人骨髓间充质干细胞诱导分化为rpe样细胞的探讨

《人骨髓间充质干细胞诱导分化为rpe样细胞的探讨》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、人骨髓间充质干细胞诱导分化为RPE样细胞的探讨［摘要］目的：探索骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外定向分化成视网膜色素上皮（RPE）样细胞所需的微环境。方法：采用淋巴细胞分离液梯度离心法分离纯化BMSCs,第一阶段将培养第3代的细胞以bFGF、EGF及BDNF三种因子首先进行向神经前体细胞诱导分化，应用免疫细胞化学检测诱导细胞巢蛋白表达情况，当巢蛋白阳性表达率达到最高时去除诱导因子，进行第二阶段与第三代人RPE细胞共培养诱导2w，两阶段诱导后均采用免疫细胞化学及RT-PCR方法检测角蛋白及RPE65蛋白表达情况。结果：免疫细胞化学检测方面，诱导第3d开始能检测到巢蛋白表达，第12d阳性

2、表达率达到最高，达（86.9±2.6）%，第一阶段诱导后见角蛋白表达，未见RPE65蛋白表达，第二阶段诱导后见角蛋白表达，阳性率为（60.8±3.1）%，见RPE65蛋白表达，阳性率为（25.7±3.8>%。RT-PCR检测方面，两阶段角蛋白与RPE65蛋白结果与免疫细胞化学检测结果一致。结论:体外采用分阶段诱导法，应用因子bFGF、EGF、BDNF及与RPE细胞共培养的微环境作用下能在体外诱导BMSCs表达RPE细胞标志物角蛋白以及RPE65蛋白。［关键词］骨髓间充质干细胞分化视网膜色素上皮细胞共培养视网膜色素上皮(RetinalPigmentEpithelium,RPE)细胞组织学

3、上来源于神经外胚层，具有重要的生理功能，但是视网膜色素上皮细胞无再生能力，因而，当其功能障碍时会导致严重的遗传性、变性性视网膜病变，如视网膜色素变性等，目前通过药物和手术均不能阻止其进展、恶化。通过视网膜干细胞途径达到视网膜再生是一条希望之路，但是哺乳类动物视网膜干细胞成年后则很少具有活性，因此，外源性视网膜细胞移植可能是一个有希望的途径。可直接应用于移植的视网膜干细胞非常有限，组织工程学的兴起为外源性视网膜干细胞的产生带来了新的希望，骨髓间充质干细胞(BMSCs)是至今研宄最值得关注的成体干细胞，骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的多能成体干细胞，大量的实验证实体外不同的微环境对BMSC

4、s具有不同的诱导分化效果。BMSCs不仅能向中胚层的成骨细胞等分化，而且能跨胚层分化，如向内胚层的肝细胞样细胞以及外胚层的神经干细胞样细胞等分化。本实验探索诱导BMSCs向视网膜色素上皮细胞定向分化的微环境，现将研究结果报告如下。1材料与方法1.1材料DMEM-LG培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(Hyclone,USA)；bFGF、EGF、BDNF、PEDF(Peprotech,USA)；Taurine(Sigma,USA);淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；小鼠抗人巢蛋白单克隆抗体、小鼠抗人角蛋白8&18单克隆抗体、小鼠抗人RPE65单克隆抗体(NeoMarkers,

5、USA)；流式细胞术试剂小鼠抗人单抗CD34-FITC+小鼠抗人CD90-PE,小鼠抗人单抗CD34-FITC+小鼠抗人CD44-PE(Beckman-Coulter,USA),RT-PCR试剂盒(Fermentas,USA),transwell双层共培养系统(Corning,USA)。1.2方法1.2.1骨髓的采集、BMSCs的分离与培养骨髓取自健康成年捐赠者，实验符合国务院1994年颁布的《医疗机构管理条例》第33条原则。抽取骨髓约5mL,将骨髓用PBS稀释后以lOOOrpm离心5min,洗涤2次，将下层血浆用等量DMEM-LG培养基重悬后采用淋巴细胞分离液(相对密度为1.077k

6、g/L)密度梯度离心分离，轻轻吸取白色雾状单核细胞层，置于离心管中再次用PBS洗涤2遍，用含10%FBS的DMEM-LG培养基吹打分散后调整细胞密度为IX106/mL接种于25cm2塑料培养瓶中，置于37°C、5%CO2培养箱中培养。72h后予以首次換液，以后每3d换液1次。1.2.2BMSCs的形态学观察与细胞表面抗原的流式细胞仪检测倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态学变化及增殖情况，并拍照记录。按照谢茂松等[1]对骨髓间充质干细胞的流式细胞术鉴定方法步骤进行，第3代人BMSCs90%融合时用胰蛋白酶消化，用流式细胞仪检测BMSCsCD34（造血干细胞表面抗原），CD44（基质细

7、胞表面抗原）及CD90（干细胞表面抗原）的表达情况。1.2.3RPE细胞的采集、分离与培养RPE细胞取自福建医科大学附属第一医院眼科角膜移植术后的供体眼球，具体操作方法按照徐国兴等[2]提出的步骤进行，无菌条件下行眼杯消化法消化RPE层，将消化液中和后离心，用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬接种于培养瓶中，置于37°C>5%CO2培养箱中培养。72小时后开始首次半量换液，以后每3天换液一次，当细胞贴壁密度达80%时消化传代。1.2.