)CGGATCCCAGGCTGGGCGTCCTCTCGBamHIpGADT7-Os-PBP(+)TGAATTCATGGACGAGGAGGAGCACGAEcoRI636pGADT7-Os-PBP(-)CGGATCCAAAGTATGGCCTGTAGCGCATTBamHIpGADT7-Os-VAG1(+)TCATATGGATGCTAACAGACGCCAAGGNdeI327pGADT7-Os-VAG1(-)CGGATCCGTTCTTCACGGTGGTTACATGBamHIpGADT7-Os-PSAD2(+)TGAATTCATGGCCATGGCCACGCAAGCEcoRI609pGADT7-Os-PSAD2(-)CGGATCCGATGTCGAAGACGTTCTTGCCGBamHIpGADT7-Os-PK12(+)TGAATTCATGGAGGCGCAGTGGCTCGEcoRI1302pGADT7-Os-PK12(-)CGGATCCGTAACCACATCTTCTGTGGCATCBamHIpGADT7-Os-NADK3(+)TGAATTCATGGCGCTCCGCCGCGTGEcoRI975pGADT7-Os-NADK3(-)CGGATCCAGATCCCTGCTTTAACAGATTTTBamHIpGADT7-Os-PPKase(+)TCTCGAGCCTCCTGTTCCTTTCATAATCTGEcoRI1209pGADT7-Os-PPKase(-)CGAATTCATGGCGATCTCCAGCCTACABamHIpGADT7-Os-FK12(+)TCTCGAGATGGGCTTCGAGAAGACGATEcoRI339pGADT7-Os-FK12(-)CGAATTCTTACTGGGCGCTAAGAACCTBamHI4.3.1.3水稻蛋白与RSV编码蛋白的互作验证根据水稻文库筛选结果，获得的10个蛋白互作组合为，pGBKT7-P4/pGADT7-Os-CP26、pGBKT7-P4/pGADT7-Os-PBP、pGBKT7-MP/pGADT7-Os-NADHD3、pGBKT7-P2/pGADT7-Os-AARPYL8、pGBKT7-P2/pGADT7-Os-NADHDS3、pGBKT7-P2/pGADT7-Os-eIF4A、pGBKT7-RdRp1/pGADT7-Os-VAG1、pGBKT7-RdRp2/pGADT7-Os-VAG1、pGBKT7-RdRp2/pGADT7-Os-NADK3、pGBKT7-RdRp2/pGADT7-Os-PK12、pGBKT7-RdRp5/pGADT7-Os-PPKase、pGBKT7-CP/pGADT7-Os-FK12。抽提的诱饵与猎物载体质50 粒共转化酵母菌株Y2HGold，酵母菌体涂布于SD/Leu/-Trp平板上能正常生长，挑取多个克隆到1mLSD/Leu/-Trp液体培养基震荡培养1~2d，将菌液稀释成四-1-2-3个溶度梯度（原液、10、10、10），分别取10~15μL菌液点到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-gal平板相对应的格子内，30℃培养3~5d。第二天观察到pGBKT7-RdRp1/pGADT7-Os-VAG1及pGBKT7-RdRp2/pGADT7-Os-VAG1互作组合菌落生长且出现深蓝色，pGBKT7-P2/pGADT7-Os-AARPYL8、pGBKT7-MP/pGADT7-Os-NADHDS3、pGBKT7-RdRp1/pGADT7-Os-PSAD2、pGBKT7-RdRp5/pGADT7-Os-PPKase及pGBKT7-RdRp2/pGADT7-Os-PK12、pGBKT7-P2/pGADT7-Os-eIF4A互作组合第三天菌落生长且出现蓝色，而pGBKT7-P2/pGADT7-Os-NADHDS3与pGBKT7-P4/pGADT7-Os-PBP互作组合在第5d才出现蓝色（图4-11）。以上研究结果表明，YTHS文库筛选到的10个水稻蛋白均能与RSV编码蛋白互作。图4-11共转猎物蛋白阳性克隆和RSV诱饵蛋白质粒在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-gal平板上的显色检测Fig4-11Detectionofco-transformatesofputativecloneplasmidsandRSVbaitproteinofRSVinY2HGoldonSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-galplate4.3.2BiFC验证水稻蛋白与RSV编码蛋白的互作4.3.2.1BiFC载体构建根据获得的水稻蛋白全长序列，于茄科数据库中比对同源性较高的烟草序列，分别设计水稻及烟草特异性引物，用于其蛋白的基因序列扩增（表4-9）。