人骨髓间充质干细胞转分化为汗腺样细胞的dna甲基化调控机制

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1、分类号：R644学校代码：10062密级：学号：2012602500硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：人骨髓间充质干细胞转分化为汗腺样细胞的DNA甲基化调控机制TITLEThemechanismofDNAmethylationduringtheinductionofsweatglandlikecellsfromhumanbonemarrow-msenchymalstemcells一级学科：临床医学二级学科：外科学烧伤学论文作者：赵换军指导教师：付小兵天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类号：R64

2、4学校代码：10062密级：学号：2012602500学位类别：科学学位√专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：人骨髓间充质干细胞转分化为汗腺样细胞的DNA甲基化调控机制TITLEThemechanismofDNAmethylationduringtheinductionofsweatglandlikecellsfromhumanbonemarrow-mesenchymalstemcells一级学科：临床医学二级学科：外科学烧伤学论文作者：赵换军指导教师：付小兵导师组成员：张翠

3、萍天津医科大学研究生院二〇一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存

4、、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的:(1)优化人外分泌汗腺细胞（sweatglandcells，SGCs）的分离方法，以高效地获取原代汗腺细胞。(2)建立体外诱导人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）向汗腺样细胞分化的共培养体系，并观察诱导后细胞形态、表型和相关基因表达的改变。(3)探讨DNA甲基化在BM-MSCs向汗

5、腺样细胞转分化过程中的调控作用，并寻找甲基化调控的靶点基因。方法：（1）取新鲜的全皮层组织，剪成小块微粒，分别用不同的方法（胰酶+胶原酶，单纯胰酶，单纯胶原酶）消化分离汗腺，观察消化过程中出现游离汗腺的时间；微量移液器挑取游离汗腺，进行体外培养，观察细胞的贴壁情况和生长状态；9天后，流式细胞仪检测存活下来的细胞的增殖能力，并利用免疫细胞化学检测汗腺细胞的表面抗原CK7和CEA的表达状况。（2）购买骨髓间充质干细胞系，体外培养、扩增，并进行细胞的成脂肪、成骨细胞分化能力的鉴定；选取第三代的BM-MSCs与热休克后汗腺细胞（47

6、℃）进行Transwell+诱导因子的共培养，分别于第3、6、9天观察细胞形态学的变化，设置汗腺细胞为阳性对照组。细胞免疫荧光技术检测细胞汗腺表面抗原CK7和CEA的表达，RT-PCR和Westernblot分别检测CK7、CEA在mRNA水平和蛋白水平的表达变化。（3）采用Illumina450K甲基化芯片检测转分化前后细胞的甲基化水平的变化，筛选甲基化差异性基因，随后对差异基因进行生物信息学分析（差异位点筛选、聚类层次分析、GeneOntology、KEGGPathway分析、生物学功能注释、蛋白-蛋白相互作用）；结合预

7、实验结果和相关文献，对若干候选基因(HDAC4、PAX6、MMP1、EDA等)，用甲基化特异性PCR(MethylationSpecificPCR，MSP)进行初步验证，然后通过MassArray飞行质谱技术对特定基因位点进行重点分析；最后，构建特定基因的重组质粒，体外转染BM-MSCs，观察I天津医科大学硕士学位论文质粒转染后细胞表型和相关基因的表达情况。结果：（1）酶联合消化法(A组)在2h时，镜下可见较多游离的汗腺细胞；胰蛋白酶-EDTA法（C组）获取的细胞贴壁很差；胶原酶法（B组）在6h左右时，才有较多的游离汗腺出现

8、。A组和B组获取后的汗腺细胞贴壁良好，生长增殖正常,流式检测结果显示：A组和B组细胞的增殖指数分别为(18±4)%和(17±6)%，无统计学差异。免疫细胞化学表型鉴定结果显示：酶联合消化组和胶原酶组获取的细胞CEA、CK7阳性率未见明显差异。（2）通过多向分化潜能实验，我们证实BM-MSC