抗CD3单链抗体基因克隆表达及生物活性鉴定

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1、抗CD3单链抗体基因克隆表达及生物活性鉴定【关键词】单链抗体　　【关键词】CD3分子；单链抗体　　【Abstract】Thegenesencodingantibodyheavyandlightchainvariableregions(VHandVL)wereclonedbyRTPCRfromOKT3hybridomacells,whichproducedantiCD3moleclonalantibody.TheVHandVLgeneswerefusedandbecomeasinglechainFv(scFv).ThescFvgenewasclonedintopCANTAB5Evector

2、andexpressedonbacterialphagesurface.Bythreepanningrounds,wehaveobtainedtwosinglechainantibodysthatspecificforCD3.TheantiCD3scFvwillbeareagentfordiagnosisandtherapyofimmunodisorder　　1实验资料　　杂交瘤细胞OKT3来自ATCC.质粒pCANTAB5E，大肠杆菌TG1和HB2151，内切酶SfiI和NotI,可变区引物均购自Pharmacia公司.TaqDNA聚合酶，mRNA磁性分离试剂盒购自Promega公司.

3、以分泌抗CD3单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞OKT3为原始材料，采用Promega公司试剂盒，从大约107细胞中分离和纯化mRNA，合成cDNA第一链.通过RTPCR分别扩增出重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因.5为了加强抗体轻、重链可变区（Fv）的稳定性和更好地维持抗体分子内结合抗原区的空间构象，在VH和VL基因之间用一段编码(Gly4Ser)3的DNA序列把二者连接起来,构成抗体可变区单链融合基因.为了把单链抗体基因插入pCANTAB5E质粒，我们以单链抗体基因为模板，引入一对含SfiI和NotI酶切位点的引物，再次PCR扩增.扩增产物Mr约720，基因大小与预测的单链抗体基因相符

4、合（图1）.把单链抗体基因插入到表达载体pCANTAB5E所含的噬菌体外壳蛋白g3p基因中.转化大肠杆菌TG1感受态细胞后，在辅助噬菌体M13K07的作用下，单链抗体和外壳蛋白g3p以融合蛋白的形式表达于噬菌体的表面，形成一个抗CD3单链抗体文库.以外周血单核细胞为抗原，用ELISA方法鉴定噬菌体抗体的免疫活性.首先用细胞分离液分离外周血T细胞，然后包被在经多聚赖氨酸处理过的96孔酶联板上.分别与重组噬菌体抗体温育1h,用PBS淋洗3次后，加入HRP标记的抗M13噬菌体抗体温育1h,再用PBS淋洗3次，加入底物进行颜色反应.用酶标仪在490nm处检测每孔的吸收值.挑选阳性克隆，感染大肠杆

5、菌，获得培养上清，再进行免疫活性鉴定.经过三轮亲合－感染－扩增的免疫筛选过程，使CD3重组噬菌体抗体得到富极.随机挑选12个重组噬菌体抗体克隆进行ELISA检测.从中选出免疫活性最强的两株阳性克隆.把这两株阳性克隆的基因转入大肠杆菌HB2151，经IPTG诱导培养后，可在上清中收集可容性单链抗体.ELISA进一步证明该抗体能够特异识别外周血单核细胞和淋巴母细胞性白血病细胞，而不结合黑色素瘤细胞和人宫颈癌细胞(图2).说明单链抗体保留了原单克隆抗体的抗原特异性.　　1:15kb标准分子量；2:抗体VL基因PCR扩增产物；3：重组质粒经XbaI和BamHI双酶切，鉴定VL基因；4：抗体VH基

6、因PCR扩增产物；5：重组质粒经XhoⅠ和HindⅡ双酶切，鉴定VH基因.　　图1琼脂糖凝胶分析PCR产物和重组载体酶切产物鉴定（略）　　可溶性单链抗体结合外周血单核细胞（PBC）和淋巴母细胞性白血病细胞（MOLT4），但不结合黑色素瘤细胞（A375）和人宫颈癌细胞（Hela）.　　图2ELISA检测单链抗体免疫活性（略）　2讨论　　单链抗体被认为是具有抗原结合能力的最小功能单位［1］.它在某些应用方面比完整抗体具有更多的优越性，如免疫原性较小，组织渗透性好,在组织和血液中的清除率快，容易与其他功能分子重组，形成多功能抗体［2-4］.另外，单链抗体能够在原核系统中高效表达，有利于大批量生

7、产.CD3分子是T淋巴细胞膜上特有的重要信号分子之一［5，6］.抗CD3单链抗体与其他功能分子结合所形成的双功能抗体在免疫调节和肿瘤治疗方面以显示出良好的应用前景［7，8］.我们构建了抗CD3单链抗体基因，利用噬菌体展示技术表达单链抗体，通过免疫筛选，获得CD3特异基因工程抗体.该抗体为双功能抗体和重组免疫毒素的研制打下了基础.　　【参考文献】　　［１］KurokiM,ArakawaF,KharePD,KurokiM,LiaoS,M