51 PCR扩增获得目的蛋白完整ORF，将寄主蛋白构建到BiFC载体PCV-cYFP-R（R分别代表水稻及烟草蛋白），RSV病毒蛋白和Gus蛋白构建到BiFC载体PCV-R′-nYFP上（R′代表RSV编码蛋白，表4-10）。表4-9构建水稻和烟草基因BiFC载体所用引物Table4-9PrimersusedtoconstructBiFCvectorsofriceandtabacco引物名称核苷酸序列（5'-3'）基因长度（bp）cYFP-Os-NADHDS3(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGTTTCTGCTTCACGAATATGAT363cYFP-Os-NADHDS3(-)gAggAgAagAgCCgTCTTAAGACCATTCCAAGGCTCCTcYFP-Os-AARPYL8(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGTGGAGGTGGGAGGAGGA615cYFP-Os-AARPYL8(-)gAggAgAagAgCCgTCTCACCGGTCGAGGGGCTCcYFP-Os-CP26(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGCGGCGCTCGCCCC852cYFP-Os-CP26(-)gAggAgAagAgCCgTCTTACAGGCTGGGCGTCCTCTCGGcYFP-Os-PBP(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGACGAGGAGGAGCACGAGGT639cYFP-Os-PBP(-)gAggAgAagAgCCgTCTCAAAAGTATGGCCTGTAGCGCATTcYFP-Os-PSAD2(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGCCATGGCCACGCAA621cYFP-Os-PSAD2(-)gAggAgAagAgCCgTCCTAGATGTCGAAGACGTTCTTGCCGcYFP-Os-VAG1(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGATGCTAGTA333cYFP-Os-VAG1(-)gAggAgAagAgCCgTCTCAGTTCTTCACGGTGGTcYFP-NB-NADHDS3(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGTTTCTGCTTTACGAATATGATT363cYFP-NB-NADHDS3(-)gAggAgAagAgCCgTCCTAAGACCATTCCAATGCCCcYFP-NB-AARPYL8(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGAGCCCGAACGGATTCAGC609cYFP-NB-AARPYL8(-)gAggAgAagAgCCgTCCTAGTAGCCTTGAGGAAGCTTCATcYFP-NB-CP26(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGCTGCAGCTACCTCCCTCTA858cYFP-NB-CP26(-)gAggAgAagAgCCgTCTTACAAAGTGGGGGCTCTTTCAGCAcYFP-NB-PBP(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGAGCACCAGGAGAACGAATA685cYFP-NB-PBP(-)gAggAgAagAgCCgTCCTAAAATCCACTAGTATGGCCTGTAcYFP-NB-PSAD2(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGCCATGGCATCCCAAG645cYFP-NB-PSAD2(-)gAggAgAagAgCCgTCTTAAATATCATACACTTGTTTGCCcYFP-NB-VAG1(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGCATCTAG333cYFP-NB-VAG1(-)gAggAgAagAgCCgTCTTAGTTCTTCACTGTGGTTACGT52 