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1、动物医学进展.2005,26(7):64-68ProgressinVeterinaryMedicine猪卵丘细胞核移植研究项智锋I,谢红兵I,张金洲王清华I,张德福2・（1•河南科技学院动科系，河南新乡453OO3M.上海农业科学院畜牧研究所，上海201106）中BB分类号：S813.2文Itt标识码：A文章第号:1007-5038(2005)07-0064-05播要：以卵丘细胞为供核体细胞，采用胞质内注射法进行猪体细胞核移植，对去核、激活•和培养等关键技术过程进行研究，结果表明，①点压法、挤压法对卵母细胞去核率明显高于盲吸法（三者分别为62.5%,64.6%,50.7%,
2、PV0.05）。盲吸法去核染色体容易发生位置偏离，彩响去核效果，但对早成熟的卵母细胞（36h〜44h）进行去核可明显提高去核效率（PV0・05）,在成熟培养36h〜38h、39h〜41h、42h〜44h去核率分别为60・9%、67.8%、64・3%,而45h〜48h为4&4%。②体细胞预激活有助于提高核移胚卵裂率（2&0%,20.1%,PV0・05）。A23187（Ca2+ionophore,钙离子栽体）单独或与6-DMAP（6-Dimethylaminopurine,6-二甲基氨基喋冷）联合作用能使猪体细胞核移胚激活继续发育。③核移胚以胚胎培养液“。SU-23（North
3、CarolinaStateUniversity-23medium,北卡洲立大学培养液-23）及卵丘颗粒单层共培养体系进行分别培养，核移胚卵裂率无明显差异（30.06%,31.5%,P>0.05）。但NCSU23培养4细胞后发育能力更高（13.5%,3.9%,P<0.05）o关键词：核移植；体细胞；去核；激活哺乳动物体细胞核移植技术是目前生物技术研究的热点之一，核移植为畜牧业及转基因动物生产带来广阔的应用前景，目前已在牛、猪和山羊等家畜获得了体细胞核移植后代。与牛、山羊、绵羊等家畜相比，猪体细胞核移植因为种属特异性研究困难最大。仅有的几例报道中，成功率也相对较低，说明许多环节
4、需要继续研究，而转基因猪用于异种移植解决人类移植器宫供求矛盾，使克隆猪较其他克隆物种具有特别的意义。对奶牛、小鼠和山羊的研究表明，以卵丘细胞作为核供体所组成的重构胚比成纤维细胞重构胚有更高的卵裂率和囊胚发育率。本文以卵丘细胞为供核体细胞，采用胞质内注射法进行猪体细胞核移植，对其中一些技术环节如去核、激活和培养等过程的相关作用和影响因素进行研究。但核移植技术是一项复杂的技术,核移植的总体效率低，这与核移植技术环节的复杂性（包括受体细胞培养、去核、激活、供体细胞选择、注核、重构胚培养发育）与目前对重构胚重编程机理及核质互作的详细机制了解不够相关。1材料与方法1.1受体卵母细胞的
5、雇备取屠宰场屠宰的猪卵巢，注射器采集卵巢表面直径为2mm~6mm卵泡内容物，体视显微镜下检取卵丘~卵母细胞复合体（Complexofoocte-cumu-lus,COCs）,39€、体积分数为5%CO?和憾和湿度下体外成熟培养(培养液:TCM199+100mL/LNCS十10%猪卵泡液+10IU/mLPMSG+10IU/mLhCG+0・57mmol/LL-Cys+200单位/mL青链番素+lmg/LE2)获得MU期卵母细胞。挑选排出第一极体或一侧卵周隙扩大的卵母细胞移到含5Mg/mL细胞松弛素B的TCM199+100mL/NCS中，37"C温育15min,将含有卵母细胞的凹
6、玻片放在显微操作系统（Leitz）的载物台上。调节显微操作仪的操作杆，使固定管和尖瑞去核管与卵母细胞处于同一平面上。1.2去核挑选体外培养成熟36h〜48h卵母细胞，以下面3种方法在Leica显微操作系统上进行去核操作。收稿日期:2005-01-04墓金项目：河南科技学院青年基金项目作者介：項智锋（1978-）,M,湖北黄冈人，硕士•讲殍，主矣从丰动竹胚胎工程的研丸•*am作者方法1为盲吸法.用固定管固定卵母细胞，使第一极体位于固定管的对侧，用直径25“n〜35Mm的去核针尖端顶穿透明带，在第一极体附近吸取第一极体及其下方胞质。去核后再用10pg/mLHoe-hchst33
7、342染色10min,于荧光显微镜下观察去核率。方法2为挤压法。用固定管固定卵母细胞，使第一极体位于固定管的上方或下方(即时钟的12点或6点处)。将拉针仪上未经断口的玻璃针尖端在第一极体两侧1/5〜1/4卵周长处挑开透明带并在固定管上轻摩，在透明带上形成1/5〜1/4卵周长的切口。然后用钝端辅助去核管在透明带切口的斜下方轻挤卵母细胞，使第一极体连同其附近的1/4〜1/3胞质溢出透明带，去核后再用10Mg/mLHoce-hest33342染色10min,于荧光显微镜下观察去核率。方法3为点压法。用固定管固定卵母细胞，
