zebularine对绵羊卵丘细胞及其核移植胚胎发育效果的影响研究

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文Zebularine对绵羊卵丘细胞及其核移植胚胎发育效果的影响研究学位申请人：苏文龙指导教师：李俊杰教授学科专业：动物遗传育种与繁殖学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二•一五年五月三十日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研艽成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不句.食为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所

2、做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表不谢意。学位论文作者签名：省令/l^签字日期=年〈月In学位论文版权使用授权书卞学位沁寸怍老尝仝了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。太人捋权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：免AJL导师签仏T^/6月7签字R期：年月I曰签字円期：如/《年学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：分

3、类号：S814.8单位代码：10086密级：公开学号：2012336Zebularine对绵羊卵丘细胞及其核移植胚胎发育效果的影响研究StudyontheEffectofZebularineonCumulusCellsandDevelopmentofSomaticCellNuclearTansferEmbryos学位申请人：苏文龙指导教师：李俊杰教授学科专业：动物遗传育种与繁殖学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月三十日试验所属项目及资金来源本研究由河北省自然科学基金项目（C2014204119）和河北省高等学校科学技术研

4、究重点项目（ZD2014002）项目资助。摘要体细胞核移植技术在生物学、医学等多个研究领域具有越来越重要的意义，但核移植效率低限制了其发展。目前研究人员普遍认为，核移植效率低主要是由于供体细胞核在卵母细胞中的重编程不完全造成的。而供体细胞DNA甲基化重编程异常是主要原因之一。本研究以绵羊卵丘细胞为供体细胞，拟通过添加DNA甲基转移酶抑制剂Zebularine，探讨其对绵羊卵丘细胞生物学特性、核移植重构胚发育及对胚胎甲基化水平的影响，尝试建立一种既不影响体细胞生物学特性，又可降低供体细胞细胞核的甲基化状态方法，从而提供一种提高体细胞核移植效率的有效途

5、径。试验中使用不同浓度（0、2.5、5、10nmol/L）的Zebularine处理绵羊卵丘细胞12h，研究不同处理对绵羊卵丘细胞的存活率、染色体倍性、细胞周期、DNA甲基化水平、DNMT1基因表达水平、核移植胚胎发育能力的影响。同时，使用间接免疫荧光染色法检测了5nmol/LZebularine处理绵羊卵丘细胞12h后对核移植胚胎不同发育时期DNA甲基化水平的影响。结果显示：（1）经甲基转移酶抑制剂Zebularine（2.5-10nmol/L）处理后的卵丘细胞存活率与未经过处理的对照组相比没有显著差异（P>0.05）；（2）采用常规染色体核型分

6、析发现，不同浓度Zebularine处理组与对照组的细胞染色体整二倍体比例（96.11%、96.53%、95.13%、96.77%）均没有显著差异（P>0.05）；（3）通过流式细胞仪检测细胞周期，结果显示：绵羊卵丘细胞经不同浓度Zebularine处理12h后，G0/G1的细胞比例呈逐渐上升趋势，S期细胞比例均呈逐渐下降的趋势，但与对照组之间均没有显著差异（P>0.05）；（4）使用间接免疫荧光染色法检测DNA甲基化水平，卵丘细胞DNA甲基化水平随着Zebularine处理浓度的升高而降低，其中5、10nmol/L处理组DNA甲基化水平显著显著低

7、于对照组（P<0.05），但两处理组间没有显著差异（P>0.05）；（5）通过实时荧光定量PCR检测发现：卵丘中Dnmt1基因表达水平随着Zebularine处理浓度的升高而降低，其中5、10nmol/L处理组Dnmt1基因表达水平显著低于对照组（P<0.05），且10nmol/L处理组显著低于5nmol/L处理组（P<0.05）；（6）绵羊卵丘细胞经不同浓度Zebularine处理12h后进行核移植，结果显示：Zebularine各处理组与对照组（0nmol/L）间核移植胚胎的卵裂率差异均不显著（P>0.05）；5nmol/LZebularine

8、处理组桑椹胚率显著高于对照组（P<0.05），与其他各组间差异不显著（P>0.05）。5nmol/LZebularine处