表4-10构建RSV编码蛋白基因BiFC载体所用引物Table4-10PrimersusedtoconstructBiFCvectorsofRSVproteins引物名称核苷酸序列（5'-3'）基因长度（bp）RSV-NS-P2-nYFP(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGCATTACTCCTTTTCAAT600RSV-NS-P2-nYFP(-)gAggAgAagAgCCgTCgCATTAGAATAGGACACTCARSV-NS-P3-nYFP(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGAACGTGTTCAC636RSV-NS-P3-nYFP(-)gAggAgAagAgCCgTCgCAGCACAGCTGGAGARSV-NS-CP-nYFP(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGGTACCAACAAGCCA969RSV-NS-CP-nYFP(-)gAggAgAagAgCCgTCgGTCATCTGCACCTTCTGRSV-NS-P4-nYFP(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGCAAGACGTACAAAGGACAA537RSV-NS-P4-nYFP(-)gAggAgAagAgCCgTCgTGTTTTATGAAGAAGAGGTTGGRSV-NS-MP-nYFP(+)CgACgACAAgACCgTCACCATGGCTTTGTCTCGACTTTT861RSV-NS-MP-nYFP(-)gAggAgAagAgCCgTCgCATGATGACAGAAACTTCAGcYFP-RSV-MP(-)gAggAgAagAgCCgTCCTACATGATGACAGAAACTTCAGCgACgACAAgACCgTCACCATGTTACGTCCTGTAGAAAC1000Gus-NS-nYFP(+)Gus-NS-nYFP(-)gAggAgAagAgCCgTCgCGTAAGGGTAATGCGAGGTA4.3.2.2蛋白的互作验证根据水稻筛选结果，获得需要验证的互作组合为：P4-nYFP/cYFP-Os-CP26、P4-nYFP/cYFP-Os-PBP、RdRp1-nYFP/cYFP-Os-PSAD2、RdRp1-nYFP/cYFP-Os-VAG1、RdRp2-nYFP/cYFP-Os-VAG1、P2-nYFP/cYFP-Os-NADHDS3、P2-nYFP/cYFP-Os-AARPYL8、RdRp5-nYFP/cYFP-Os-PPKase、RdRp1-nYFP/cYFP-Os-L8、RdRp5-nYFP/cYFP-Os-L8以及烟草P4-nYFP/cYFP-NB-CP26、P4-nYFP/cYFP-NB-PBP、RdRp1-nYFP/cYFP-NB-PSAD2、RdRp1-nYFP/cYFP-NB-VAG1、RdRp2-nYFP/cYFP-NB-VAG1、P2-nYFP/cYFP-NB-NADHDS3、P2-nYFP/cYFP-NB-AARPYL8、RdRp5-nYFP/cYFP-NB-PPKase、RdRp1-nYFP/cYFP-NB-L8、RdRp5-nYFP/cYFP-NB-L8。以Gus-NS-nYFP和cYFP-Gus为对照。抽纯质粒转化农杆菌EHA105，农杆菌浸润法注射烟草，48~72h后于共聚焦显微镜下观察黄色荧光情况（图4-12）。53 P4-nYFPGus-nYFPP4-nYFPcYFP-OsCP26cYFP-OsCP26cYFP-GusP4-nYFPGus-nYFPP4-nYFPcYFP-NBCP26cYFP-NBCP26cYFP-GusRd1-nYFPGus-nYFPRd1-nYFPcYFP-OsPSAD2cYFP-OsPSAD2cYFP-GusRd1-nYFPGus-nYFPRd1-nYFPcYFP-NBPSAD2cYFP-NBPSAD2cYFP-GusRd1-nYFPGus-nYFPRd1-nYFPcYFP-OsVAG1cYFP-OsVAG1cYFP-Gus54 