mrtf-a对大鼠脑缺血再灌注诱导神经细胞凋亡的影响及机制研究

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1、ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterinScienceTheeffectandmechanismofMRTF-Aonneuronalapoptosisinducedbycerebralischemia/reperfusioninratsMasterCandidate：JingDuMajor：BiologySupervisor：Prof.XiaminHuWuhanUniversityofScienc

2、eandTechnologyWuhan,Hubei430081,P.R.China2015.05.20摘要目的：在整体动物水平，研究MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注（MCAO/R）诱导神经细胞凋亡的影响及其机制。方法：1、慢病毒介导的MRTF-A（LV-MRTF-A）在大鼠脑皮层中表达的分布及时间相关性的研究：①30只SPF级SD大鼠随机分为5组，以注射阴性慢病毒（NEG-LV）为对照组，其余4组分别脑室注射LV-MRTF-A1μl、2μl、4μl、5μl，于第5d取全脑做石蜡切片，用激光共聚焦显微镜观察MRTF-A表

3、达；②取脑室注射4μlLV-MRTF-A5d的脑组织，激光共聚焦显微镜观察大鼠脑皮层不同部位MRTF-A表达；③36只SPF级SD大鼠随机分为6组，脑室注射LV-MRTF-A后，分别于1d、3d、5d、7d、9d取全脑组织做石蜡切片，激光共聚焦显微镜观察各组脑皮层中MRTF-A表达。2、MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注诱导的神经细胞凋亡的影响：84只SPF级SD大鼠随机分成3组：对照组、模型组、实验组。对照组与模型组分别脑室注射4μlNEG-LV；实验组脑室注射4μlLV-MRTF-A。脑室注射4天后，实验组与模型组分

4、别构建缺血再灌注模型（MCAO2h/R24h、MCAO2h/R48h、MCAO2h/R72h），用Longa’s法进行神经功能评分；用TTC染色评价脑梗塞体积；用TUNEL法检测细胞凋亡率。3、MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注诱导神经细胞凋亡作用机制：54只SPF级SD大鼠随机分成3组：对照组、模型组、实验组。对照组与模型组分别脑室注射4μlNEG-LV；实验组脑室注射4μlLV-MRTF-A。脑室注射4天后，实验组与模型组分别构建缺血再灌注模型（MCAO2h/R24h），用Real-timePCR检测脑皮层中MRTF

5、-A、caspase3及Mcl-1mRNA表达；用Westernblot检测脑皮层中MRTF-A、CC3及Mcl-1蛋白表达；用免疫荧光法检测脑皮层细胞色素C、Apaf-1、CC3、Mcl-1表达。I结果：1、LV-MRTF-A在大鼠脑皮层感染剂量研究发现：大鼠脑室注射不同剂量LV-MRTF-A5d后，1μl和2μl组MRTF-A表达较低，与2μl组对比，4μl和5μl组MRTF-A表达明显增加，且两组表达无差异；LV-MRTF-A在大鼠脑皮层中分布研究发现：大鼠脑室注射4μlLV-MRTF-A5d后，MRTF-A在

6、脑皮层中广泛表达，以注射点及其四周表达最高，注射点远端表达量逐渐下降；LV-MRTF-A在大鼠脑皮层中感染时间研究发现：大鼠脑室注射4μlLV-MRTF-A后，1d、3d有少量MRTF-A表达，5d、7dMRTF-A表达相比3d呈明显上升趋势，9d表达量相比7d降低。2、MRTF-A对大鼠脑缺血再灌注诱导的神经细胞凋亡的影响研究发现：模型组神经功能评分及脑梗死体积与对照组相比有显著性差异（P＜0.01），实验组神经功能评分及脑梗死体积与模型组的同一再灌注时间点组比较，均显著减少，具有统计学差异（P＜0.05或P＜0.

7、01）；TUNEL法检测神经细胞凋亡率表明，与对照组比较，模型组凋亡率明显增加（P＜0.05或P＜0.01），且随着再灌注时间延长，凋亡率呈逐渐下降趋势。实验组与模型组的同一再灌注时间点对比，细胞凋亡率均显著下降，且具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。3、MRTF-A抗大鼠脑缺血再灌注诱导凋亡的机制研究发现：大鼠脑室注射4μlLV-MRTF-A后，大鼠脑皮层中MRTF-AmRNA及蛋白表达显著上升。Real-timePCR结果显示，与对照组比较，模型组caspase-3mRNA表达明显增加，Mcl-1mRN

8、A表达明显下降（P＜0.01）。与模型组对比，实验组caspase-3mRNA表达明显下降，Mcl-1mRNA表达明显增加（P＜0.01）。Westernblot结果显示，与对照组比较，模型组CC3蛋白表达明显增加，Mcl-1蛋白表达明显下降（P＜0.01）。与模型组对比，实验组CC3蛋白表达明显下降，Mcl-1蛋白表达明显增加（P＜0.01）