关于禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株基因组的研究

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1、内蒙古农业大学博士学位论文关于禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株基因组的研究姓名：刘丽华申请学位级别：博士专业：基础兽医学指导教师：马学恩;赵振华2003.6.1摘要y50747．5，禽脑脊髓炎病毒(AvianEneephalomyelitiSVirus，AEV)是一种小RNA镐毒。侵害鸡的中枢神经系统和其它实质性器官，该病毒通过口一粪途径传播，具有水平和垂直传播的能力．由于它极大的稳定性，被污染的区域可能长期保持传染性。鸡胚适应株VanRoekel是高度嗜神经的，并且在鸡的肠道内不能有效韵生长，而野毒株却是嗜肠道型的。尽管

2、这样，野毒株和VanRoekel株的病毒多肽具有一致的抗原性。幼鸡感染该病毒后，引超麻痹、头颈震颤甚至共济失调，而成鸡常呈亚临床感染或导致产蛋量和孵化率下降。病毒的感染性不受氯仿、．低pH、胃蛋白酶、胰酶和脱氧核糖核酸酶的影响，镁离子可增强病毒对热的稳定性．病毒的浮密度为1．319／ml，直径为22—30nm，该病毒主要在鸡胚中增殖。在大多数细胞培养物中不生长。1932年Jones首次报道了在1930年美国新英格兰地区幼鸡群爆发的禽脑脊髓炎。随后十年中，在欧洲、加拿大、日本和澳大利亚都有此病的报道。八十年代，该病传

3、入我国。AEV～直被认为是最重要的禽病病原之一，尽管它很重要，但有关其基础生物学。发病机理的了解却鞍少。本项研究，旨在利用分子生物学的技术手段。搞清楚AEV基因组的序列和结构，从而探讨基因结构与功能的关系。)本研究共分四个部分：第一部分为AEV的增殖．纯化和电镜观察，用1：5倍稀释的AEV-NH937株和阴性对照PSS分别经卵黄囊接种于6dSPF鸡胚，继续孵化lOd后，收集尿囊液。比较接种组和健康对照组鸡胚的大小，结果显示，健康对照组鸡胚明显大于接种组。分离、提纯AEV，把纯化的病毒在电镜下观察，证明确有大量AEV

4、病毒粒子存在，说明AEV在鸡胚中成功扩增：第二部分是AEV-NH937基因组的序列测定工作。根据Calnek疫苗株序列设计了9对引物，利用反转录聚合酶链式反应，成功地扩增了AEV—NH937毒株的全基因。把它们分段克隆在pDCm—T载体上．经序列分析．获得了AEV—NH937毒株的基因组全序列及推导的氨基酸序列，基因组全长为7055个核苷酸，与calnek疫苗株具有94．3％的同源性，编码一个含2134个氨基酸的多聚蛋白。这是国内首次对AEV基因组全序列的分析；第三部分：AEV外壳蛋白VP。基因在大肠杆菌中的融合表

5、达、纯化及活性研究。将VP，基因编码区的810bp片段插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒，然后转化大肠杆菌BL：。经IPTG诱导后，用聚丙稀酰氨凝’胶电泳分析。结果表明，表达产物为53KD的融合蛋白。经超声波裂解，用尿素溶解包涵体，电泳纯化后，利用ELISA检测VP．外壳蛋白．表明具有一定抗原性：第四部分：应用原位杂交检测AEV，用Dig标记的探针与5d、lOd、20d的攻毒鸡脑组织杂交，来检测AEV的RNA。结果显示，5d、lOd、20d的攻毒脑组织切片均有阳性杂交信号，阴性对照却没有杂交信号，该方法与其它

6、捡测方法具有良好的平行关系。1d关键词：禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株；反{嫌聚合酶链式反应；序列测定；禽脑脊髓灸靖毒外壳蛋白VP，；融合表达：活性碍皖：原位杂交／＼／、StudyonGenomeofInnerMongoliaStrainofAvianEncephalomyelitisVirusAbStractAvianencephalomyelitisvirus(AEV)isapicornaviruswithapredilectionforthecentralnervoussystemandotherparenchym

7、ousorgansofchickensthatistransmitedbytheoral-faecalroute．Thevirusmaybespreadbytheverticalandhorizontalroutes．andbecauseofitsgreatstability,contaminatedareasmayremaininfectiousforlongperiods．Theegg·adaptedVanRoekelstrainishighlyneurotropicanddoesnotgrowefficien

8、tlyintheenterictractofthechicken，andthefieldisolatesofAEVisusuallyenterotropie．Despitethis，thevirionpolypeptidesofbothnaturally—occurringstrainsandtheVanRoekelstrainareantigenicall