Rd2-nYFPGus-nYFPRd2-nYFPcYFP-OsVAG1cYFP-OsVAG1cYFP-GusP2-nYFPGus-nYFPP2-nYFPcYFP-OsS3cYFP-OsS3cYFP-GusP2-nYFPGus-nYFPP2-nYFPcYFP-NBS3cYFP-NBS3cYFP-GusP2-nYFPGus-nYFPP2-nYFPcYFP-OsL8cYFP-OsL8cYFP-GusP2-nYFPGus-nYFPP2-nYFPcYFP-NBL8cYFP-NBL8cYFP-Gus55 P4-nYFPGus-nYFPP4-nYFPcYFP-OsPBPcYFP-OsPBPcYFP-GusP4-nYFPGus-nYFPP4-nYFPcYFP-NBPBPcYFP-NBPBPcYFP-GusRd5-nYFPGus-nYFPRd5-nYFPcYFP-OsPPkasecYFP-OsPPkasecYFP-GusRd1-nYFPGus-nYFPRd1-nYFPcYFP-Rd1cYFP-Rd1cYFP-GusRd1-nYFPGus-nYFPRd1-nYFPcYFP-MPcYFP-MPcYFP-Gus56 P2-nYFPGus-nYFPP2-nYFPcYFP-Rd1cYFP-Rd1cYFP-Gus图4-12水稻及烟草蛋白都可与RSV编码蛋白互作Fig4-12BothriceandtabaccoproteinscaninteractwithRSVproteins图中Gus作为对照,比例尺大小:25μm57 4.4RSV编码蛋白之间的互作研究4.4.1YTHS研究RSV编码蛋白之间的互作4.4.1.1引物设计RSV编码蛋白12个诱饵载体pGBKT7-R（R分别代表：RdRp-1、-2、-3、-4、-5、P2、Pc2-C、Pc2-N、P3、CP、P4与MP）构建已于第三章所述。根据3.1中构建好的诱饵载体质粒序列及酵母载体pGADT7，设计如下12对RSV猎物蛋白引物（表4-11）。同样将RSV编码蛋白RdRp分为5段构建，分别命名为RdRp-1、-2、-3、-4、-5，RSV编码蛋白P2分两段构建，命名为Pc2-C和Pc2-N。表4-11酵母双杂交载体中RSV10个基因的引物Table4-11TenprimersofRSVusedintwo-hybridvectors引物名称核苷酸序列（5'-3'）限制性内切酶基因长度（bp）pGBKT7-RdRp1(+)GCATATGATGACGACACCACCTCTCGNdeI1446pGBKT7-RdRp1(-)GGGATCCTTACTCATAGATCTCAGCATTTGBamHIpGBKT7-RdRp2(-)GGGATCCTTATAGCTCGGTGGCAAGATCBamHI1530pGBKT7-RdRp2(-)GGGATCCTTATAGCTCGGTGGCAAGATCBamHIpGBKT7-RdRp3(+)GGGATCCATATGGAAGGCTTTGTAABamHI2484pGBKT7-RdRp3(-)GCTCGAGTTACGTACAGGCAATCCAAACXholIpGBKT7-RdRp4(+)GCATATGATGGTTTGGATTGCCTGTACGACNdeIpGBKT7-RdRp4(-)GGGATCCTTAAGTGTTCTCCTTCATTAGCTGBamHI1752pGBKT7-RdRp5(+)GGGATCCGTATGCAGCTAATGAAGGAGAACACBamHIpGBKT7-RdRp5(-)GCTCGAGTTATCAGAAATCGAACTTATGGTCTXholI1617pGBKT7-P4(+)GAATTCATGCAAGACGTACAAAGGACAGTEcoRI537pGBKT7-P4(-)GGATCCCTATGTCTTGTGTAGAAGAGGTTGBamHIpGBKT7-MP(+)GAATTCATGGCTTTGTCTCGACTTTTGTEcoRI861pGBKT7-MP(-)GGATCCCATGATGACAGAAACTTCAGATBamHI4.4.1.2构建RSV编码蛋白酵母AD质粒分别以3.1中构建好的RSV编码蛋白12个诱饵载体质粒为模板，用表4-11中的引物PCR扩增12个基因片段，大小与目标序列一致。经切胶纯化获得各基因片段产物，12个基因产物连接pGEM-T载体，转化大肠杆菌XL-10Gold菌株，58 经PCR检测及测序鉴定正确后抽提质粒。分别用表4-11中的酶酶切目的片度及酵母载体pGADT7，酶切产物与载体回收片段连接，转化大肠杆菌经PCR检测及测序验证正确后抽提质粒，获得RSV编码蛋白的12个酵母载体，分别为pGADT7-RdRp1、pGADT7-RdRp2、pGADT7-RdRp3、pGADT7-RdRp4、pGADT7-RdRp5、pGADT7-P2、pGADT7-Pc2-C、pGADT7-Pc2-N、pGADT7-P3、pGADT7-CP、pGADT7-P4与pGADT7-MP。4.4.2采用YTHS研究RSV蛋白互作为了全面系统的了解RSV编码蛋白自身及蛋白之间是否存在互作，我们开展了对RSV编码蛋白可能存在的互作研究。分别用构建的12个诱饵质粒与载体质粒进行互作研究。总共包含12个蛋白自身互作组合及156个蛋白之间互作组合。结果发现在12个蛋白自身互作组合中，pGBKT7-RdRp2/pGADT7-RdRp2、pGBKT7-RdRp3/pGADT7-RdRp3、pGBDT7-RdRp5/pGADT7-RdRp5、pGBKT7-P2/pGADT7-P2、pGBKT7-Pc2-C/pGADT7-Pc2-C、pGBKT7-CP/pGADT7-CP及pGBKT7-MP/pGADT7-MP组合均能在SD/Leu/-Trp平板上生长，挑取菌落到SD/Leu/-Trp液体培养基中震荡培养1~2d后，分别将菌液稀释成四个不同浓度-1-2-3梯度（原液、10、10、10），吸取10~15μL菌液点到相应格子的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-gal平板上，培养3~5d后均能显蓝色（图4-13）。而156个蛋白间互作组合中，pGBKT7-RdRp2/pGADT7-RdRp2、pGBKT7-RdRp3/pGADT7-RdRp3、pGBDT7-RdRp5/pGADT7-RdRp5、pGBKT7-P2/pGADT7-P2、pGBKT7-Pc2-C/pGADT7-Pc2-C、pGBKT7-CP/pGADT7-CP及pGBKT7-MP/pGADT7-MP也均能观察到蓝色菌落出现（图4-13）。以上互作组合实验均重复2次。59 图4-13RSV蛋白间互作组合在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-gal平板上的显色检测Fig4-13Detectionprotein-proteininteractionofRSVontheSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-ɑ-galplate4.5绘制RSV互作网络图4.5.1RSV编码蛋白间互作图谱的建立根据4.1.3研究结果，RSV编码蛋白的12个酵母载体验证的168个互作组合进行汇总，168个组合中有28个组合存在互作。将其构建成互作图谱（表4-12）。60 表4-12RSV编码蛋白的互作Table4-12Protein-proteininteractionsamongtheproteinscodedbyRSVGAL4-ADGAL4-BDRdRp1RdRp2RdRp3RdRp4RdRp5P2Pc2CPc2NP3CPP4MPRdRp1+++****+++****RdRp2*++++++RdRp3*+++RdRp4*RdRp5*+++P2++++++++++++++++:Pc2C++++++Pc2N*P3*+++CP+++P4MP+++++,菌液稀释1000倍液后在SD/-Trp/-Leu/-Ade/–His/X-α-gal平板上仍出现菌落且在2d内显蓝色；++,菌液稀释100倍液后在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal平板上生长且在3d内显蓝色；+,菌液稀释10倍液后在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal平板上生长且5d内显蓝色61 4.5.2RSV编码蛋白与水稻蛋白互作图谱的建立根据4.1.3.1研究结果，获得RSV编码蛋白与水稻部分蛋白的互作情况，构建病毒-寄主蛋白互作图谱（表4-13）。表4-13RSV编码蛋与寄主蛋白的互作Table4-13Protein-proteininteractionsbetweentheviralproteinsofRSVandriceGAL4-ADGAL4-BDVAG1PSAD2eIF4ANADK3PK12PPKaseL8FK12S3PBPCP26RdRp1++++++*******+++RdRp2+++++++RdRp3*RdRp4*RdRp5*+++P2+++++++++:Pc2-CPc2-NP3++CP++P4+++++MP++++,菌液稀释1000倍液后在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal平板上仍出现菌落且在2d内显蓝色；++,菌液稀释100倍液后在SD/-Trp/-Leu/-Ade/–His/X-α-gal平板上生长且在3d内显蓝色；+,菌液稀释10倍液后在SD/-Trp/-Leu/-Ade/–His/X-α-gal平板上生长且5d内显蓝色4.5.3RSV互作网络图谱的绘制由图4-15可以看出，RSV病毒蛋白与寄主蛋白存在很频繁的互作，这种病毒-寄主相互作用关系对病毒通常是有利的，可能有利于病毒粒子的复制、侵染、扩散；但对于寄主而言，往往是有害的；可能影响寄主的正常生命活动，寄主某个蛋白的表达或抑制都会表现出不同的症状，寄主生命活动也因此受到影响。62 图4-15水稻条纹病毒蛋白-蛋白相互作用网络Fig4-15Protein-proteininteractionnetworkofthericestripevirus红色代表RSV编码蛋白-蛋白间相互作用,浅绿色代表病毒-寄主蛋白间相互作用,曲线代表RSV蛋白自身互作4.6讨论采用YTHS技术研究RSV与水稻寄主间的互作关系，并筛选出多个与水稻代谢、光合作用、光呼吸等密切相关的蛋白。其中，我们发现YTHS和BiFC研究表明，RdRp5与PPKase有强烈互作。研究表明，PPKase是卡尔文循环碳同化吸收过程的一个关键酶。在光合生物体中，PPKase的表达受分子开关蛋白CP12[54]的调控，拟南芥中存在3个不同的CP12。CP12在光照条件下被氧化释放出卡尔循环途径中两个关键的酶—GAPDH和PPKase。GAPDH是糖酵解、糖异生和卡尔文循环途径中重要的酶，催化甘油醛-3-磷酸形成1,3-二磷酸甘油酸的可逆反应。研究表明，水稻GAPDH与RSVP3互作，RSVP3蛋白与GAPDH互作可能干扰GAPDH四聚体的形成，从而干扰细胞的能量代谢，影响糖酵解途径。GAPDH不同的细胞定位，使其参与多种生命活动。当GAPDH定位于核内，参与调节基因转录、介导RNA的核质运输等。GAPDH分布于植物细胞质中，而[40,55]两者的互作后，可定位到细胞核内，参与了多个基因的转录调控。我们的研究结果表明，RSVRdRp通过于PPKase互作，间接干扰GAPDH四聚体形成，从而影响了植物寄主多种生命活动的转录调控。63 Rubisco是植物光合作用过程中CO2固定的关键酶，具有加氧与羧化双重功[56,57]能，该酶主要分布于植物叶绿体等细胞器中。在光合作用C3途径中，Rubisco催化CO2与1,5-二磷酸核酮糖（ribulose-1,5-bisphosphate,RuBP）反应形成3-磷酸甘油醛；同时，在光呼吸作用中，催化RuBP与O2反应生成磷酸核酮糖、[57-60]磷酸乙醇酸和磷酸。因此，Rubisco可以调节光呼吸过程和光合作用来决定[61,62]植物的净光合量，从而决定植物生长与发育。本研究采用YTHS筛选到RSVRdRp-1、-2、-3、-5、P2、P3、P4及MP均能与RBCL互作，表明RSV多种编码蛋白可以与RBCL共同作用来影响植物的光合作用。林林等研究发现RBCL可以与胡葱黄条病毒（shallotyellowstripevirus,SYSV）和大豆花叶病毒（soybeanmosaicvirus,SMV）的大部分蛋白互作，这研究证实病毒蛋白可与植物RBCL存[53]在互作。本研究采用YTHS研究RSV编码蛋白的互作，发现RSVP3、P4未检测到[63]自身互作的存在。牛晓庆等采用YTHS研究发现P3不能自身互作。但Lian等采用YTHS发现P3自身互作，P4不存在自身互作，采用BiFC发现P3、P4[64]均存在自身互作，推测原因与YTHS载体、酵母表达菌株的选择不同有关。Du等采用YTHS技术发现P2可与一个与拟南芥Arabidopsisthalianasuppressorofgenesilencing3(AtSGS3)高度同源的水稻蛋白互作，并证明P2是一个沉默抑制[16]子。本研究筛选到多个能与P2互作的蛋白（表4-5），但我们没有筛选到与水稻沉默抑制相关的蛋白，可能是试验所用cDNA文库不同造成的。通过本研究所绘制的互作网络图，P2可与多个RSV蛋白互作，提示P2与多种功能有关。前人研究表明，P2蛋白可形成胞间连丝状的管状结构，与病毒的细胞间运动有[29]关，可能参与协助RSV完成复制和侵染。这些研究也正好印证了我们认为P2是一个互作蛋白多、网络构成关系复杂的蛋白的认识。64 第五章结论5.1结论本研究以RSV编码蛋白为诱饵，通过酵母双杂交从水稻cDNA文库筛选互作寄主因子。筛选结果表明，RSV编码蛋白能与多个寄主因子互作，其中RdRp能与多种重要寄主蛋白互作，如：PPKase、VAG1、CP26。其次，病毒的多种蛋白可与同一个寄主蛋白互作，如：RSVRdRp-1、-2、-3、-5、P2、P3、P4以及MP均与RBCL互作，P2、MP均与NADHDS3互作。BiFC试验表明，RdRp-1与PSAD2、VAG1互作；RdRp-2与VAG1、NADK3互作；RdRp-5与PPKase互作；P2与AARPYL8、翻译起始因子4A（eukaryoticinitiationfactor4A2,4A）互作。YTHS试验表明，RSVRdRp-1、-2、-3、-5、Pc2C、CP、MP均存在自身互作；P2能与RdRp-1、-2、-4、-5、P3、P4、Pc2C和MP互作。5.2主要创新点首次对RSV编码蛋白进行全面、系统互作研究，绘制一张RSV蛋白互作网络图谱，为研究RSV蛋白功能提供依据。5.3不足之处由于YTHS技术存在一定的假阳性，还需要利用BiFC、Co-IP等方法验证结果。由于互作研究工作量大、试验周期较长，目前BiFC、Co-IP验证结果尚未系统完成。65 致谢时光流逝，一转眼三年的研究生涯就要结束。从最初对科学研究的敬仰之情到满腔热情的投入科学实验的历程中，觉得自己这一路走来收获很多，也成长许多。更幸运的是在艰难的抉择后，自己有幸在浙江省农业科学院病毒与生物技术研究所完成硕士论文。在这三年的时光里留下了很多难忘的回忆，有太多的感谢要表达，有太多的人要感谢。至此，写下我对您们深深的感谢之情。首先，感谢我的导师陈卓教授。从一开始对老师您的不了解到老师您给以的无私帮助，感触到老师您对科学的热爱与执着，以及对科研工作的严谨态度。老师您平易近人的品质和谆谆的教诲让我受益匪浅。衷心地感谢我的导师给以我提供一个到浙江省农业科学院学习的机会，让我有幸从事自己喜欢的研究。其次，感谢林林副研究员这两年来一直对我实验的悉心指导与谆谆的教诲。从初学到跟学至会学无不凝聚着老师您的心血。在老师您日积月累的指导下，学生的我才得以成长。感谢燕飞研究员对我实验的设计，在老师的耐心教导下，论文得以顺利开展。老师您渊博的知识、科学的素养以及专注的科学品质深深地影响着我。感谢陈剑平研究员和宋宝安教授给我提供一个科研的大舞台，让我有一个良好的成长环境以及对我工作上的教导和生活上的帮助。也衷心地感谢薛伟教授和杨松教授给以我无私的帮助。最后，感谢实验室鲁宇文老师、赵晋平老师对我实验内容上的指导与帮助，感谢实验室郑红英老师、彭杰军老师、王琴阿姨对我的帮助。感谢实验室师兄师姐对我的帮助与陪伴，特别感谢我的同学吕浩一直以来对我的关心与帮助。感谢胡德禹教授、金林红教授、柳立伟老师等精化中心全体老师对我学业和生活上的帮助；感谢博士王贞超师姐和俞露师姐，硕士于丹丹师姐、尹娟师姐和郭勤师姐对我的关心与帮助；感谢同级的所有同学对我的关系与帮助；感谢我的家人对我的支持与鼓励，谢谢您们！真诚的感谢参加本论文评阅、评议及答辩委员会的各位老师！谢谢你们提出宝贵的意见和建议！66 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附录1.课题来源[1]公益性行业（农业）科研专项(201003031)：灰飞虱传播的病毒病综合防控技术研究与示范.[2]国家自然科学基金项目(31360446)：杀虫剂胁迫下白背飞虱与南方水稻黑条矮缩病毒互作的行为机制与分子机理.2.硕士期间发表文章[1]Chen,Z.;Chen,B.H.;Guo,Q.;Shi,Li.;He,M.;Qin,Z.Y.;Li,L.H.;He,P.;Wang,Z.C.;Hu,D.Y.;Yang,S.Atime-courseproteomicanalysisofricetriggeredbyplantactivatorBTH[J].Journalofplantgrowthregulation,2015,34(2):392-409.[2]Chen,Z.;Guo,Q.;Chen,B.H.;Li,X.Y.;Wang,Z.C.;He,P.;Yan,F.;Hu,D.Y.;Yang,S.Developmentofproteomictechnologyofshotgunandlabelfreecombinedwithmultiplereactionmonitoringtosimultaneouslydetectsouthernriceblack-streakeddwarfvirusandriceraggedstuntvirus[J].Virusdisease,2014,25(3):322-330.73 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：日期：年月74